全 文 ：中国农业科学 2007,40(7):1331-1336
Scientia Agricultura Sinica

收稿日期：2006-05-24；接受日期：2006-09-30
基金项目：农业部“948”项目（2005-Z47）和“973”国家重大基础研究发展规划（2004CB117200）
作者简介：赵光耀（1971-），男，河北曲周人，副教授，博士研究生，研究方向为小麦功能基因组学。Tel：010-62132643；E-mail：gyzhao99@sina.com。
通讯作者贾继增（1945-），男，河南三门峡人，研究员，研究方向为作物基因组学与基因资源。Tel：010-62186623；Fax：010-62186623；
E-mail：jzjia@mail.caas.net.cn



粗山羊草（Ae.tauschii）幼苗和根全长 cDNA 文库构建
及其 EST 注释与比较分析
赵光耀，孔秀英，贾继增
（中国农业科学院作物科学研究所/农业部作物种质资源与生物技术重点开放实验室；国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程，北京 100081）

摘要：【目的】构建小麦 D基因组供体粗山羊草根和叶的全长 cDNA 文库，探讨利用生物信息学方法分析发掘
组织特异性表达基因的可行性。【方法】本研究利用 Cap-trapper 方法构建全长 cDNA 文库，利用高通量测序技术
获得大批高质量 EST 序列，在基于 Linux 系统的本地化生物信息学分析平台上对上述 EST 进行了电子注释分析。
【结果】成功构建了粗山羊草根和叶的全长 cDNA 文库，测序获得根 EST 序列 6 973 条和叶 EST 6 616 条。利用本
地化数据分析平台对其进行功能注释。利用 GO-Diff 软件，发现了两个文库间表达基因的功能差异，找到组织间
表达差异显著的基因和组织内特异性表达的基因。【结论】利用构建的全长 cDNA 测序获得大量 EST 序列，通过生
物信息学方法挖掘差异表达或特异性表达基因的方法是可行的。
关键词： 粗山羊草；表达序列标签；全长 cDNA 文库；功能注释；生物信息学

Full-length cDNA Libraries Construction from Ae. tauschii Root and
Shoot and EST Annotation and Comparative Analysis
ZHAO Guang-yao, KONG Xiu-ying, JIA Ji-zeng
(Key Laboratory of Crop Germplasm & Biotechnology, Ministry of Agriculture, Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of
Agricultural Sciences; The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Beijing 100081)

Abstract: 【Objective】 Two full-length cDNA libraries from Ae. tauschii shoot and root mRNA were constructed applying
Cap-trapper method. Two sets of EST data were generated and differentially expressed genes were detected and ananlyzed via a
bioinformatics program. 【Method】 The Cap-trapper method was optimized by reporter’s lab and a localized bioinformatics analysis
tool based on a Linux operation system was tested and applied. 【Result】Two high quality full-length cDNA libraries were
constructed successfully from Ae. tauschii cv. Y2282. 6 616 ESTs and 6 973 ESTs were obtained from the two libraries respectively.
EST function was annotated against public databases such as protein, nucleotide and Triticum and Aegilops EST databases from
GenBank etc. By using results from Gene Ontology catalogue obtained by software GoPipe2 and expression profile from Phrap
assembling, some differentially or specifically expressed ESTs were identified in the two libraries. The results give suggestion in
molecular basis of different plant organ functions performed.【Conclusion】The Cap-trapper method proved to be excellent in
full-length cDNA library construction from Ae. tauschii. EST analysis was also competent in searching for differentialy or
specifically expressed genes in various tissues or physiological states with further bioinformatics help.
Key words: Ae. tauschii; EST; Full-length cDNA library; Function annotation; Bioinformatics

0 引言
【研究意义】表达序列标签（expressed sequence
tags，ESTs） 是指对 cDNA的 3′或 5′端进行单向测序
得到的序列。经济和高效的特点已使其成为基因组研
究与寻找新基因的重要手段[1, 2]。目前，探索利用生物
1332 中 国 农 业 科 学 40卷
信息学方法对来自不同组织或者不同生理状态的
EST，特别是对来自全长 cDNA文库的 EST挖掘差异
表达或特异表达基因，对于理解作物重要性状的分子
基础和深度挖掘利用公用数据库都具有重要的意义。
【前人研究进展】表达序列标签的获得必须构建相应
的 cDNA文库。根据试验目的的不同,可以构建非均一
化 cDNA文库、均一化 cDNA文库或者差减 cDNA文
库。后两种方法虽然可以减少一些高表达序列的丰度,
发现更多的基因，但它们不能反映材料的基因表达水
平。依据构建过程中是否利用 5′帽子结构特征进行克
隆全长选择，可将 cDNA文库分为普通 cDNA文库和
全长 cDNA文库。通常，如果仅仅为了获得 EST序列，
构建普通 cDNA文库即可，但如果要获得重要基因的
全长 cDNA，则尚需通过 RACE技术来进行，从而无
法进行批量操作。为了提高 cDNA文库中克隆包含的
信息量，提高文库后期利用效率，可以构建全长 cDNA
文库。对全长 cDNA文库测序可获得大量 EST，用于
研究基因表达谱。在需要时将重要EST所在克隆测序，
可以提供更多有用信息。随着测序技术的发展以及测
序成本的降低，公用数据库中 EST数据的急剧增加。
基因表达研究可以利用数字化分析方法来实现[3, 4]，即
从能够代表相应组织或器官基因表达情况的 cDNA文
库中获得大量 EST，经过软件聚类拼接后依据代表基
因的 EST及其出现频率的信息进行基因表达分析。同
样原理，也可以利用代表基因 3′端表达信息的 SAGE
标签或近来出现的代表基因 5′端信息的CAGE标签来
进行。有学者把这种基于表达标签的基因表达水平定
量分析方法称为数字化方法（“digital”method）或
者数字化 Northern （digital Northern），而将传统的
与 cDNA克隆阵列和 Oligo芯片杂交分析称为模拟方
法（“analog”method）。【本研究切入点】小麦是
最重要的粮食作物之一，也是研究异源多倍体的重要
模式物种。开展小麦基因组学和功能基因组学研究对
于小麦遗传学研究和加深对小麦的理解具有重要意
义。普通小麦是异源六倍体，含有 A、B和 D这 3个
基因组，其基因组庞大（1.6 ×1010bp），重复序列多
（＞75%），目前尚难以进行全基因组测序。因此利
用 EST 或全长 cDNA 是进行小麦基因组研究的重要
途径。同时，在研究小麦基因的结构、起源与演化等
问题时也常常把普通小麦（六倍体）与其二倍体祖先
种加以比较研究。为此，分别构建普通小麦及其含有
A或 B或D基因组的二倍体祖先种的普通全长 cDNA
文库，从中挖掘重要基因表达信息，不仅可以比较基
因在不同基因组之间表达情况，还可进一步理解在普
通小麦 3 个基因组中直系同源基因表达情况。截至
2006年 4月 16日，NCBI的 EST数据库中已经公布
626 857 条小麦 EST 可供利用[5]。笔者的前期工作以
普通小麦B基因组供体种拟斯卑尔脱山羊草（Aegilops
speltoides）为材料，建立了 Cap-trapper方法构建全长
cDNA 文库、高效测序和生物信息学分析平台[6]。本
试验构建了普通小麦 D 基因组供体种粗山羊草（Ae.
taushii）幼苗和根的全长 cDNA 文库，高效测序获得
大量 EST，利用笔者所在实验室搭建的基于 Linux系
统的生物信息学分析平台对其进行功能注释和组织间
基因表达差异分析。【拟解决的关键问题】构建目标
材料高质量全长 cDNA文库，搭建高效、易用和功能
全面的生物信息学分析平台是本实验的关键。
1 材料与方法
1.1 植物材料
粗山羊草（Aegilops taushii）Y2282 用 Hoagland
培养液在组培室培养，25 d后收获幼苗和根，液氮保
存，备用。
1.2 RNA 制备和全长 cDNA 文库构建
RNA提取采用异硫氰酸胍方法，mRNA提取采用
oligo（dT）纤维素法，参考分子克隆（第 3版）；全
长cDNA文库构建参考生物素标记的Cap-trapper法[7～9]，
并稍做改进。最后将目标全长 cDNA 片段定向插入
Stratagene公司生产的噬菌体载体 Uni-Zap XR，使用
Epicentre公司的包装蛋白进行包装获得非均一化全长
cDNA文库。
1.3 cDNA 的测序和质量控制
随机挑取 cDNA克隆，使用 384孔板进行培养和
菌种保存；使用 96孔板进行碱裂解法提取质粒 DNA；
使用 T7测序引物从 cDNA克隆的 3′端进行单次测序。
序列测定在 ABI3730XL（Applied Biosystems 公司）
DNA分析仪上进行，使用 BigDye® Terminator V3.1
Cycle Sequencing Kit。利用 Phred[10]程序进行序列碱基
识别和质量判定,质量标准为 Q20（99 %的可靠性）。
获得的 EST 序列经过 cross-match 去除载体序列
和大肠杆菌基因组序列的污染，使用笔者所在实验室
开发的 Perl程序去除接头序列并把有效序列在 100 bp
以下序列剔除，其余高质量序列参加序列组装。序列
组装使用 Phrap[11,12]程序，在 Dell 服务器上进行。组
装参数为程序的默认值。拼接后得到一致序列
（tentative consensus，TC），包括由多条 ESTs拼接
7期 赵光耀等：粗山羊草（Ae.tauschii）幼苗和根全长 cDNA文库构建及其 EST注释与比较分析 1333
成的跨叠群（contigs）及单一序列（singlets）。
1.4 EST 功能注释
首先，使用 Blast[13]程序对 NCBI的核酸和蛋白库
（http://ncbi.nih.niv.org/blast/db）进行本地化搜索，获
得注释信息，E值设为 1e-10。所用数据库版本为 2006
年 3月 30日。
EST 的 GO 注释使用 GoPipe2[14]进行，该软件将
EST对 UniProt蛋白库中 Swiss-Prot和 TrEMBL子库
进行 blastX 搜索，将最佳匹配（E 值＜1e-5）利用
GO/UniProt对照表进行 EST本地化批量 GO注释，获
得分子功能、生物过程和细胞组分三方面的注释信息。
Uniprot数据库版本为 2006年 3月 30日。
1.5 组织间基因表达差异分析
组织间表达谱差异使用软件 GO-Diff进行[15]。差
异性用 χ2检验进行评价。软件定义某个基因的校正表
达量为：校正表达量=测得的该基因表达量/对应文库
测序反应数。
两个组织间基因表达差异的显著性检验判断标准
为 P<0.01。
2 结果与分析
2.1 文库质量检测
包装后获得原始文库,滴度检测表明幼苗和根文
库容量分别为 5.0×106 pfu和 1.6×106 pfu，质粒酶切表
明平均插入片段大约为 1.5 kb，说明文库质量较高。
2.2 大批量 EST 序列的获得与组装
幼苗文库和根文库分别测序 7 347和 7 277个反
应，经 Phred、cross-match 和自编 Perl 程序处理去除
低质量序列后获得高质量 ESTs 6 616和 6 973条。测
序成功率分别为 90%和 95.8%。
将获得的 EST 使用本地化 blast 方法对 GenBank
中 626 857条小麦属和山羊草属 EST进行序列比对，
（E值为 1e-10）。结果表明幼苗文库 6 616条 EST中
690条为新的 EST，比例为 10.4%；而根文库 6 973条
EST中 1 793条为新的 EST，占 25.7%。说明根文库
中产生新的 EST比例较高。
经过 Phrap程序在默认参数下进行 EST拼接，幼
苗文库获得 3 130条代表性序列，其中跨叠群（contig）
和单条序列（singlet）分别为 1 278个和 1 852个；根
文库获得代表性序列 4 872条，包括 1 781个跨叠群和
3 090个单条序列。将来自两个文库的 13 589 条高质
量（Phred 20）序列经过组装获得 7 422个不重复基因。
2.3 GO（Gene Ontology）注释
使用 gopipe2软件对来自两个文库的 EST序列数
据进行 GO分类注释。
对从根文库中获得的 4 872条一致性代表序列，
进行 GO注释结果表明仅有 1 990条获得一条或一条
以上 GO术语，对应 GO术语 5 773个，包括分子功
能、生物过程和细胞组分 3个层次。对幼苗文库 3 130
条代表性序列 GO注释表明只有 1 400条获得注释，
共获得 3个层次水平的 GO注释 4 226条。GO注释上
的序列比例分别为 40.8%和 44.7%。
从 generic GOslim中提取分子功能类别，得到幼
苗和根的分子功能表达谱（图）。表明两种组织在表
达的分子功能类别上并没有明显区别。
2.4 BlastX 和 BlastN 注释结果
通过对 NCBI 蛋白库和核酸库进行本地化 blast
搜索获得对 EST的注释，比对时 E值设为 1e-10。来
自幼苗文库的 3 130条一致序列中的 1 891条在蛋白
库有最佳匹配，其余的比对核酸库获得 798 条注释,
总的注释比例为 85.9%。根文库 4 847条一致序列中
的 2 568条在蛋白库中有最佳匹配，另外的 1 237条
在核酸库中有最佳匹配，总的注释比例为 78.5%。说
明较大比例的序列通过生物信息学信息比对没有获
得任何注释信息。其中有一些可能是小麦特异基因序
列。如果想获得这些克隆的有关信息，可以运行蛋白
结构域（ domain）或基序（motif），比如运行
InterProScan。
2.5 基因组织特异性表达情况
使用 gopipe2软件对EST序列数据进行GO分类，
获得的两种组织在分子功能、生理过程和细胞组分 3
个层次分析中基因表达情况。GO注释分为 3个层次，
分别说明基因产物执行哪种分子功能、参与哪个生理
过程以及定位于哪个细胞部位。将上述 GO分类信息
结合序列 phrap 组装产生的基因表达谱信息，利用
Go-Diff软件，提取组织间表达差异经校正后仍在二倍
以上的基因功能用以挖掘组织特异性基因的表达信
息。结果表明，共有 259个分子功能类在两种组织间
表达差异在 2 倍以上（P<0.01），其中属于分子功能
102个、生理过程 126个，而细胞组分 31个。
根据 Gene Ontology 的基因注释结果，在“分子
功能”层次上有差异的 102个基因中，根中高表达的
基因共计 66个，其中 16个基因只在根中表达而地上
部分没有检测到表达，另外 36个在苗中高表达；注释
在“生物过程”层次上有差异的 126个基因中，根中
高表达的基因共计 71个，其中 11个基因只在根中表
1334 中 国 农 业 科 学 40卷
达而地上部分没有检测到表达，而 55 个在苗中高表
达；注释到“细胞组分”层次上有差异的 31个基因中，
根中高表达的基因共计 10个，其中 1个基因只在根中
表达而地上部分没有检测到表达，其余的 21个在苗中
高表达。
从全部的差异表达 GO术语注释结果很难了解要
比较的组织间整体差异状况，无法把握事物的全貌。
为此，Gene ontology国际组织从 GO术语中挑取一些
可以基本反映生物学问题的 GO注释组成 GOslim。从
GOslim 条目中有差异的分析来看，两种组织在连接
酶、酶调节、翻译调节、解旋酶及结构分子活性等方
面都有显著差异（P＜0.01）。其中，根组织中连接酶、
马达和酶调节方面表达量较高。而地上部分在蛋白转
运、翻译调节以及解旋酶活性方面较高。从 Gene
Ontology 的生物过程分类来看，根中在氨基酸代谢和
细胞移动等生物过程的表达比较丰富，而幼苗地上部
分发育基因表达活跃。从“细胞组分”分类上看,两种
组织的表达差异较小，仅在胞外组分等细胞成分有差
异，如 extracellular region、 external encapsulating
structure、extracellular space等 GO术语方面。
对根中高表达基因进行进一步功能分析，发现
下面 16个基因只在根中检测到表达。这些基因分别
是 4-香豆酸辅酶A接合酶（4-coumarate-CoA ligase）、
酸硫醇连接酶（acid-thiol ligase）、腺苷高半胱氨酸
酶（adenosylhomocysteinase）、β-葡糖苷酶（beta-
glucosidase0）、纤维素酶（cellulase）、辅酶 A 连
接酶（CoA-ligase）、 γ-谷氨酰转移酶（ gamma-
glutamyltransferase）、谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移
酶 [glutamine-fructose-6-phosphate transaminase
（isomerizing）]、醚水解酶（hydrolase activity，acting



1：载体活性；2：受体活性；3：结合活性；4：转移酶活性；5：催化活性；6：核酸结合活性；7：信号转导活性；8：蛋白结合活性；9：连接酶活
性；10：电子转运活性；11：马达活性；12异构酶活性；13：转录调节活性；14：氧化还原酶活性；15：离子转运活性；16：蛋白转运活性；17：
激酶活性；18：酶调节活性；19：翻译调节活性；20：通道转运活性；21：转运活性；22：解旋酶活性；23：水解酶活性；24：结构分子活性；25：
抗氧化活性；26：分子功能未知；27：裂解酶活性
1: Carrier activity; 2: Receptor activity; 3: Binding; 4: Transferase activity; 5: Catalytic activity; 6: Nucleic acid binding; 7: Signal transducer activity; 8:
Protein binding; 9: Ligase activity; 10: Electron transporter activity; 11: Motor activity; 12: Isomerase activity; 13: Transcription regulator activity; 14:
Oxidoreductase activity; 15: Ion transporter activity; 16: Protein transporter activity; 17: Kinase activity; 18: Enzyme regulator activity; 19: Translation
regulator activity; 20: Channel or pore class transporter activity; 21: Transporter activity; 22: Helicase activity; 23: Hydrolase activity; 24: Structural molecule
activity; 25: Antioxidant activity; 26: Molecular function unknown; 27: Lyase activity

图 幼苗和根分子功能表达谱比较
Fig. Expression profiles of genes from shoot and root
7期 赵光耀等：粗山羊草（Ae.tauschii）幼苗和根全长 cDNA文库构建及其 EST注释与比较分析 1335
on ether bonds）、分子内氧化还原酶（催化分子内酮
式-乙醇式转换）（intramolecular oxidoreductase，
interconverting keto- and enol-groups）、分子内氧化
还原酶（置换二硫键）（intramolecular oxidoreductase
activity， transposing S-S bonds）烟酰胺合成酶
（nicotianamine synthase）、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶
（phosphogluconate dehydrogenase decarboxylating）、
脯氨酸脱氢酶（proline dehydrogenase）、蛋白二硫
异构酶（protein disulfide isomerase）和三烷基磺酰
脱氢酶（trialkylsulfonium hydrolase）。
对幼苗中高表达的基因分析表明地上部分表达高
的基因有36个，其中7个基因仅在幼苗中检测到表达，
这些基因分别是氧化还原酶（oxidoreductase）、碳酸
盐脱水酶（carbonate dehydratase）、镁原卟啉 IX单甲
酯环化酶（magnesium-protoporphyrin IX monomethyl
ester（oxidative）cyclase）、原叶绿素酸酯还原酶
（protochlorophyllide reductase）、丝氨酸酯酶（serine
esterase）、羧酸酯酶（carboxylesterase）、甘油醛 3 磷
酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）
等，主要是些氧化还原酶、裂解酶和水解酶。
2.6 基因组织特异性表达的电子验证
为了验证利用生物信息学方法获得的组织间差异
表达或者特异表达基因的可靠性，笔者利用 GenBank
中大量公共 EST数据进行了验证。试验获得根特异性
表达基因 16 个，对应于 10 条序列，使用 Blast 程序
搜索来自叶子的 31 820条 EST时，发现 8条为特异表
达基因；同样，将试验获得的 6条叶子特异性表达基
因与来自公共数据库中根的 41 157条 EST进行 Blast
比对，发现 5条为特异性表达。
检验结果说明利用生物信息学方法获得的分析结
果在参与分析的数据集的范围内是正确的。将这些结
果外推并非完全正确，而仅仅为笔者提供了有用的线
索，将目标基因的候选范围大大缩小。
3 讨论
高等生物生长发育的一个基本特征是分化为明显
不同的组织和细胞类型,这种组织和细胞的依次分化
与某种类型的基因的表达或其转录本的积累高度相
关[3]。传统的分析基因表达的方法，比如 Northern 杂
交等可以用来同时进行分析的转录本数量有限。
本研究以小麦D基因组供体种粗山羊草根和幼苗
（地上部分）为试材，分别构建了全长 cDNA文库并
经高通量测序获得大批量 EST，基于数字化 Northern
思想，利用生物信息学软件[15,16]进行了分析。分析和
了解基于表达的 EST的 GO注释信息，挖掘不同组织
或发育阶段的分子功能差异，将有利于阐明基因差异
表达的分子基础。GO-Diff软件正是用于深度发掘EST
差异表达的分析软件。通过软件分析找到了在两个文
库中的表达差异达到显著水平的基因功能类别，有些
功能是组织特异性的，仅在特定组织中出现。
与根相比较，仅在幼苗中高表达的 7个分子功能
中有 3个基因是与光合作用相关的基因，分别是镁原
卟啉 IX单甲酯环化酶（magnesium-protoporphyrin IX
monomethyl ester（oxidative） cyclases）、原叶绿素
酸酯还原酶（protochlorophyllide reductase）和甘油醛
-3- 磷 酸 脱 氢 酶 （ glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase）。这些与绿色植物地上部分所行使的
功能是相一致的。另外的一些特异表达基因为某些氧
化还原酶、裂解酶或者水解酶。
相比较而言，仅在根中检测到表达的基因较多，
为 16个。这些基因有的作用于植物次生代谢途径，如
苯丙烷类代谢途径中的 4-香豆酸辅酶 A 接合酶
（4-coumarate-CoA ligase）、酸硫醇连接酶（acid-thiol
ligase）、辅酶 A连接酶（CoA-ligase）等。而纤维素
酶（cellulase）也有在拟南芥根冠中特异表达的报
道 [16]。文献表明在植物根中烟酰胺合成酶
（nicotianamine synthase）是缺铁胁迫条件下铁吸收的
重要酶之一。禾本科的单子叶植物对土壤中三价铁的
吸收为机制 II，即三价铁与麦根酸类植物高铁载体结
合后在专一的转运蛋白作用下转入胞质内。上述烟酰
胺合成酶（nicotianamine synthase）即是麦根酸类植物
高铁载体形成过程中的关键酶[17～21]。腺苷高半胱氨酸
酶（adenosyl homocysteinase）被认为是植物核苷酸合
成挽救途径中的重要酶，参与核苷酸的转运[22]。文献
报道拟南芥中核酸转运蛋白基因 AtENT1在根、叶、
花序轴和花中都有较高的表达，说明核苷酸合成的挽
救途径在植物的各个器官中均有普遍存在[23]。但与本
研究相同功能基因在根中特异表达不一致。分析原因
可能生物信息学注释严谨度设置不十分合适，致使部
分基因功能注释不够准确。这也说明生物信息学分析
可以为我们提供有效信息、缩小探求目标的范围，但
并不能代替具体的生物学实验。但对 cDNA文库间序
列数据差异的生物信息学分析是对 cDNA文库有效利
用的有益尝试，分析结果将为挖掘组织间差异表达信
息从而为阐明控制农作物重要农艺性状的分子机制提
供信息。
1336 中 国 农 业 科 学 40卷
4 结论
通过构建粗山羊草幼苗和根的全长 cDNA文库并
大批量测序各获得 7 000条以上 EST序列，利用生物
信息学方法和公共数据库资源对其进行了多层次注
释，获得可供利用的数据集；利用专门的软件挖掘出
了不同文库中表达差异在二倍以上的基因，特别是获
得一批文库（组织）高表达的基因与组织特异表达的
侯选基因，为全长 cDNA的有效利用开辟了新途径。

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