全 文 ：遗 传 学 报 , 2 6 (5 ) : 546一 5 5 1 , 19 99
月e 匆 G 亡n e价 a `负抽ic a
利用荧光原位杂交技术检测导入
普通小麦的大赖草染色质
刘文轩① 陈佩度 刘大钧
(南京农业大学细胞遗传研究所 南京 2 1 00 9 5)
摘要 利用以大赖草基因组 D N A 为探针的荧光原位杂交技术对导入普通小麦的大赖草染色
质进行检测 , 结果 : ( l) 根尖体细胞或花粉母细胞时期均可用于检测大赖草染色质 。 间期核中
杂交信号点数与所含大赖草染色体数目之间的对应关系依染色体显强 -C 带末端数不同而不
同 ; (2 )利用荧光原位杂交 , 从普通小麦一大赖草单体异附加系的减数分裂前植株 60 C于 y 射线
辐射后代中检测到一批大赖草端着丝粒染色体和小麦一大赖草染色体易位等结构变异 ; (3) 用
基因组原位杂交检测导人小麦的大赖草染色质时加或不加封阻 D N A 对原位杂交结果无太大
影响。
关健词 小麦 , 大赖草 , 染色体易位 , 端体 , 荧光原位杂交
分类号 0 34 3
D N A 分子 原位杂交技术 ( in is ut hy b ir id az it on )是本世纪 60 年代末 出现 的一种将
D N A 序列或基因直接定位在染色体上的技术 。 该技术 目前广泛应用于 D N A 重复序列或
多拷 贝基 因家族的染色体定位 、 分子核型构建 、 染色体识别以及结构分析 、 外源染色质检
测 、 异源多倍体物种进化等研究 。
用荧光检测系 统检 测杂交信号的原位杂交称 为荧光原位杂交 (n uo er s c e nt l’n is ut
hy ibr id
z
iat on
,
lF s )H
, 荧光原位杂交探针 D N A 可以用单拷贝或寡拷贝序列【,一 2] 、 物种专化
D N A 重复序列 l3] 或基 因组 D N A 〔4] 。 以基 因组 D N A 为探针的原位杂交即基 因组原位杂交
( ge n~
。 in : iut h y b ir id z iat o n
,
GI S H )
。 基因组原位杂交巧妙地利用各染色体组 D N A 同
源性程度的差异 , 对某一染色体组或某个物种的染色体组 D N A 进行标记 , 同时用适量的
另一物种总 D N A 作封阻 , 以减少或消除探针 D N A 与非同源或部分 同源 D NA 的交叉杂
交 ,提高探针 D N A 与同源 D N A 的杂交机会 。 该技术已成功地被用于检测导人普通小麦
中的黑麦 [, 一 6〕、 大麦 [ ,〕 、 披碱草 [8〕、 堰麦草 19 ] 、 赖草 [4· ’ o ] 、 簇毛麦叫 、 冰草 [ , 2 1等物种的染色体或
染色体片段 。
本研究利用以基因组 D N A 为探针的荧光原位杂交技术 , 对小麦一大赖草附加单体减
数分裂前植株离子辐射处理后代中大赖草染色质进行检测 , 以期从中发现小麦一大赖草易
位染色体 , 并对外来染色体的结构变异进行研究 。
本文于 19 9 8{ 2一 24 收到 , 19 98 一 1于 2修回
本研究得到国家自然科学基金项 目 、 国家攻关项 目和美国cM K l l ig ih oF u l lda it o n作物研究计划项 目资助
①通讯地址 : 河南省农业科学院小麦所 ,郑州 4 50 0 02
5期 刘文轩等 :利用荧光原位杂交技术检测导人普通小麦的大赖草染色质 57 4
1材料和方法
1
.
1供试材料
小麦一大赖草r L .7染色体单体异附加系 9 3G 1 5、 9 3G 5 2、 9 3G 60减数分裂前植株 0 6c 二下
射线 ( 0 0 6一 1 1 5 2R )辐射处理后 自交后代 ;(小麦一大赖草Lr .1 4二体异附加系 9 5G 1 5 x小
麦一簇毛麦V 6/ sA 6L 易位系 )E, 普通小麦品种扬麦 5 号 、 中国春等 。 材料均由南京农业大
学细胞遗传所提供 。
1
.
2 实验方法
1
.
2
.
1 基 因组 D N A 提取与探针标记 取大赖草 、 簇毛麦 、 中国春新鲜嫩叶各 2一 g4 , 用
C T A B 法提取总 D N A l[ ’ 〕。 大赖草探针 D N A 用生物素通过缺刻平移法进行标记 。 中国春和
簇毛麦 D N A 分别高压灭菌 5而 n , 在旋涡器上打断成 20 一 30 bP 小片段 , 作封阻 D NA 用 。
1
.
.2 2 染色体制片 种子在垫有 2层湿润滤纸的培养皿内 23 ℃ 下发芽 , 露白后 4 ℃下处
理 24 h , 然后在 23 ℃恒温下生长 24 h 。 当根长 Ic m 左右时剪根 , 根尖在 O℃冰水中处理 24 h
后用卡诺 氏固定液 ( 3 份 95 % 乙醇 :l 份冰醋酸 )固定 。 固定 2 一 7 天的根尖用 45 % 醋酸压
片 , 相差显微镜下观察 。 染色体分散好的制片放 一 70 ℃下冰冻干燥 。 花粉母细胞固定及
制片同根尖方法 。
1
.
.2 3 荧光原位杂交
( l) 染色体变性 : 一 70 ℃下冰冻的染色体制片揭去盖片 , 在 70 % 、 95 % 和 10 % 乙醇
系列中各脱水 s m in , 气干 。 气干后的制片在用 2 x S S C 液稀释成 7 0% 浓度的甲酞胺中变
性 ( 7 0℃ , Zm i n ) 。 然后放人预冷至 一 2 0 aC 的 7 0% 、 9 5% 、 1 0 0% 乙醇中各脱水 5而 n 。 ( 2 ) 杂
交液变性 : 按每张制片 1 0川的用量配制杂交液 。 依次在一小离心管 内加人 :
用量 ( 5 张制片 ) 终浓度或用量
去离子甲酞胺 25 川 50 %
2 0 X S SC S尸1 2 X S S C
50 % 硫酸葡聚糖 10 尸 10 %
鲤鱼精 D N A ( l o m g /m l ) 2户1 2 5召g
探针 D N A ( l m g / m l ) 8召1 0 . 16“ g
配好 的杂交液混匀后在 80 一 95 ℃下水浴变性 10 m in , 然后冰浴 s m in 以上 。 ( 3) 杂交 : 经过
变性的制片上每张滴加 10川变性杂交液 , 盖 18m m x 18m m 盖玻片 。 然后放人垫有用 Z x
S S C 浸湿的滤纸的盒 内保湿 , 37 ℃下 杂交 h6 以上 。 (4) 漂洗 : 杂交过 的制片依次在 Z x
S S C (室温 , s m i n ) 、 2 x S S C ( 3 7 oC , 10 m i n ) 、 2 x S S C (室温 , s m i n ) 、 1 x P B S (室温 , 5而 n )漂
洗 , 以 洗 去 未 杂 交 上 的 探 针 D N A 。 ( 5) 杂 交 信 号 放 大 : 用 4 份 1 x P B S 和 1份
B SA ( l o m g / m l ) 的 混 合 液 将 兔 抗 生 物 素 抗 体 (ar b bi t an it 一 b i o it n a n it b o d y , E nz o
id 吧 n o s it e s )稀 释 10 0 一 2 0 0 倍 。 每张 制片加 该稀释 液 1 0 0尸1 , 盖 Zo m m x Zomnr 盖 玻片
。
3 7℃下反应 30 m in 。 然后用 1 x P B S 漂洗 3 次 (室温 , 每次 5而n) 。 (6) 杂交信号检测 : 将
连结 FI T C 的羊抗兔抗体 ( T IT C 一 e o nj u n e t e d g o a t a n it 一ar b b i t a n it b o d y , E nz o d i昭 n o s it e s )
用 4 份 1 x p B S和 l 份 l o m g / m l B s A 的混合液稀释 20 0 一 2 0 0倍 。 在漂洗过的每张片子上
加该稀释液 7 0一 10 0尸l , 盖 Zo m m 只 Z o m m 盖片 。 黑暗下 3 7 oC 反应 3 0m i n 。 然后在黑暗下
用 1 x PB S 冲洗 3 次 (每次 s m i n ) , 用 7 0% 、 9 5% 、 10 0% 乙 醇各脱水 s m i n , 气干 。 (7 ) 观察 、
5 48 遗 传 学 报6 2卷
照相: 气干后制片每 张加1 5 户 I用an i ta fe t稀释 的P l 液 (1 5 户 g/ m 一) , 盖 2 2m m x 2 2nmt 盖玻片 。 用荧光显微镜在 4 50 一 4 90 nm 波长光下观察 。 杂交信号呈黄绿色 , 未杂交染色体呈红
棕色 。 用 4 0 0 A SA 富士彩色胶卷照像 。
2 结果与分析
2
.
1 不 同类型细胞 的原位杂交结果
利用以基 因组 D N A 为探针的荧光原位杂交技术分别对根尖细胞和花粉母细胞进行
处理 , 结果证明处于任何细胞分裂周期的细胞都可以用来检测大赖草染色质 。 经原位杂
交后 , 处于细胞分裂间期 的大赖草染色质表现为黄绿色小亮点 ; 细胞分裂 中期的大赖草染
色体呈黄绿色 , 但染色体末端的杂交信号 比其他部分明显较强 (图版 工一 1 , 图版 工一 2) 。
分裂间期细胞核中黄绿色杂交信号的点数与该细胞所含大赖草染色数 目有一定对应
关系 , 可以根据间期细胞核中杂交信号点数初步推测有无外源染色体以及有几条外源染色
体 。 但这一种对应关系根据大赖草末端显强 C 带区的数 目不同而有所不同 。 含有 l 个显强
C 带末端的染色体 , 如大赖草 rL . 2 和 rL . 14 染色体 1 0] 的细胞 , 间期核黄绿色杂交信号点数
与所含大赖草染色体数 目之间是一对一的关系 , 即含 1条大赖草染色体的细胞在间期核只
有 1个杂交信号亮点 ; 而含有两个显强 C 带末端的染色体 , 如大赖草 rL . 7染色体 l[ ’〕的细胞 ,
间期核杂交信号点数与所含大赖草染色体数为二对一关系 , 即含 1条 rL . 7染色体的细胞在
间期核 内有 2个杂交信号点 。 因此 , 尽管图版 工一 1与图版 工一2所示的分裂间期细胞核均有
3 个黄绿色杂交信号亮点 , 但 图版 工一 1所示是含 1条完整 rL . 7 染色体和 l 个 rL . 7 端体的细
胞原位杂交的结果 , 而图版 工一2则是含 3 个 rL . 7 端体细胞原位杂交的结果 。
图版 I 一3所示是经过荧光原位杂交处理的普通小麦一大赖草单等臂异附加系 ( Z n =
43 ) PM C M 工 染色体 。 呈红棕色的是 由小麦染色体配成的二价体 。 添加的大赖草等臂染
色体呈黄绿色 ,而且两臂配对 , 形成环状单价体 。
2
.
2 利用荧光原位杂交检测到的大赖草染色体结构变异
利用以基因组 D N A 为探针的荧光原位杂交技术 , 对小麦一大赖草 rL . 7 染色体单体异附
加系减数分裂前中期 `OC -o 下射线辐射处理 自交后代进行检测 , 从中发现了以下 2 种大赖草
rL
.
7 染色体的结构变异类型 。 ( 1) 染色体从着丝粒处断裂形成端体 . 在检查的 349 株辐射
后代个体中 , 有 51 株含 rL . 7端体 , 占观察个体总数的 巧% 左右 。 这些个体细胞中添加大赖
草端着丝粒染色体的数目为 1一 3个 。 原位杂交处理后 , 端体在远离着丝粒的端部有明显较
强的杂交信号 (图版 工一 1 , 图版 工一2) 。 ( 2) 染色体易位 。 经过原位杂交处理后 ,小麦染色体
显红棕色 , 大赖草染色体呈黄绿色 , 染色体易位断点以及易位片段的大小清晰可见 。 本研究
利用荧光原位杂交 ,从小麦一大赖草单体异附加系辐射后代鉴定到 10 个含小麦一大赖草易位
染色体的单株 。 有的单株含有 由绝大部分大赖草染色体片段组成的顶端易位染色体 (图版
工礴 ) , 有的含有由一小段大赖草染色体组成的顶端易位染色体 (图版 工一 5 ) , 有的则含有由
大赖草和小麦染色体各 1条臂组成的着丝点融合易位染色体 (图版 工一 ) 。
目前 , 我们正利用染色体 O e m as C一分带以及 RF L P 技术鉴定这些易位所涉及的小麦
染色体及染色体臂 。
2
.
3 封阻 D N A 与探针 D N A 的合适 比例以及洗脱液对原位杂交的影响
利用基因组 D N A 为探针的原位杂交技术检测导人小麦的外源染色质时 , 探针 D N A
5期 刘文轩等 :利用荧光原位杂交技术检测导人普通小麦的大赖草染色质 5 4 9
与封阻 DNA的浓度 比是成败的关键之一 5 ][。 封阻 N DA用量或种类不合适时 , 会产生交叉
杂交现象 。 在利用以基因组 D N A 为探针 的荧光原位杂交检测普通小麦背景下的大赖草
染色质时 , 不加封阻 D N A 以及探针与封阻 D N A 的比例从 :1 10 一 40 对检测结果并无太
大影响 。 但封阻 D N A 用量过高时 , 杂交信号强度有所下降 。 因此 , 利用以基因组 D N A 为
探针的荧光原位杂交技术检测导人小麦的大赖草染色质时 , 可以少加或不加小麦 D N A 作
封阻 。 图版 I 一 7是用大赖草 D 叫A 作探针 , 加 10 0 倍探针 D N A 浓度 的小麦封阻 D N A 后对
(普通小麦一大赖草异附加系 x 小麦一簇毛麦 6 V S6/ A L易位系 ) F , PM C M l 染色体进行原
位杂交的结果 . 从图中可见 , 除大赖草染色体显黄绿色外 ,簇 毛麦 6 V 染色体短臂末端也
有一较弱的杂交信号 。 但加人一定量的簇毛麦 D N A 进行封阻后 , 6V S 的末端就不再出现
杂交信号 , 他人也有类似的报道 l[ 4〕. 因此 , 利用基因组原位杂交检测导人小麦的外源染色
质时 , 所用材料遗传背景中最好不涉及其他远缘物种 , 否则杂交结果的分析与结论就一定
要慎重行事 . 另外 , 我们分别用重蒸水 、 蒸馏水和 自来水配制了 SS C 和 P B S 洗脱液 , 用它
们洗脱原位杂交制片 。 结果用重蒸水配的 S S C 和 P B S 进行原位杂交制片洗脱后 , 原位杂
交制片背景 比较干净 , 杂交信号颜色与小麦染色体颜色反差好 ; 但用 自来水或蒸馏水配
BP S 和 S S C 洗脱液时 ,染色体原位杂交制片背景 比较脏 , 上面布满颗粒状小亮点 , 对原位
杂交信号 , 尤其是间期核中杂交信号的辨认有一定影响 . 因此 , 配制 P B S 和 S S C 洗脱液时
最好用纯净的重蒸水 。
3 讨论
原位杂交技术目前已成为植物远缘杂交中检测与追踪外源染色质的重要手段之一 〔 , 3 ]。
在小麦一亲缘物种异源易位系的筛选与鉴定方面 , 以基因组 D N A 为探针的原位杂交技术发
挥了很大作用 , 目前得到的易位系中绝大多数是利用基 因组原位杂交 , 并结合 G e m sa C es 分
带等其他技术鉴定出来的 l4[J 。 基 因组原位杂交灵敏度较高 , 可以在不同类型细胞以及各分
裂时期细胞中进行外源染色质的检测 。 用较好中期分裂相染色体进行原位杂交后 , 染色体
易位断点以及易位的外源染色体片段大小都能清晰地显示出来 。 本研究以大赖草基因组
D N A 为探针 , 利用原位杂交技术 , 从小麦一大赖草异附加系辐射后代中检测到小麦一大赖草
易位 、 大赖草染色体整臂缺失等结构变异 , 进一步证实了用原位杂交鉴定小麦一异源染色体
易位的有效性 。 但是 , 原位杂交在鉴定易位系方面也有局限性 , 主要表现在无法确定易位所
涉及到的染色体 。 另外 , 杂交程序 比较冗繁 , 需要时间亦较长 。 因此 , 对易位系的鉴定除利
用原位桑交技术外 , 还要借助染色体 。 e m s a c- 分带技术 「5] 以及用双端二体进行测交所获
后代 CT I的 PMC MI 的染色体配对分析 1 ’ 〕等手段来确定易位染色体的归属
。 最近发展起来
的原位杂交 /分带序续技术 8[, ” ]将原位杂交和分带结合在一个实验中 , 使得经过 1 次实验就
能分辨出易位断点的位置 、 易位片段的大小及所涉及的染色体 ; 用荧光生物素直接标记探
针的快速原位杂交 l[ “ ]把原位杂交所需时间由原来的 2 个工作 日缩短到 2一 h6 。 原位杂交的
这些新技术将会进一步提高其检测外源染色质的效率 。
参 考 文 献
1 J ian g J M
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.
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,
19 9 4
,
3 7: 7 1 5一 7 2 5
2 卜匕n s o n R E e t a l . lF u o re s e e n t nI s i t u h y b ir d 一z a it o n o f a b ac te ir al a irt if c al e l l r o m o s o m e . eG n o m e
,
19 9 5
,
3 8 :
50 遗 传 学 报 2 6卷
4 6 6一 1 6 5
3L 甲 ia n tN L Ve ta l
.
W ha ey - t re ta rn s l o ca t in o
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19 8 6
,
7 7 : 4 15一 4 19
4 S e h w arz ac he
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e in s iut 场b ir id z a it o n ot i d e n it fy al i e n e h or m o s o m e s an d c hr o m o s o m e
s e g m e n st in w he a L T h e o r
.
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.
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n e t , 19 92
,
8 4 : 7 7 8一 7 8 6
5 irF
e be B e r a l
.
N O l 1h o m oc o lo g o us w h e a -t 卿 e 仇 l I 1s lau o n s e o nfe irt n g re s i s ta l 1c e ot g re e n b u g
.
nE 曲y it c我 19 9 5 ,
84 : 12 1一 1 2 5
6 此 H T e r a l . eD te e it o n o f ry e D N A i n w he a-t ry e hy b ir d s an d w he a t t r a n s loc a it o n s以 k s us i n g ot atl
g e n o im
e D N A as a P r o be
.
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.
B io l 砒 P , 19 8 9, 7 : 1 50一 15 8
7 M uk
a i Y e z a l
.
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e it o n o f b a ir e y e h r 0 m iat n a d d e d ot w h e a t b y g e n o im
e ln s i tu h y b ir id z a it o n
. 任 n om e ,
19 9 1
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34 : 4 4 8一 4 52
8 J ian g J M e t a l
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S e q ue n it al c】l r o m os ome
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3 8 0一 3 8 6
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uE P h y it
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14 hZ
a n g X Y e t a l
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te ir z iat
o n o f g e nom
e s a n d c h r o m o s o m e s i n Partj al am P ih Pl
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1 5 〔越 X W e t a l . Id e n it if c a it o n o f a I B / I R w h e a -t ry e t ar ll s loc a it o n in tor g re s s io n s in t o w h e a L hT e o r
.
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.
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”
19 8 9
,
7 7: 8 1一 8 3
16 甩 ad e r 5 M e r a l . yC to l o g i c al a n al y s is o f lP an t e h r o m o s o m e s u s in g r a P id in 5 1匆 h y b ir d i z iat o n . E u P场 it e a,
19 9 6
,
8 9 : 12 1一 12 4
Ik t e c t i o n
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s i ut h y b ir d i z a it o n (R S功 u s i n g ib o it -n l a be ll e d g e n o而 e D N A as a P or be .
处 e e i v e d eF b n l a yr 2 4 , 19 9 8 , re v is io n re c e iv e d 众ot be r Z , 19 9 8
丁七e
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5期 刘文轩等 :利用荧光原位杂交技术检测导人普通小麦的大赖草染色质 51 5
T he e rsl us te a rs a o fl l
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图 版 说 明
1
.
R TC 染色体原位杂交 . 左为间期核 , 示 3个黄绿杂交信号 , 右为中期核 , 示 1 条大赖草 L : 7 染色体和 l 个 rL . 7
端体 . 2 . RT C 染色体原位杂交 . 左为前期核 , 示 3个杂交信号点 ;右为中期核 , 示 3个 rL . 7 端体 . 3 . 小麦一大赖草等臂
体异附加系 PM C MI 染色体原位杂交 . 示大赖草环状单价染色体 . 4 . R T C 染色体原位杂交 . 示 l 条由大部分大赖草
染色体组成的易位染色体 . 5 . R T C染色体原位杂交 . 示 1条由大部分小麦染色体组成的易位染色体 . 6 . R T C 染色体
原位杂交 . 示 2条整臂易位染色体 . 7 . (小麦次赖草异附加系 x 小麦准毛麦 6 v s l6 A L易位系 ) E pM C 叨染色体原
位杂交 . 示 1条大赖草染色体和顶端有杂交信号的簇毛麦 6 V S染色体臂
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