全 文 ：中国农业科学 2006,39(1):193-198
Scientia Agricultura Sinica


收稿日期: 2005-02-26；接受日期：2005-10-14
基金项目:国家自然科学基金（30070461、30370905）和北京市自然科学基金资助（5032009）
作者简介:葛荣朝（1974-），男，河北故城人，副教授，博士，研究方向为小麦分子细胞遗传学。Tel:0311-86268230; Email:grcgp@sina.com。通讯作
者，赵茂林，Tel: 01051503283；Email:zhaomaolin@baafs.net.cn


一个耐盐小麦-多枝赖草二体异附加系外源染色体的鉴定
葛荣朝 1，张敬原 2，赵宝存 1，黄占景 1，沈银柱 1，赵茂林 2
（1河北师范大学生命科学学院，石家庄 050016; 2北京市农林科学院农业生物技术研究中心 北京 100089）

摘要：【目的】对附加系 Line15 进行耐盐性验证，并了解其外源多枝赖草染色体的遗传背景。【方法】利
用含 0.4%（w/w）NaCl 的人工模拟盐池进行耐盐性鉴定，并对 Line15 根尖细胞、花粉母细胞的染色体数目进行检
测，进而利用荧光原位杂交和微卫星标记技术对其遗传物质进行进一步鉴定。【结果】小麦-多枝赖草杂交后代
Line15 为一个具有较高耐盐特性的材料，其染色体组成为 2n=44=22 II，属于一个小麦-多枝赖草二体异附加系。
根据 SSR 检测结果表明，Line15 附加的一对多枝赖草染色体与小麦的第 2部分同源群长臂、第 3部分同源群着丝
粒和第 7部分同源群短臂密切相关。【结论】对小麦-多枝赖草二体异附加系 Line15 进行了生理、细胞和分子水
平的系统检测，较全面地揭示了 Line15 耐盐性的具体来源。
关键词：小麦; 多枝赖草; 二体异附加系; 荧光原位杂交; 微卫星标记

Identification of the Alien Chromosomes in a Salt-Resistant
Wheat-Leymus multicaulis Disomic Addition Line
GE Rong-chao1, ZHANG Jing-yuan2, ZHAO Bao-cun1, HUANG Zhan-jing1, SHEN Yin-zhu1, ZHAO Mao-lin2
(1College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016; 2 Beijing Agriculture Biotechnology Research Center,
Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100089)

Abstract:【Objective】The salt-resistance and the alien addition chromosomes of the addition line Line15 were studied in an
experiment. 【Method】The salt-resistance was detected under 0.4% ( NaCl/soil w/w) salt stress in man-made simulated salt pool. The
numbers of chromosomes in the root cells and pollen cells was also checked. Then Line15 was detected by fluorescence in situ
hybridization (FISH) and simple sequence repeat (SSR).【Result】The results showed that the wheat-Leymus multicaulis offspring
Line15 was a salt-resistant line, and it was a disomic alien addition line which karyotype was 2n=44=22II. The results of SSR
showed that the two alien addition chromosomes are closely correlated to the long arm of the second homologous group, the
centromere region of the third homologous group and the short arm of the seventh homologous group in wheat, respectively.
【Conclusion】In this research, the wheat-Leymus multicaulis disomic alien addition line Line15 was detected on physiological,
cellular and molecular level. The research results have provided reliable evidence for the source of the salt-resistance of Line15.
Key Words: Triticum aestivum; Leymus multicaulis; Disomic alien addition line; FISH; SSR

0 引言
【本研究的重要意义】小麦是全世界最重要的粮
食作物之一，而且随着全球人口的增长，其需求量日
益增加。但一些小麦产区病虫害和恶劣的生态环境常
常造成小麦产量锐减[1]。其中土壤盐渍化的危害尤为
严重，全世界盐渍化的土地约占可耕地面积的 20%，
占可灌溉土地的 50%左右[2, 3]。高浓度的盐环境会导致
植物的离子失衡和高渗胁迫，从而致使植物产量减少。
为此，众多的小麦遗传育种学家将目光转向蕴涵丰富
基因资源的小麦近缘种属之中[4]，以便通过外源基因
转移提高小麦的耐盐性。【前人研究进展】多枝赖草
（Leymus multicaulis，2n=4X=28，XmXmNsNs）隶属
赖草属（Leymus Hochst），多年生，可以为小麦遗传
194 中 国 农 业 科 学 39卷

改良提供丰富的基因资源，如耐盐碱、耐瘠薄、耐污
染、抗黄矮病等特征[5]。袁舟舟等于 1985～1986年首
次利用桥梁品种中国春小麦将多枝赖草与普通小麦杂
交成功，随后利用普通小麦品种丰抗 7、丰抗 10和丰
抗 13对多枝赖草-普通小麦杂交种进行回交[6]。1991～
1993 年，赵茂林等通过对多枝赖草-普通小麦杂交后
代的选育，得到了 12 种互不相同的普通小麦-多枝赖
草二体附加系。随后经过抗性筛选发现，附加系 line24
具有耐黄矮病、耐蚜虫的特性[7]。【本研究切入点】
为了进一步探究其它小麦-多枝赖草二体附加系的抗
性特点，2000年秋天在北京市农林科学院国家农业信
息化工程技术研究中心田间建立人工模拟盐池开始对
这些附加系进行耐盐性鉴定，初步发现 Line14、Line15
的耐盐性突出。【拟解决的关键问题】本文对初选耐
盐附加系 Line15进行耐盐性验证，并利用染色体荧光
原位杂交（FISH）和微卫星标记（SSR）技术进行检
测，初步了解了其外源多枝赖草染色体的遗传背景。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
研究于 2000年冬天开始，室外试验在北京市农林
科学院国家农业信息化工程技术研究中心田间进行，
室内试验在北京市农林科学院农业生物技术研究中心
进行。多枝赖草 R79、耐盐、敏盐小麦对照品种分别
由中国农业科学院周荣华和李立会、宋景芝和翁跃进、
杨凯和景蕊莲研究员提供。
1.2 试验材料
小赖麦二体附加系 Line15（中国春/多枝赖草//中
国春///丰抗 13），是赵茂林于 1991～1993 年博士研
究生期间在中国农业科学院董玉琛院士指导下所创制
和繁殖保存；其有关普通小麦亲本中国春和丰抗 13，
由赵茂林研究员保存提供，外源亲本多枝赖草 R79；
耐盐小麦对照品种Kharchia和敏盐小麦对照品种烟农
18，分别由中国农业科学院周荣华和李立会、宋景芝
和翁跃进、杨凯和景蕊莲研究员提供。
1.3 人工模拟盐池的创建、检测与管理
人工挖掘长 5 m、宽 1.2 m、深 1.2 m的盐池，盐
浓度用 NaCl调整为土壤干重的 0.4%。经北京市农林
科学院植物营养与资源研究所实际测定，0.4%盐池和
对照普通土壤的全盐量分别为 0.478%和 0.068%，相
应的电导率值分别是 2240和 194，与设计相符合。另
外在盐池上方搭建防雨棚以保证盐池内盐浓度的均衡
稳定。将各种试验材料在 0.4%盐池和对照池同时点播
种植进行耐盐性鉴定，每种材料点播 15粒。等小麦成
熟后，各收获 10株计算平均单株产量。小麦各试验材
料的耐盐性鉴定主要根据其耐盐系数和耐盐指数来判
定，计算公式如下：
的单株产量品种在普通土壤对照池
品种在盐池的单株产量耐盐指数 =

数耐盐对照品种的耐盐指
品种的耐盐指数耐盐系数 =

1.4 根尖和花粉母细胞染色体制片和染色体数目统
计
染色体制片程序参考葛荣朝等 [8]。将附加系
Line15及其小麦亲本的种子水浸萌动，然后转移到水
浸湿的滤纸上，置于 4℃冰箱中 10 h以上，而后置于
24℃下培育 15～17 h后，切取根尖放入 0℃冰水中处
理 30 h，然后去掉冰水，固定于 3∶1（v/v）的乙醇-
冰醋酸中 2 d以上，转入-20°C贮存备用。
附加系 Line15 及其小麦亲本的花药直接从新鲜
的幼穗剥取，从 4月中下旬开始，当植株挑旗后，手
捏感觉幼穗发育至旗叶下第 1 叶和第 2 叶间距的
1/2-2/3 处时，剥取幼穗用 1%醋酸洋红染色镜检，将
减数分裂中期 I 的花药固定在 3∶1（v/v）的乙醇-冰
醋酸中 2 h以上，然后在-20°C贮存备用。
两种试验材料在 45%醋酸中压片，相差显微镜镜
检，统计染色体数目，较好的制片在拍照后液氮冰冻
揭片，常温干燥，4℃保存备用。
1.5 荧光原位杂交(FISH)
荧光原位杂交主要参考王苏玲等[9]。多枝赖草基
因组探针用 dig-nick translation mix（Enzo. Roche）试
剂盒标记，200 ng·µl-1的 RNase 酶解（37℃，1 h），
4%多聚甲醛处理 10 min。各个制片在 37℃ 2×SSC中
冲洗 3次，每次 5 min，然后进行梯度脱水（70%乙醇
1×3 min、95%乙醇 1×3 min、100%乙醇 1×3 min），
气干 30 min以上；配好的杂交液（含 50%去离子甲酰
胺、10%硫酸葡聚糖、2×SSC、0.25%SDS 、0.1 µg·µl-1
鲑鱼精 DNA、100 ng多枝赖草探针 DNA、1µg中国
春小麦封阻 DNA）80～85℃水浴 5 min，而后迅速埋
入冰中冷却 5 min. 每片 38µl，加塑料盖片，放入原位
PCR仪，变温处理过夜（75℃5 min、60℃2 min、55
℃2 min、50℃30 s、45℃1min、42℃2 min、40℃5 min、
38℃5 min、37℃18 h），2×SSC（42℃，1×5 min）。
然后进行系列冲洗，20%甲酰胺（42℃，2×5 min），
0.1×SSC（42℃，2×5 min），2×SSC（室温，3×5 min），
1期 葛荣朝等: 一个耐盐小麦二体异附加系外源染色体的鉴定 195

4×SSC（0.2%吐温）（室温，1×5 min）; 每片加 5%BSA
98µl/片，原位杂交 PCR仪 37℃，5 min，揭去盖片，
每片滴加 5%BSA配制的 2 µg·ml-1 Anti-dig溶液 48 µl/
片，加塑料盖片，原位杂交 PCR仪 37℃，1 h或更长
时间. 4×SSC（0.2%吐温），37℃，2×8 min; 4×SSC（0.2%
吐温），室温，1×5 min。 每片滴加 0.1 mg·ml-1碘化
丙锭（PI）0.1～0.3 µl 染色，加抗褪色剂，封片，荧
光显微镜下观察并利用 CCD 摄为数字信号贮存在计
算机中。
1.6 微卫星标记(SSR)
引物选择按照 Röder等发表的微卫星引物序列，
由上海博亚公司合成[10]。选用定位于普通小麦 21 对
染色体的长臂、短臂和着丝粒部位的 225对 SSR引物
对多枝赖草、附加系及其小麦亲本进行 PCR扩增，扩
增所需的模板 DNA从小麦材料中国春、丰抗 13、多
枝赖草、附加系 line15的叶片中提取[11]。SSR反应主
要参照 Röder 等[12]，PCR 反应体系含 2µl 10×PCR
buffer，1.4µl 25 mmol·L-1 MgCl2，2µl 2 mmol·L-1 dNTP，
2µl 2.5 µmol·L-1引物，0.2 µl 5U·µl-1 Taq酶，50～100 ng
DNA模板，加 dd H2O到 20 µl。PCR反应程序为 94 ℃
预变性 5 min，然后进入循环程序 94℃变性 1min，50
℃、55℃或 60℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，共运
行 35个循环，最后 72℃延伸 10 min，反应产物 4 ℃
保温备用。
扩增产物利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，对凝胶
先进行 95W恒功率预电泳 30 min，20 µl PCR反应产
物中加入 6 µl变性载样缓冲液（98%无离子甲酰胺，
10 mmol·L-1 EDTA（pH 8.0），0.25%溴酚蓝），94
℃变性 5 min，立即冰浴冷却备用。样品上样量为 5 µl，
95W恒功率电泳（1 h左右），银染，胶板晾干后用
Bio-Rad公司的 FX型扫描仪进行分析。
2 结果与分析
2.1 耐盐鉴定结果
模拟盐池的鉴定结果如表 1 所示，由于附加系材
料是含有外源基因的潜质材料，其农艺性状还有待改
进，所以 Line15在普通土壤的对照池中其单株产量明
显低于对照小麦品种。而在 0.4%模拟盐池中，Line15
的单株产量却明显最高，其 0.4% 耐盐系数明显高于
耐盐对照品种 Kharchia，达到 4.51，显然具有很强的
耐盐特性。Line15 是杂交组合中国春/多枝赖草//中国
春///丰抗 13 的后代选系，其小麦亲本品种中，丰抗
13的耐盐系数略高于敏盐对照品种烟农 18，明显低于
耐盐对照品种 Kharchia，为不耐盐品种；而中国春的
耐盐系数明显高于敏盐对照品种烟农 18，略低于耐盐
对照品种 Kharchia，为轻度耐盐品种，与已有报道相
符[13]；多枝赖草的发育特性不同于小麦，无法参与产
量对比分析，但在 0.4%模拟盐池中生长繁茂，不仅不
受高盐浓度抑制，甚至好于对照池，无疑具有高度耐
盐特性。据此结果分析，即使假设耐盐性是多基因控
制的数量性状，具有累加效应，亲本中国春（0.81）
和丰抗 13（0.40）的累加耐盐系数也仅 1.21，远不能
使 Line15的耐盐系数高达 4.51。因此可以确认 Line15
很强的耐盐特性主要来源于多枝赖草。

表 1 试验材料在盐池以及对照池中的产量结果
Table 1 Results of yield comparison in control and salt pools
材料
Materials
对照池单株产量
Yields per plant in control pool (g)
0.4%盐池单株产量
Yields perplant in 0.4% Pool (g)
0.4%盐池耐盐指数
Coefficients in 0.4% pool
0.4%盐池耐盐系数
Indexes in 0.4% pool
Line15 12.15 8.49 0.70 4.51
Kharchia 43.76 6.78 0.15 1.00
烟农 18 Yannong18 30.27 0.20 0.01 0.04
中国春 Chinese Spring 41.79 5.27 0.13 0.81
丰抗 13 Fengkang 13 18.27 1.14 0.06 0.40
2.2 染色体数目统计结果
通过对 500个以上的根尖、花药细胞的染色体结
构和数目检测，确定小麦亲本中国春、丰抗 13为正常
小麦染色体数目 2n=42=21II；小麦-多枝赖草附加系
Line15的染色体数目为 2n=44=22 II，比小麦多 1对，
具体结果如图 1所示。
2.3 荧光原位杂交结果
以多枝赖草的基因组 DNA 为探针，经地高辛标
记后对 Line15 的中期细胞分裂相进行荧光原位杂交
后，经检测每个根尖细胞分裂相中均有两条染色体呈
现出明显杂交信号，而在花粉母细胞的中期分裂相中
确认有杂交信号的两条染色体为一对染色体，因此可
以推断 Line15 确实是附加了一对多枝赖草染色体的
纯合二体异附加系（图 2）。
196 中 国 农 业 科 学 39卷






A．根尖细胞有丝分裂中期；B．花粉母细胞减数分裂中期
A．Mitosis metaphase of root cell; B．Meiosis metaphase of pollen cell

图 1 小麦-多枝赖草附加系 Line15 的染色体检测
Fig.1 The chromosomes detection of the wheat-Leymus
multicaulis addition line Line15





A．根尖细胞；B．花粉母细胞
A．Root cell; B．Pollen cell

图 2 FISH 检测结果（黄色染色体为外源染色体）
Fig. 2 The results of FISH (the yellow chromosomes were the
alien chromosomes)

2.4 SSR 检测结果
本研究 SSR试验结果表明，用 225对小麦微卫星
标记引物对试验材料的基因组 DNA进行 PCR扩增，
共有 99对引物可从多枝赖草中扩增出产物，其中的 4
对引物 Xgwm674、Xgwm400、Xgwm382和 Xgwm501
可以扩增出二体异附加系 Line15 两条外源染色体的
特异扩增条带，即这 4 对引物利用二体异附加系
Line15 和多枝赖草的基因组 DNA 为模板可以扩增出
这些条带，而以 Line15 的小麦亲本中国春、丰抗 13
的基因组 DNA 为模板则不能扩增出。如图 3 所示，
Xgwm674 的特异扩增条带为 125 bp 和 136 bp，
Xgwm400的特异扩增带为 123 bp，Xgwm382的特异
扩增带为 85 bp和 88 bp，Xgwm501的特异扩增带为
424 bp。依照 Röder 等[11]发表的微卫星引物定位，
Xgwm382位于小麦第 2部分同源群的长臂、Xgwm501
定位在小麦 2 B的长臂、Xgwm674定位在小麦 3 A的
着丝粒区域、Xgwm400定位在小麦 7 B的短臂。据此
可以初步推断 Line15 附加的一对外源多枝赖草染色
体与小麦的第 2部分同源群长臂、第 3部分同源群着
丝粒和第 7部分同源群短臂密切相关。
3 讨论
3.1 二体附加系 Line15 的耐盐性
在盐胁迫条件下，小麦受影响最大的首先是其根
系，其次是单株分蘖数和成穗数，最终导致单株产量
的下降。在土壤含盐量相同条件下，小麦的不同性状
表现出的受害程度不同，其中受影响最大的是分蘖数
和有效穗数两个性状，这是盐碱地产量降低的主要原
因[14]。单株产量是单株穗数、穗粒数、千粒重等各产
量构成因素的综合体现。对小麦而言，其耐盐性的最
终表现就是产量的高低。因此，笔者以单株产量作为
耐盐性鉴定的指标是可行的。
通过模拟盐池的耐盐性鉴定可以看出，参试的 4
个小麦品种中，耐盐和敏盐对照品种在 0.4%盐池中平
均单株产量、耐盐指数和耐盐系数等各项耐盐指标上
分别给出了预期的最高和最低值，说明耐盐性鉴定结
果可信；小麦-多枝赖草附加系 Line15 表现出很强的
耐盐特性，而其小麦亲本中国春和丰抗 13的累加耐盐
系数也仅 1.21，远不能使Line15的耐盐系数高达 4.51，
因此可以推断该附加系很强的耐盐特性主要来源于多
枝赖草。再结合荧光原位杂交与根尖和花粉母细胞染
色体的检测结果，可以推测控制该附加系很强耐盐特
性的主要基因位于其所附加的 1对外源多枝赖草染色
体上。通过对照池各个品种和品系的单株产量可以发
现 Line15的单株产量明显低于各小麦品种，因此该附
加系虽然具备一定的耐盐特性，但将其利用到农业生
产还需要进一步的培育、筛选，以获得农艺性状良好、
遗传稳定的耐盐易位系品种。另外，Line15中含有的
耐盐相关基因锁定在了附加的一对多枝赖草外源染色
A
B
B
A
1期 葛荣朝等: 一个耐盐小麦二体异附加系外源染色体的鉴定 197




























1.中国春；2.丰抗 13；3. Line15；4.多枝赖草；5. Marker (bp)
1. Chinese Spring；2. Fengkang.13；3. Line15；4. Leymus multicaulis；5.
Marker (bp)

图 3 Xgwm674(A), Xgwm400(B), Xgwm501(C), Xgwm382(D)
的 SSR 扩增产物
Fig. 3 Products amplified by primer pairs Xgwm674(A),
Xgwm400(B), Xgwm501(C), Xgwm382 (D).

体上，因此 Line15也可以作为筛选、获得耐盐相关基
因的优良材料。
3.2 SSR 检测
SSR试验结果表明Line15所附加的一对多枝赖草
染色体与小麦的第 2部分同源群长臂、第 3部分同源
群着丝粒和第 7部分同源群短臂密切相关。郭光艳证
实另一个附加系 Line24 中附加的一对多枝赖草染色
体与小麦第 5部分同源群、第 6部分同源群、第 7部
分同源群短臂和第 3部分同源群长臂密切相关[15]。由
这些结果可以看出，一对多枝赖草的染色体并不是与
小麦的某一个同源群相关，而是同时和几个同源群相
关。这表明在漫长的进化历程中小麦或多枝赖草的各
同源群之间发生了复杂的染色体易位重组，以至于小
麦和多枝赖草的同源群就存在了复杂的相关指向。但
染色体着丝粒区域的 DNA 序列发生易位或交换的机
率较小，因此可以依据着丝粒区域的 SSR引物扩增结
果来判断小麦和多枝赖草各同源群之间的相关性。根
据这一结论，就可以将多枝赖草的 7个同源群与小麦
的 7个同源群相对应起来，为小麦和多枝赖草远缘育
种将来的深入研究提供必要的理论基础。
4 结论
4.1 本试验通过含 0.4%（w/w）NaCl的人工模拟盐
池与不含 NaCl的对照池比较鉴定，初步确认小麦-多
枝赖草杂交后代材料 Line15 为一个具有较高耐盐特
性的材料。根据对其小麦亲本和多枝赖草的耐盐性鉴
定，证明 Line15的显著耐盐特性可能主要来源于多枝
赖草。
4.2 通过对 Line15 根尖细胞、花粉母细胞的染色体
数目常规检测，确定其染色体组成为 2n=44=22 II，比
普通小麦多出两条染色体。利用荧光原位杂交技术对
Line15的根尖细胞、花粉母细胞染色体进行检测，确
认 Line15 在小麦的 21 对染色体基础上附加了一对多
枝赖草染色体，是一个小麦-多枝赖草二体异附加系。
4.3 通过利用 225对小麦微卫星标记引物对 Line15、
多枝赖草及其相关小麦亲本的 DNA 进行微卫星标记
检测，发现 Line15附加的一对多枝赖草染色体与小麦
的第 2部分同源群长臂、第 3部分同源群着丝粒和第
7部分同源群短臂密切相关。
总之，本试验对小麦-多枝赖草二体异附加系
Line15进行了生理、细胞和分子水平的系统检测，较
全面地揭示了 Line15耐盐性的具体来源，为进一步用
于小麦乃至其它植物的抗逆遗传育种提供了一定的物
质与理论基础。

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307 bp
404 bp
424 bp

1 2 3 4 5
123 bp
148 bp
136 bp
125bp

1 2 3 4 5
123 bp


90 bp
88 bp
85 bp
1 2 3 4 5

A B
C
D
5 4 3 2 1
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(责任编辑 张淑兰)