全 文 ：麦类作物学报　 2000, 20( 3): 6～ 10
Journal of T riticeae Crops
文章编号: 1009-1041( 2000) 03-0006-05
大赖草 DNA导入小麦获得大穗品系的
农艺性状和贮藏蛋白研究
⒇
张 茂 银 1 , 刘 云 英 2 , 杨 克 锐 1 , 顾 爱 星 1 , 王子 霞 1 , 海热古力 1 , 杨 松 杰 1
( 1. 新疆农业科学院核技术生物技术研究所 , 乌鲁木齐　 830000;　 2. 中国科学院新疆化学研究所 )
摘　要: 应用花粉管通道法将大赖草 DN A导入小麦 ,已从受体 761转化后代中选育出稳定遗传的大穗变
异系。主要特征为: ( 1)大穗变异系生育期晚 ,株型高大 ,叶片宽大 ,穗长、穗粒数和单株粒重显著增加 ,同时籽粒
长、宽和千粒重明显提高 ; ( 2)大穗变异系除蛋白质含量有显著变化外 ,其胚乳谷蛋白和醇溶蛋白电泳图谱发生
了明显变化 ,出现了新的蛋白组分和受体一些带的消失。 由此可见 ,大赖草 DNA导入小麦后发生广泛变异 ,可
能是外源 DNA片段重组到受体基因组的结果。
关键词: 小麦 ; 大赖草 DNA; 变异类型 ; 贮藏蛋白
中图分类号: S 512. 103. 2　　　　文献标识码: A
近年来 ,国内外广泛开展了通过花粉管导入外源 DNA的研究 ,还发展了 DNA浸泡种子和幼苗、孕
穗注射、离子轰击和电击法等转移外源 DNA的方法 ,并在棉花、水稻、小麦、玉米、大豆等作物上获得外
源 DNA转化的变异后代 ,培育出一些新品系 [1, 2 ]。同时应用花粉管通道法 ,把 Bt基因、Gus基因等导入
棉花、玉米、小麦中 ,获得了良好的转化效果。可见外源 DNA(基因 )直接导入法是完全可行的。
小麦具有丰富的近缘野生种 ,由于远缘杂交困难和杂交不亲和性 ,阻碍了小麦近缘野生种的利用。
如何利用小麦与其近缘属种的部分同源性 ,开展 DNA片段杂交为基础的分子育种研究 ,就成为小麦育
种者关注的问题。因此 ,自 1989年我们开展了把小麦近缘野生种大赖草 DNA导入普通小麦的研究 ,获
得了变异类型丰富的转化后代 ,其中大穗品系穗部特性较为突出。
1　材料和方法
1. 1　供试材料
供体:新疆大赖草 [Leymus racemosus ( Lam. ) Tzvel ]。
受体:花培春小麦品系 761。
1. 2　试验方法
1. 2. 1　供体 DNA的提取　经长期研究 , 1989年选择新疆的大赖草为外源 DNA供体。采用氯仿 -异戊
醇法 [3 ]提取 ,提取的供体 DNA经紫外检测 (岛津 UV-265)和琼脂糖凝胶电泳鉴定 , A260 /A280= 1. 87,
A260 /A230= 2. 30,符合外源 DNA导入要求 ,用超声波随机打断后供导入。
1. 2. 2　供体 DNA导入　在受体 761自花授粉后 1～ 3 h内 ,切去柱头 ,滴加 3. 5μg /μl的供体 DNA溶
液 6μl至切口处 ,然后套袋结实 , 1989年夏季收获 D0代种子。
1. 2. 3　转化后代处理　按常规选育方法对转化后代 D0、 D1、 D2、 D3代种子均单粒点播株行 ,进行种植、
选择和鉴定。
⒇ 收稿日期: 1999-12-27　　　　修回日期: 2000-04-10
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 39660040)。
作者简介:张茂银 ,男 , 1962年生 ,副研究员 ,农学硕士 ,主要从事小麦生物技术研究工作。
1.大赖草 ; 2.受体 761; 3.大穗转化后代
1. Leymus racemosus; 2. Recepto r 761;
3. Larg spike prog eny
图 1　主要供试材料的植株
Fig. 1　 Plants of main materials
1. 2. 4　转化后代品系种子粗蛋白测定　选用转化后代
大穗品系 D6代的 93个品系 ,使用瑞典 Tecator公司的
Kieltes systemⅡ氮 /蛋白质分析仪进行测定。
1. 2. 5　供试材料种子贮藏蛋白的提取和电泳　供试材
料为:供体大赖草 ,受体 761,转化后代大穗品系 ( D10代 )
99S-12、 99S-13、 94W-1,面包小麦品种新春 9号、 8831,
小麦品种新春 6号 , 94W-1与新春 6号杂交的 F3代大
穗株系 99S-200和小穗株系 99S-205。
醇溶蛋白的提取参照刘云英等的方法 [ 4 ] ,每个样品
取 2粒种子 ,研碎放入 1. 5 m l离心管中 ,加入 0. 4 m l乙
二醇 ,室温下间隙振荡抽取 30 min, 8000 g离心 10 min,
转移上清液至另一个 1. 5 ml的离心管中 ,加入含 0. 1%
甲基绿的 0. 01 mo l /L甲酸溶液 40μl ,混合后放置 4℃
冰箱内备用。 电泳分离采用甘氨酸 -乙酸聚丙烯酰氨凝
胶电泳方法 [5 ]。
谷蛋白的提取参照桑建利的方法 [6 ] ,并加以改进。
单粒种子磨粉 ,置于离心管中 ,加入 10% NaCl溶液 1
m l,充分混合离心去上清液 ,反复两次 ,蒸馏水洗两次 ,
再加入 70%乙醇溶液 1 ml,充分混合后离心去上清液。
沉淀中加谷蛋白提取液 ( 0. 0625 mol /L Tris-HCl 1 ml
pH 6. 8, 2% SDS, 10%甘油 , 5% β -巯基乙醇 , 0. 002%溴酚蓝 ) 400μl, 4℃提取 10～ 15 h, 90℃加热 3
min,离心取上清液 ,置于 4℃冰箱内备用。电泳分离采用单向一步不连续 SDS-PAGE系统 [7 ]进行。
2　结果与分析
2. 1　转化后代大穗变异类型
1992年在以 761为受体的 D3代中发现一株变异株 ,表现晚熟、植株高大、叶片宽大、穗长和穗粒数
等明显大于受体 ,后经连续种植、选择 ,在 D7代获稳定大穗品系 110个 ,并对其中 50个优良品系进行 5
年的考种分析 (表 1)。从表 1可见 ,大穗转化后代在 D4代已基本稳定 ,且年度间变化小、适应性较强 ,是
可资利用的大穗小麦新种质。
2. 2　转化后代大穗品系种子的粗蛋白含量
对 93个大穗品系的测定结果 ,平均蛋白质含量为 15. 5% ,变幅 11. 18% ～ 19. 60% ,而受体 761为
14. 41% ,这说明新疆大赖草可以改良小麦营养品质 ;而且出现了超亲现象 ,如蛋白质含量为 19. 60%的
品系超过了大赖草 ( 18. 3% );蛋白质含量为 11. 18%的品系低于受体 ( 14. 41% ) ,获得了有特定利用价
值的新种质。
2. 3　醇溶蛋白的电泳图谱
从供试材料种子醇溶蛋白电泳图谱 (图 2)看 ,转化后代大穗品系 (样品 2、 3、 7)之间存在一定差异 ,
99S-12和 99S-13有 3条带不同 ;两者与 94W-1有明显的 4条差异带。表明来源于同一大穗变异株的不
同大穗品系 ,在醇溶蛋白组成方面有差异。 从供体、受体、大穗品系的电泳图谱可见 ,大穗品系醇溶蛋白
电泳图谱完全不同于供体 ,无来自供体的特异带 ,并且大部分谱带与受体一致。大穗品系与受体的差异
表现在 1～ 2新带的出现和受体 3条带的消失 ,且主要出现在迁移率低的高分子量醇溶蛋白区。 从大穗
品系 94W-1、新春 6号及两者杂交后代 F3代大穗株系 ( 99S-200)、小穗株系 ( 99S-205)电泳图谱来看 ,由
于杂交重组 ,杂交后代株系与父母本的带型差异 ,主要表现为新带的出现。因此 ,认为大赖草 DNA片段
进入受体后 ,以重组的方式整合到受体基因组 ,使大穗品系出现新带 ,同时还发现大穗品系与面包小麦
·7·3期 张茂银等: 大赖草 DN A导入小麦获得大穗品系的农艺性状和贮藏蛋白研究
的醇溶蛋白谱带有明显差异。
表 1　新疆大赖草 DNA转化普通小麦后代和受体 761农艺性状统计分析结果
Table 1　 Agronomical characters of receptor 761 and progenies f rom common
wheat transformed by the leymus racemosus DNA
世代
Gen eration
转化株系数
和受体数
No. of
t ransformed
lines and
receptor
每个株系和
受体的单株数
No. of plant per
t rans formed
line and
receptor
株高
Plan t
heigh t
(cm)
有效分蘖数
Ef fective
t ill ers /
plan t
主穗长
Spike
length
(cm)
小穗数
Spik elet s /
main spike
主穗结实数
Kernels /
main spike
主穗粒重
Kernel
w eigh t /
main spike
( g)
千粒重
TGW
(g )
D4 1 265 92. 4 5. 2 15. 1 22. 7 57. 1 2. 2 38. 4
761 1 50 72. 9 5. 1 9. 7 19. 5 60. 8 2. 1 34. 1
D5 100 50 98. 3 3. 6 14. 9 21. 4 55. 6 2. 6 46. 8
761 1 50 84. 8 3. 8 8. 9 16. 2 40. 6 1. 3 32. 0
D6 50 50 101. 1 4. 4 15. 8 21. 0 68. 9 3. 4 49. 3
761 1 50 77. 7 3. 8 9. 3 18. 1 5. 9 2. 4 40. 7
D7 50 50 90. 7 4. 1 15. 2 22. 1 62. 1 2. 7 43. 5
761 1 50 82. 0 3. 4 9. 4 18. 5 68. 6 2. 3 41. 3
D8 50 50 101. 5 4. 3 15. 2 23. 4 70. 0 3. 5 50. 0
761 1 50 75. 5 3. 6 10. 1 18. 4 55. 7 2. 8 40. 8
X
-*
t 96. 8 4. 3 15. 2 22. 1 62. 7 2. 9 45. 6
X-
*
761 78. 6 3. 9 9. 5 18. 1 55. 3 2. 2 37. 3
X- t- X
-
761 18. 2 0. 4 5. 7 4. 0 7. 4 0. 7 7. 9
* X
-
t: D4、 D5、 D6、 D7和 D8的平均值 ; X-761: 受体 761五年平均值。
* X
-
t: Th e data f rom av erage of total ( D4… D8 ) ; X-761: the data f rom average of receptor 761 in fiv e years.
　　　图 2　种子醇溶蛋白电泳图谱
Fig. 2　 Electrophoresis of seed gliadin proteins　　　　
　　　图 3　种子谷蛋白电泳图谱
Fig. 3　 Electrophoresis of seed glutelin proteins
1:供体 (大赖草 ) ; 2:大穗品系 99S-12; 3:大穗品系 99S-13; 4:受体 ( 761) ; 5:面包小麦 8131; 6:面包小麦新春 9号 ;
7:大穗品系 94W-1; 8: F3大穗株系 99S-200; 9: F3小穗株系 99S-205; 10:新春 6号
1: Donor ( Leymu s) ; 2: Large spike line 99 S-12; 3: Large spik e line 99S-13; 4: Receptor (761) ;
5: Bread w heat variety 8131; 6: Bread w h eat variety Xincun 9; 7: Large spike line 94W-1;
8: F3 larg e spik e line 99 S-200; 9: F3 small spik e line 99S-205; 10: Xinch un 6
·8· 麦　类　作　物　学　报 20卷
2. 4　谷蛋白的电泳图谱
从供试材料种子谷蛋白的电泳图谱 (图 3)看 ,大穗品系 (样品 2、 3、 7)之间的差异主要表现为带的深
浅不一致 ,相互之间仅有 1条带显著不同 (第 3条带 ) ;大穗品系带型趋于受体 ,与供体完全不同 ,不存在
与供体一致而受体无的谱带。大穗品系除第 2、第 3、第 4条带不同于受体 ,其余与受体基本一致 ,并且第
3条带与面包小麦 8131、新春 9号的第 3条带一致 ,说明导入大赖草 DNA片段对小麦品质有一定改良
作用。 已有研究证明不同小麦品种的谷蛋白组成是品种的遗传特性 ,通过基因的核苷酸序列分析 ,已发
现编码高分子量谷蛋白的基因间具有高度同源性 [ 8]。结合以上分析 ,表明大赖草 DNA片段导入受体
后 ,与受体基因组发生了重组 ,表达了新的高分子量谷蛋白组分。
大穗品系之间醇溶蛋白和谷蛋白都存在一定差异 ,且来自供体的特异带 ,除新带外的谱带都来自受
体 ,说明外源 DNA导入发生重组的范围比杂交重组范围小 ,整合到受体基因组的片段也较小。
3　讨 论
从醇溶蛋白和谷蛋白的电泳分析结果看 ,大穗变异株的醇溶蛋白和谷蛋白的电泳带较受体有增加
(图 2)或减少 (图 3) ,并主要出现在高分子量的醇溶蛋白和谷蛋白区。这表明大赖草 DNA插入受体染
色体组造成了同源配对重组或交换 ,引起新带的出现或受体带的消失。 大量研究已表明 ,控制醇溶蛋白
的基因位于小麦第一和第六部分同源群染色体的短臂上 [9, 10 ] , (第一部分同源群染色体短臂上的基因位
点为 Gli-1,主要编码γ-和ω-醇溶蛋白 ;第六部分同源群短臂上的基因位点为 Gli-2,主要编码α-、β -醇溶
蛋白 ) ;编码低分子量麦谷蛋白 ( LMW-GS)的 3个基因位点位于第一部分同源群染色体的短臂上 ,而控
制高分子量麦谷蛋白 ( HMW-GS)的 3个基因位点位于第一部分同源群染色体的长臂上 [ 11]。因此 ,大赖
草的 DNA可能重组整合到这两个部分同源群的有关臂上 ,但插入片段的大小、位置和功能及与上述位
点的关系有待进一步研究。
参　考　文　献
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·9·3期 张茂银等: 大赖草 DN A导入小麦获得大穗品系的农艺性状和贮藏蛋白研究
Study on Agronomic Character and Storage Protein of Large Spike
Lines of Wheat Transrformed with Leymus racemosus total DNA
ZHANGMao-yin
1
, LIU Yun-ying
2
, YANG Ke-rui
1
, Gu Ai-xing
1
,
WANG Zi-xia
1
, Hairegul i
1
, YANG Song-jie
1
( 1. Ins ti tu te of Nuclear& Biotechnolog y, XAAS, Key Lab oratory of North -Wes t Crop Cel l Engineering , M inist ry of
Agriculture, Urmqi 830000;　 2. Xinjiang Research Inst itute of Ch emical , CAS)
Abstract: Leymus racemosus to tal DN A was used to t ransform common wheat via the pollen-tube
pathw ay , heri table steady la rg e spike va ria tion lines w ere obtained from transfo rmed descendant of
receptor spring wheat line 761. The main characteristics o f the lines as fol lowing: ( 1) Long g rowing
season, strong plant types, w ide leaf, lo ng spike, g rain number of spike and g rain w eight of
individual plant w ere increased ma rkedly , meantime, leng th and width of g rain and w eight of
thousand kernel w ere improved significantly. ( 2) Content o f pro teins in g rain , and lect ropho resis of
g lutelin and gliadin protein of endo sperm w ere changed signi ficant ly, new pro tein component appea red
and some bands of receptor disapppeared. Thus, the reason of wide va riations of wheat t ransformed
w ith Leymus racemosus total DN A probably w as exogeous DN A fragments recombined wi th recepto r
g enes.
Key words: Wheat; Leymus recamosus DNA; Ag ronomical Character; Sto rag e protein
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·10· 麦　类　作　物　学　报 20卷