全 文 ：　遗 传 学 报　Acta Genetica Sinica , April 2003 , 30 (4):345 ～ 349 ISSN 0379-4172
收稿日期:2002-09-23;修回日期:2002-11-27
基金项目:国家自然科学基金项目(39670417)[ Supported by the National Science Foundation of China(39670417)]
Inducing Chromosome Translocation and Deletious by Chinese
Spring-Agilops 2C Disomic Addition×Chinese
Spring-Elytriga 5E Disomic Addition
LI Ji-Lin ,XU Xiang-Ling ,XU Ping ,GUO Chang-Hong
(Harbin Normal University , Harbin　150080 , China)
Abstract:Crossing between two disomic addition lines , Chinese Spring-E.elongata and Chinese Sping with two gametocidal chro-
mosomes 2C(from Ae.cylindric), was carried out to investigate the function of gametocidal chromosome.After scrutinizing the
meiosis of pollen mother cells(PMCs)in F1 hybrids , several results were concluded:(1)In seven of the crossing combinations , the
number of univalents exceeded the expected and some trivalents and tetravalents appeared also in MI;lagging , breakage and bridge
of chromosomes were observed in anaphase and telophase;considerable micronuclei formed in telophase and tetrads.These were
mainly caused by the gametocidal chromosome 2C.(2)Chromosomes 6E and 7E were more susceptible to the effect of the gameto-
cidal chromosome 2C.(3)The gametocidal chromosome 2C functioned in prophase viz.the period of forming synaptonemal com-
plex.
Four F1 lines , 5-14 , 5-37 , 5-67 and 5-71 , were identified to be T5ES 4AST5EL 2BS , T5EL 3AS , T5ES 5BS translocation re-
spectively by using C-banding and genome in situ hybrydization(GISH)analysis.Deletion was deteced in line 5-17 (short arm of
chromosome 2A), 5-27(6B), 5-18(4B and 5B), 5-72(4A)and 5-4(4B)by C-banding analysis.The statistic data showed that
gametocidal chromosome could induce translocation with a high frequency of 5% and reacted on group B more efficiently than on
groups A and D since translocation involving chromosome 4A , 2B , 3A , 5B and deletion involving chromosome 6B , 5B , 4B , 4A 2A
according to Endo s work.
Key words:Chinese Spring;E.elongata;gametocidal chromosome;C-banding; in situ hybridization;translocation;de-
letion
利用中国春-山羊草 2C二体附加系与
中国春-偃麦草 5E二体附加系杂交
诱发染色体易位和缺失
李集临 , 徐香铃 , 徐　萍 , 郭长虹
(哈尔滨师范大学 , 哈尔滨　150080)
摘　要:通过对中国春-长穗偃麦草(E.elongata 2n=14 EE)二体附加系与中国春-柱穗山羊草(Ae.cylindrica 2n=28
CCDD)2C 二体附加系(杀配子染色体)杂交 F1 减数分裂的观察 , 看到 F1 单价体数超过理论数值 , 后期出现大量的
染 色体段片 ,认为这种异常现象与杀配子染色体的作用有关 。对 76 株中国春-长穗偃麦草 5E二体附加系与中国
春-柱穗山羊草 2C二体附加系杂交 、回交一代进行染色体 C-分带鉴定 , 初步认定株系 21-5-14 、21-5-37 、21-5-67 、21-5-
71 为中国春染色体与偃麦草 5E 染色体易位。经染色体组原位杂交(GISH)进一步确定 21-5-14 为 T5ES.4AS 易位
系 , 21-5-37 为 T5E.2BS 易位系 , 21-5-67 为 T5E.3AS 易位系 , 21-5-71 为 T5ES.5BS 易位系。 易位频率为 5.3%。株系
21-5-27、21-5-18 、21-5-18 、21-5-72 、21-5-4、21-5-71经染色体 C-分带鉴定 , 分别为 6B、4B、5B 、4A、4B 、2A缺失系。杀配子
染色体引起缺失频率为 6.5%。证明利用杀配子染色体诱导染色体易位和缺失的频率较高。杀配子染色体引起中
国春 B组染色体畸变大于 A、D组 ,与 Endo 观察结果相似。
关键词:中国春;长穗偃麦草;杀配子染色体;C-带;原位杂交;易位系缺失系
中图分类号:Q943　　　文献标识码:A　　　文章编号:0379-4172(2003)04-0345-05
　　Endo于 1979年发现柱穗山羊草(Ae .cylindrica
CCDD)C 组第 2同祖群染色体(2C)携带杀配子基因
(gametocidal)[ 1] 。将其与中国春小麦杂交 ,用中国春
小麦回交 、自交育成中国春-山羊草 2C 二体附加
系[ 2] 。
Endo用中国春小麦与中国春-离果山羊草(Ae.
triuncialis)3C附加系杂交 ,F1 用中国春做父本进行
轮回杂交 ,后代仍表现育性下降 。并在染色体组中
总是保留 1条来自离果山羊草的染色体。这条染色
体能够选择性地引起缺少这条染色体的配子不育 ,
并能优先传递 。因而被称为“杀配子染色体”[ 3 , 4] 。
杀配子染色体的作用 ,受普通小麦基因型背景影响 ,
如来自 Ae.triuncialis(UUCC)的杀配子染色体 3C ,在
中国春中杀配子作用是完全的 ,但在“Norin-26”或含
有“Norin-26”血统的普通小麦中 ,其杀配子作用部分
失活[ 4] 。来自 Ae.cylindrica 杀配子染色体 2C 在普
通小麦“Jones Fife”中 ,有很好的杀配子效应[ 5] 。而
在中国春中就没有这一效应。原因是普通小麦中有
的品种存在配偶子致死抑制基因 Igc1 ,中国春不携
带“ Igc1” [ 6] 。因此中国春-Ae.cylindrica(2C)单体附
加系有接近正常的结实率 ,并能诱导染色体结构畸
变[ 2] 。具有染色体畸变的配子受精后 ,能够产生具
缺失和易位等染色体畸变的后代[ 7] 。Endo[ 7] 认为小
麦某些染色体对杀配子染色体的作用更为敏感 ,如
7B频繁地被 Ae.speltoides的杀配子染色体(2S)诱导
发生畸变 。也就是说 ,一些染色体区域比较脆弱 ,易
受杀配子染色体作用引起断裂 。这样的“热点”区域
可能是对不同杀配子染色体是特定的。
Endo等利用 Ae.cylindrica 2C 制备出涵盖小麦
21条染色体两臂各区段的 436个缺失系 ,构建了普
通小麦缺失系统[ 8] 。Fang shi[ 9] 利用“2C”与小麦-大
麦二体附加系杂交 ,诱发染色体断裂 、重组 ,企图选
育大麦缺失系。Tsujimoto 和 Tsunewaki[ 10] 认为杀配
子染色体如能和隐性雄性不育基因紧密连锁 ,可用
以生产杂种小麦的种子。
本文的目的是探讨 Ae.cylindrica 杀配子染色体
2c诱导中国春-偃麦草 5E 染色体的易位和缺失频
率 。并试图选育 E 组染色体的易位系与缺失系。
这一工作对利用杀配子染色体诱发染色体易位和利
用 E组染色体 ,具有重要意义。
1　材料和方法
1.1　材　料
7个中国春(CS)-长穗偃麦草(E .elongata 2n=
14 EE)二体附加系 , 由以色列Weizmann科学研究所
Feldman教授提供 。中国春-柱穗山羊草(Ae.cylin-
drica 2n=28 CCDD)2C 二体附加系 ,由日本京都大学
Endo 教授提供 。
1.2　方　法
1.2.1　杂交方法
同常规 。
1.2.2　减数分裂的观察
按常规取材 ,固定 。席夫试剂或苏木精染色 ,
45%醋酸下压片 ,镜检 。
1.2.3　染色体C-分带处理
参照 Endo 法[ 11] 。液氮冷冻 10 min 后揭片 ,
47 ～ 48℃ 45%醋酸液(加两滴浓 HCl)处理 3 ～ 5
min。47 ～ 48℃的饱和 Ba(OH)2 中处理 5 min ,
0.056%CaCl2 溶液冲洗。47 ～ 48℃的 2×SSC 溶液
处理 5 min 。20 ml磷酸缓冲液加 Giemsa原液(SIG-
MA公司)0.15 ～ 0.18 ml 室温条件染色 12 ～ 15 h。
镜检。
1.2.4　原位杂交
(1)染色体组DNA提取:用CTAB法分别提取偃
麦草与中国春染色体组 DNA。分光光度计测量
DNA纯度与浓度。封闭用中国春染色体组 DNA ,高
压灭菌 5 min 变成小片段 DNA 。-20℃储存 。(2)
探针标记:取偃麦草 DNA 用 Biotin-16-dUTP 通过缺
口平移法(nick-translation)进行标记。 -20℃保存。
(3)染色体制片处理:在 60℃下烘 3 h。每张制片加
100μl RNase(100 μg ml SIGMA公司)在 37℃湿盒中
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处理 1 h。然后用 2×SSC 清洗 5 min ,在 40 ml的甲
酰胺 70℃变性2 min。后依次在冷 70%、85%、95%、
100%乙醇中脱水 ,气干。(4)原位杂交:每张染色体
制片加20 μl杂交液 ,(杂交液包含探针 DNA 30 ng 、
封阻 DNA 2.4 ng 、鲑精 DNA 2 μg 、2×SSC 、50%去离
子甲酰胺 。置于 95 ～ 100℃下处理 10 min ,立即置于
冰上冷却 5 ～ 10 min。滴加到经预处理的染色体制
片上)盖上塑料盖片 、封片 ,置 80℃下共变性 6 min。
将载片放入湿盒中 ,在 37℃下杂交过夜 。(5)检测
与观察:杂交后的漂洗 、荧光信号放大和检测参照
Fukui
[ 12] 的方法 。生物素标记的探针用 FITC-Avidin
进行检测 ,PI复染。FITC和 PI的荧光信号分别用 B
激发滤光片和 G 激发滤光片检测。用装配有超高
精度CCD照相机的荧光显微镜观察并将观察到的
信号输入计算机数字化进行图象模拟。
2　结　果
2.1　对 F1 减数分裂行为与花粉粒有丝分裂的观察
CS-5E二体附加系与 CS-山羊草 2C二体附加系
杂交 ,F1 染色体组型理论上应为 21Ⅱ+1 Ⅰ(5E)+1
Ⅰ(2C)。实际观察与论理数字有些偏差 ,检测 100
个细胞 ,单价体数每个细胞平均为 2.13个 ,变动在1
～ 4 间。多价体数(3 ～ 4价)每个细胞平均为 0 ,34
个。这两个数字均大于理论数值。在后期Ⅰ和后期
Ⅱ看到大量的染色体断片 、染色体桥 、染色体粘连 、
微核等异常现象 。推测是染色体断裂引起的 。因此
杀配子染色体的作用可能与减数分裂有关。对花粉
粒的两次有丝分裂进行观察 ,结果基本正常。
2.2　对杂种回交一代(B1C1)的 C-带与原位杂交检
测
　　为了观察杀配子染色体的作用 ,F1 用 CS-5E 二
体附加系回交 ,对回交一代 76株植株进行 C带与原
位杂交检测 ,结果获得 4株易位 、5株缺失。易位频
率为 5.3%、缺失频率为 6.5%,合计为 11.8%。易
位与缺失的株系如下 。
21-5-14:该株系 4A 的长臂带型正常 ,另一臂带
型似 5E的短臂 ,两臂之比明显大于 4A的臂比 。检
查其他染色体带型时发现缺少正常的 4A染色体 。
后经原位杂交(GISH)检测 ,确定该株系为小麦-长穗
偃麦草T5ES·4AS易位系 。(图 1 ,b)
21-5-37:该株系有 1条染色体的端部带型与 5E
长臂端部带型相似 ,另一臂与2B染色体长臂带型相
似 。检查其他染色体发现缺少 2B 染色体 。经原位
杂交检测(GISH)确定为 T5EL·2BS易位系(图 1 , c)。
21-5-67:该株系有 1条染色体与 3A的长臂带型
相似 ,另一臂与 5E 染色体长臂端部带型相似 ,检查
该株系其他染色体带型时发现缺少 3A 染色体 。C
带检测确定为T5EL.3AS 易位系 。
21-5-71:该株系有 1条染色体与 5B的长臂带型
相似 ,而短臂与 5E 的短臂带型相似 。两臂之比较
5B臂比大 ,检查该株系其他染色体缺少正常的 5B
染色体。经原位杂交(GISH)确定为 T5ES.5BS易位
系(图 1 , d)。在该株系中还发现一条染色体有缺
失 ,与 Endo 的“普通小麦染色体缺失系统图谱”对照
比较[ 13] ,认定为 2A染色体有缺失(图 1 , j)。
此外在 21-5-4 , 21-5-18 , 21-5-27 , 21-5-72 ,4 个株
系中均发现有缺失 。与 Endo的“普通小麦染色体缺
失系统图谱”对照比较 ,确定 21-5-4株系 4B短臂有
缺失(图 1 , i)。21-5-18株系 4B 短臂和长臂上各有
一缺失(图1 , f)。21-5-18株系 5B短臂端部有缺失
(图 1 , g)。21-5-27株系 6B 长臂和短臂上各有一缺
失(图 1 , e)。21-5-72株系 4A长臂近端部有缺失(图
1 ,h)。
2.3　对杂种回交一代的原位杂交(GISH)检测
标记探针(E染色体组 DNA)与经“CS”染色体组
DNA封阻的杂种回交一代植株 DNA杂交 ,只有E染
色体组 DNA产生较强的杂交信号 ,在G激发光下 PI
荧光呈现红色;在 B激发光下FITC荧光呈现绿色荧
光 ,绿色与红色复合显示黄绿色荧光 。对经染色体
C-分带鉴定尚未最后确定的 3个易位系 21-5-14 、21-
5-37 ,21-5-71经原位杂交检测认定均含有5E的染色
体片段(图 1 , a ～ d)。
3　讨　论
3.1　杂种 F1 减数分裂行为异常原因的探讨
杂种F1 减数分裂中期 Ⅰ的单价体数和多价数
多于理论数值 、后期 Ⅰ 、Ⅱ出现大量的染色体断片 、
桥 、染色体粘连 、微核等异常现象 ,我们认为与杀配
子染色体的作用有关 。杀配子染色体2C在中国春
的遗传背景下 , 作用不完全 ,不能使不带2C的配子
347　4 期 李集临等:利用中国春-山羊草 2C 二体附加系与中国春-偃麦草 5E 二体附加系杂交诱发染色体易位和缺失　
图 1　a:CS-5E二体附加系示 5E染色体;b:T5ES·4AS;c:T5EL·2BS;d:T5ES·5BS;e:6B(左)株系 21-5-27·6B缺失(右)箭头示断裂
点;f:4B(左)株系 21-5-18·4B缺失(右)箭头示断裂点;g:5B(左)株系 21-5-18·5B缺失(右)箭头示断裂点;h:4A(左)株系 21-5-72·4A
缺失(右)箭头示断裂点;i:4B(左)株系 21-5-4·4B缺失(右)箭头示断裂点;j:2A(左)株系 21-5-71·2A缺失(右)箭头示断裂点。
Fig.1　a:CS-5E disomic addition.show chromosom 5E;b:T5ES·4AS;c:T5EL·2BS;d:T5ES·5BS;e:(left)6B.(Right)lines 21-5-27 , 6B
Deletion;f:(left)4B.(Right)lines 21-5-18 , 4B Deletion;g:(left)5B.(Right)lines 21-5-18, 5B Deletion;h:(left)4A.(Right)lines 21-5-72,
4A Deletion;i:(lef t)4B.(Right)lines 21-5-4 , 4B Deletion;j:(left)2A.(Right)lines 21-5-71 , 2A Deletion.
348 遗　传　学　报 30 卷　
致死 ,而引起染色体断裂 ,由于染色体断裂与重建 ,
产生缺失 、易位等染色体畸变 。因此我们认为杀配
子染色体的作用时期 ,主要在孢子形成时期 ,而不是
在配子形成时期[ 14] 。
3.2　关于杀配子染色体诱发染色体畸变的频率
Endo
[ 15] 用中国春-黑麦 1R 1B 代换系与中国春-
3C附加系杂交 ,在 20” +1B +1R +3C 自交后代
中获得 12%的突变率(易位 10.4%、缺失 1.6%),在
20”+1R +3C自交与回交后代中获得 13%的突变
率(易位 10.9%、缺失 2.1%)Friebe[ 16] 用小麦-黑麦
附加系与 CS-2C 附加系杂交 , 在自交后代中获得
7%的突变率(易位 0.6%、缺失 4.6%、双着丝粒和
环状染色体1.8%)。我们用中国春-5E 二体附加系
×中国春-2C二体附加系在回交一代 76株植株中 ,
获得 11.8%的突变率(易位系 5.3%、缺失系
6.5%)。在已报道诱发染色体易位的方法中 ,辐射
诱发染色体易位的频率一般为 2%～ 3%。用染色
单体错分裂法诱发易位的频率 , 不超过 3%[ 17] ,因
此 ,利用杀配子染色体诱发染色体易位是目前最好
的方法。
3.3　杀配子染色体 2C诱发染色体易位的定向性
探讨
　　Endo[ 15] 用 Ae.triuncialis的杀配子染色体 3C ,诱
导小麦-黑麦 1R 1B 代换系染色体易位涉及到小麦
的染色体有 2A 、6A 、1B 、3B 、4B 、6B 、7B , B 组染色体
的易位频率明显高于 A 、D组。Endo 在统计 Ae.tri-
uncialis , Ae .cylindrica , Ae.speltoids(2)3 个带有杀配
子染色体(3C 、2C 、2S)诱发染色体畸变频率时 ,发现
B组染色体的缺失和断裂频率比 A 、D组高(也可能
因B组染色体容易鉴别)。Endo[ 7] 认为:小麦的一些
染色体好象比其他染色体对杀配子染色体更敏感 。
如6B 频繁地被 Ae.speltoids 诱导发生畸变。7B 频
繁地被 Ae.triuncialis诱导发生畸变 。这样的“热点”
区域可能对每个杀配子染色体都是特定的。本实验
观察到中国春-2C 二体附加系与中国春-5E 二体附
加系杂交回交一代染色体易位涉及小麦染色体有
4A 、5B 、2B 、3A。染色体缺失涉及 6B 、4B 、4A 、2A 、5B ,
引起的 B组畸变较多 ,与 Endo观察的结果相似。
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(责任编辑:周　素)
349　4 期 李集临等:利用中国春-山羊草 2C 二体附加系与中国春-偃麦草 5E 二体附加系杂交诱发染色体易位和缺失