全 文 ：　第 25卷 第 3期
2007年 8月 　　　　　　　
贵州师范大学学报(自然科学版)
JournalofGuizhouNormalUniversity(NaturalSciences)　　　　　　　　
Vol.25.No.3
Aug.2007
文章编号:1004— 5570(2007)03-0098-04
HPLC测定贵州产知母药材中菝葜皂苷元的含量＊
彭全材 1.2 ,胡继伟1 ,杨占南1 ,周秀玲 3 ,夏品华 1 ,黄先飞 1
(1.贵州师范大学 贵州省山地环境重点实验室 , 贵州 贵阳　550001;2.贵州师范大学 生物技术与工程学院 ,
贵州 贵阳　550001;3.江西宜春学院 化生学院 , 江西 宜春　336000)
摘要:实验采用乙醇超声提取样品 , HPLC梯度洗脱。菝葜皂苷的理论塔板数为 5628, 分离度为 1.42, 拖尾因子
为 1.01。回归方程为 Y=5×106X+610 06, r=0.999 0.在 0.4 ～ 2.0mg/mL之间的线性关系良好。日内和日间
精密度的 RSD均小于 2.0%, 重复性试验的 RSD为 0.6% (n= 5), 最低检测限为 1.0μg/mL, 加样回收率为
96.5%、94.3%、97.2%, RSD(n=5)分别为 2.7%、3.1%、 2.6%。
关 键 词:HPLC-ELSD;菝葜皂苷;知母药材
中图分类号:O657.7　　文献标识码:A
DeterminationofSarsasapogenininAnemarrhenaasphodeloidesBgefrom
Guizhoubyhigh-performanceliquidchromatography
PENGQuan-cai1, 2 , HUJi-wei1 , YANGZhan-nan1 , ZHOUXiu-ling3 ,
XIAPing-hua1 , HUANGXian-fei1
(1.GuizhouProvincialKeyLaboratoryforMountainEnvironment, Guiyang, Guizhou550001, China;
2.SchoolofBiologicalTechnologyandEngineering, GuizhouNormalUniversity, Guiyang, Guizhou550001, China
3.SchoolofBiologyandChemistry, YichunCollege, Yichun, Jiangxi336000, China)
Abstract:Themedicinalplantwasextractedwithethanolandtheextractionwasrepeatedforthree
times.ThetheoreticalplatenumberofastragalosideⅣ was5628, theresolution1.42andthetailing
factor1.01.Thecalibrationcurvewaslinearintherangeof0.4 ～ 2.0mg/mL, Y=5×106X +
610 06 , R =0.999 0.Theintra-dayandinter-dayprecisions(RSD)wereallessthan2.0%, the
RSDofrecurencewas0.6% (n=5).Thelimitofdetectionwas1.0μg/ml, therecovery96.5%,
94.3%, 97.2%, andRSD2.7%, 3.1%, 2.6% (n=5)respectivelyforSarsasapogenin.
Keywords:high-performanceliquidchromatographywithevaporativelight-scateringdetection;Sar-
sasapogenin;AnemarrhenaasphodeloidesBge
　　知母系双子叶植物药百合科植物知母
(AnemarhenaasphodeloidesBge.)的根茎 ,又名蒜瓣
子草 、连母 ,多年生草本 ,全株无毛 ,以秋季采者较
佳 。徐冬英 [ 1] 等研究表明知母具有抗衰老 、降低
缺氧性肺动脉高压以及对内分泌系统也有一定的
影响.人们大多取其根入药 ,其主根长 、圆柱形 、稍
带木质 。传统用于于外感热病 、高热烦渴 、肺热燥
咳 、骨蒸潮热 、内热消渴 、肠燥便秘等症的治疗 [ 2] ,
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＊ 收稿日期:2007-04-18
作者简介:彭全材(1983-), 男 ,江西人 , 在读硕士研究生 ,研究方向:植物化学研究。
通讯作者:胡继伟 ,男 , 安徽人 ,教授 , 研究方向:药用植物研究。
DOI :10.16614/j.cnki.issn1004-5570.2007.03.017
同时也被肾阴不足 ,虚火偏亢 ,盗汗 [ 3] .中药的始
祖神农氏 ,在他的创造性著作 《神农本草经 》中认
为 “清热泻火 、滋阴润燥 、利水消肿 、滋阴降火 ,润
燥滑肠之功效 ”,其指标成分为菝葜皂苷元 ,化学
机理也已经被证实[ 4 ～ 7] .杨茗等研究证明知母对维
A酸致小鼠骨质疏松症的具有防治作用[ 8] , .还有
研究表明知母对于脑缺血再灌注后引起的脑损伤
具有保护作用 [ 9] ,对衰老大鼠脑 N受体有上调作
用[ 10, 11] ,邓云等研究发现知母有效成分对血小板聚
集的具有抑制作用[ 12] .现代研究还表明知母有较好
的降血糖作用[ 13, 14] .我们运用 ChemDraw软件构建
了其分子结构(图 1)同时使用 Chem3D软件模拟了
其 3D构象(图 2),这样就有便于我们直观的了解其
最低能量 (energyminimum)时的分子构象。
　　中国药典 2005版第二部 HPLC-ELSD等梯度
洗脱测定菝葜皂苷 ,样品前处理要经过乙醇浸泡过
夜 —超声萃取—蒸干—在酸性条件下回流 —碱水
处理—萃取—蒸干 —定容等过程 ,方法复杂 、回收
率低 、而且重现性较差等。本文采用 HLPC-ELSD
梯度洗脱测定菝葜皂苷含量 ,简化了前处理步骤 ,
具有回收率和重现性高 ,精密度好等优点 ,同时也
证实贵州产知母芪中菝葜皂苷含量 ,对贵州产知母
药材的发展进行初步考证研究 。
1　仪器 、样品与试剂
1.1　仪器　岛津高效液相色谱仪:HPLC— 20AT;
20μl进样阀;Model300 ELSD;HW-2000色谱工
作站;药材粉碎机;瑞士 BUCHI旋转蒸发仪;Sim-
plicity185 personal超纯水器(美国 Mili2 pore公
司);色谱条件:迪马 C18色谱柱 (4.6 mm×250
mm, 5μm);美国 ELMAT660 /H超声波清洗器(功
率 360W,频率 35 kHz)。
1.2　试药　菝葜皂苷黄芪甲苷对照品购于中国药
品生物研究所;知母知母药材产于贵州各地(当地
农民送样)。高效液相色谱流动相组成为色谱纯
甲醇及超纯净水 。
2　对照品溶液和样品溶液制备
2.1　对照品溶液的配制
精密称取对照品 20.00mg置于 10mL量瓶中
加甲醇到刻度 ,摇匀即 2.00mg/mL的溶液。分别
取 4.0、3.0、2.0、1.0 mL,分别置于 5mL量瓶中加
甲醇到刻度既得 2.0、1.6、1.2、0.8、0.4mg/mL的
对照品溶液 。
2.2　样品溶液的配制
精密称定知母药材粗粉约 0.5g(过 40目筛 ,
40℃干燥至恒重)置锥形瓶中 ,加乙醇浸泡 ,超声
处理 15min,过滤 , 残渣连同滤纸再加乙醇超声处
理 15min,过滤 ,合并两次处理提取液用旋转蒸发
仪蒸干 ,残渣加盐酸溶液回流水解 ,将 pH调节到
7,用苯振摇提取两次 ,合并提取液并蒸干;残渣用
甲醇溶解并转移容量瓶中 , 稀释至刻度 ,摇匀 ,摇
匀 , 0.20μm滤膜过滤 ,取续滤液 ,上机备用。
3　色谱条件
3.1　色谱条件
流动相:A相甲醇 B相为水 ,梯度洗脱 。 B相
随时间变化:20%(0 ～ 3min), 20% ～ 0%(3 ～
10min线性), 0%(10 ～ 17min), 17min(stop);流速
1.0mL/min;柱温 40℃,进样 20ul。
3.2　蒸发光散射检测器条件
漂移管温度:60℃,载气 (空气)压力:35 psi,
放大系数(gain)为 9。
根据对照品的保留时间定性 、峰面积比计算菝
葜皂苷的含量。
4　方法与结果
4.1　色谱柱的选择
分别用 SymmetryC18色谱柱(3.9×150 mm,
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5μm)、shim-packC18色谱柱 (4.6 ×250 mm,
5μm)、迪马 C18色谱柱(4.6×300 mm, 5μm)进行
对照品和样品的测定 ,结果表明 ,上述 3种柱子峰
型都很好 ,但从分离效果和效率综合考虑 ,我们选
择了 shim-packC18色谱柱(4.6 ×250mm, 5μm)。
样品与对照品的分析图。
图 3　液相色谱图
Fig.3　liquidchromatograph
4.2　前处理方法及检测器的选择
曾采用乙醇对同一知母样品进行超声提取和
索式萃取处理 ,结果表明:乙醇作为提取溶剂超声
提取 ,提取率偏高 , 乙醇索式萃取提取液杂质少分
离效果较好 ,但考虑到超声提取也可以将菝葜皂苷
较好的分离且回收率高 ,操作简便 ,故选择:乙醇作
为提取溶剂超声提取 。
菝葜皂苷测定常用的检测器有紫外检测器和
示差折光检测器 。紫外检测器适用于带紫外吸收
特征基团的物质 ,如果没有紫外吸收 ,则需经衍生
化技术转化成有紫外特征吸收的物质 ,但这种操作
复杂 ,且准确度受衍生物的稳定性的影响大;示差
折光检测器是一种通用型检测器 , 要求恒温 、恒流
速 ,且无法采用梯度洗脱 ,其检测灵敏度也不够高 ,
所以对知母的分离效果自然就差了 。蒸发光散射
检测器(ELSD)作为一种新型通用型检测器 , 弥补
了 HPLC传统检测器的不足 ,特别是对无紫外或紫
外末端吸收的大分子有机化合物的检测 ,具有极大
的优越性。
4.3　线性关系考察
将不同浓度的对照品溶液依次进样 ,分别重复
3次 ,以对照品溶液浓度的自然对数为横坐标(x),
峰面积的自然对数为纵坐标(y)绘制标准曲线 ,计
算回归方程:y=5×106x+610 06, r=0.999 0,在
0.4 ～ 2.0mg/mL之间的线性关系良好 。
4.4　精密度试验与稳定性试验
以 2.0、1.2、0.4mg/mL的菝葜皂苷对照品溶
液 ,在 1d之内连续进样 5次 ,以及连续 5d分别进
样 ,根据所得峰面积分别计算日内精密度和日间精
密度。菝葜皂苷对照品溶液低 、中 、高 3个浓度的
日内精密度和日间精密度的 RSD分别为 1.5%、
1.0%、1.3%和 1.9%、1.1%、1.5% ,结果表明方
法的精密度良好 。
取第二批次知母药材的备用液 , 按色谱条件
进行测定 ,分别在 0、3、6、12、18、24、36和 48h测定
菝葜皂苷的峰面积 ,考察稳定性 , RSD为 0.6%。
4.5　回收率试验
精密称取样品二的粗粉 5份 ,各约 0.5g,分别
加入菝葜皂苷 1.0、0.5、0.1mg,甲醇定容到 10mL,
20微升进样测定 ,分别按 2.2条件制成样品溶液 ,
每份测定 3次 ,计算加样回收率 。知母药材中菝葜
皂苷三个水平的加样回收的结果分别为 96.5%、
94.3%、97.2%, RSD(n=5)分别为 2.7%、3.1%、
2.6%。
4.6　检测限考察
将菝葜皂苷对照品溶液进行稀释 ,以信噪比为
3∶1时 , 确定其最低检测限 , 其最低检测限为
1.0μg/mL。
4.7　贵州当地取样知母中菝葜皂苷的含量测定结
果(表 1)
　　我们也对其进行了数据统计处理如图(4),通
过统计图我们可以清晰的发现这次实验中所调查
的样品之间的差异性 。
5　讨论
5.1　本实验所建立的 HPLC-ELSD方法与目前常
用的菝葜皂苷含量测定方法相比 ,操作简便 ,不需
过层析柱 ,减少样品的前处理所带来的误差 ,提高
了分析的精确度 。
5.2　方法学考察结果显示该方法准确度高 、专属
性强 、灵敏度及稳定性均较好 ,测定方法可靠 ,测定
结果能客观反映黄芪甲苷的质量。实验结果对知
母药材 、菝葜皂苷原料及制剂的质量控制都有重要
的意义 ,可为菝葜皂苷质量标准的制订提供科学
依据 。
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　　　　　　　　　　　　　　　　　　贵州师范大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　第 25卷　
表 1　知母中菝葜皂苷的含量
Tab.1　ThemeasurementofSarsasapogenin
药　材 1 2 平均值 / 含量平均百分比
批　号 测定值 /(mg/mL) 测定值 /(mg/mL) (mg/mL) /%
样品 1 1.450 1.476 1.463 1.632
样品 2 1.421 1.429 1.425 1.589
样品 3 2.389 2.405 2.397 2.673
样品 4 1.923 1.901 1.912 2.132
样品 5 2.585 2.565 2.575 2.872
样品 6 1.171 1.201 1.186 1.321
样品 7 1.317 1.335 1.326 1.478
样品 8 1.749 1.711 1.730 1.928
样品 9 1.881 1.903 1.892 2.108
样品 10 1.095 1.121 1.108 1.237
图 4　样品含量比较统计图
Fig.4　TheSampleContentComparisonstatistics
5.3　从实验结果可以看出 ,贵州产知母含量有比
较小的差别 。按照 《中国药典 》(2005版)规定菝
葜皂苷的含量不得低于 1.0%的标准 , 10批次的
贵州知母药材的质量均符合要求。表明对贵州知
母原料如果严格的控制质量 ,从药材的采集 、贮藏
到原料的提取 ,都制定严格统一的标准 ,贵州知母
也将有很大发展 。
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