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驱虫斑鸿菊注射液对小鼠免疫功能的影响
邓瑞春 周 勇 徐建国① 尚 靖① 王旭丹
(北京中医药大学中西医结合研究所免疫室 ,北京
于鲁海① 章金刚②
1侧X )2 9 )
中国图书分类号 F刀封 . I R鱿丹 . 9 文献标识码 A 文章编号 10( 犯闷剐X (刀犯2 )胳 057 一05
摘 要 目的 : 探讨驱虫斑鸿菊对小鼠免疫功能的影响。 方法 :采用 [’ H〕几 UR 掺人法和脾细胞介导羊红细胞定量溶血分
光光度法以及迟发型超敏反应试验等观察了驱虫斑鸡菊对小鼠免疫功能的作用。 结果 :驱虫斑鸿菊在体内外均可以明显抑
制山 n A 刺激的小鼠 T淋巴细胞的增殖反应和 I J S 刺激的小鼠 B 淋巴细胞的增殖反应 ( 尸 < 0 . 01 ) ;对小鼠胸腺指数和脾脏指
数 、绵羊红细胞 ( SBR )C 诱导的正常小鼠脾抗体细胞生成反应以及小鼠皮肤迟发型超敏反应都显示出明显的抑制作用 ,而且上
述抑制作用与药物浓度有一定的剂量效应关系 。 结论 :驱虫斑鸿菊对机体体液免疫 、 细胞免疫都有明显的抑制作用 。
关键词 驱虫斑鸿菊 脾细胞增殖反应 抗体形成细胞 白斑风 迟发型超敏反应
E l l犯c t o f ve r n o in a n t h e b 吐 n t lca iw ld o r一 t h e 加 n ct i o n o f n 止此
刀夕沼 uR i- hC un , Z厅口U oY gn , 尤刀了认二 Q 切 以 al . eB 必gn nU沁 sr ixt of 7争.o d i t动an l hC i了心。 入几己交ien , eB ij gn l《XX) 29
Ah 力 , tC ( ) I习伙 ti ve : oT e x p loer het 团锐 t of het ve om in a n ht e俪 int ca 初 dl inj ce it on on het
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伴倪 isn it vi 叭 D n J )
人类白疲风是一种顽固性皮肤病 。 该病病因学
尚不清楚 ,其发病机制至少涉及 4 种学说 ,即 自身免
疫 、 神经体液因素 、 自身细胞毒和接触外源性物质
等 。 近年来学者们普遍认为自身免疫学说是白瘫风
的主要发生机制 。 驱虫斑鸿菊注射液 (ve m on i二 L-
ht e俪 in ica iw n d , VW )是利用科学的方法从新疆特有
的菊科植物驱虫斑鸿菊的种子提炼而成的 , 其主要
成分为黄酮类物质〔’ ,2] 。 经多年临床应用显示 ,该药
对白瘫风具有明显治疗效果 [-361 。 考虑到该药治疗
白瘫风可能与机体免疫系统有关 , 故本文着重研究
该药对正常小鼠免疫系统的影响 , 以揭示驱虫斑鸿
治疗白瘫风的作用机制 。
1 材料与方法
1
.
1 实验动物 Balb / c 纯系小鼠 ,雌性 , 6 一 8 周龄 。
①新疆自治区人民医院临床医学研究所 ,乌鲁木齐 8 3X( 刃 1
②军事医学科学院野战血研究所 ,北京 1X() 8 5()
作者简介 :邓瑞春 ,女 , 41 岁 , 博士 , 助理研究员 , 主要从事中药免疫
研究 ;
指导教师 :周 勇 ,男 ,印岁 , 博士生导师 ,主要从事中药免疫研究 。
购于预防医学科学院流行病研究所 。
1
.
2 药品和试剂 受试药 : 驱虫斑鸿菊注射液每毫
升相当于 0 . 25 9 生药 ,有效成分黄酮类物质的含量为
3 11官mI , 由新疆 自治区人民医院临床药学研究所提
供 ,批号 2田 1O3( 又 。 其他试剂 : RPM l l6 40 培养基 , CBI -
CO产品 , 3 H ~ TdR :为中国原子能研究所产品。 2 ,牛二
硝基氟苯 :分析纯 ,联合科学仪器有限公司出品 ,临用
前用丙酮和色拉油 ( 1 : l) 调配成 1% ( w/ v )溶液 。 补
体 : 3只豚鼠 ,心脏取血 ,离心分离血清 ,混合 , 一 20 ℃
保存备用 。 羊红细胞 ( SBR C ) :在无菌条件下 ,从健康
成年绵羊外颈静脉取血 ,置于盛有玻璃珠的无菌椎形
瓶中 ,摇动 ,去血清纤维蛋白 , 4℃保存备用 。
1
.
3 仪器 液体闪烁计数仪 :美国 eB c k l l lan 公司生
产 ; c 0 2 培养箱 : 日本池本理化工业株氏会社生产 ;
高速冷冻离心机 :美国 HE MR LE , z3 60 ;K 电子天平 :
A lE o 瑞士 ;超净工作台 :北京市半导体设备一厂 ;
倒置显微镜 : 重庆光学仪器厂 ;多头微量细胞收集
器 : 绍兴坡塘 医疗器械厂 ; 酶联仪 : 日本 iB o 一R a d
25 5 0
0
1
.
4 方法
1
.
4
.
1 药物体外对小鼠脾 T、 B淋巴细胞增殖的影
响 采用 , H一 dT R 掺入法 7[] 。 无菌操作取小鼠脾脏 ,
按常规方法制备脾细胞悬液 , 分别用含 C o n A 或 IJ S
的不完全 RPM l l翻0 培养基调脾细胞浓度为 5 x l护
而 一 ` ,加人 9 6 孔板中 , 10 拼F孔 ( Co n A 终浓度为 5
拜留诫 , L l s 终浓度为 50 阿 d ) , 用含 20 % 胎牛血清
的完全 164 0 培养基将受试药物作 10 倍稀释共 6 个
梯度 ( 10 一 ’ 、 10 一 2 、 10 一 ’ 、 xo 一 4 、 10 一 5 、 10 一 6 ) , 以不含受
试药物的 20 %胎牛血清的完全 1创0 培养基 (含 oC -
nA 或 1 5 )作为 T 、 B 细胞增殖对照 , 加 10 拜F孔 ,每
个稀释度 3 个复孔 。 37 ℃ , 5% Cq 培养 72 h 。 培养
结束前 6 h 加人 1 . 85 x l了B可孔 , Hq 妞R 。 最后用多
头细胞收集器收集细胞于 49 型纤维滤纸上 , 用液闪
仪计数每分钟脉冲数 ( CmP ) 。 以各剂量组平均数为
指标进行统计学处理 。 以 ` 检验求出 尸值 , 比较被
试药组与对照组之间的差异 , 以评定驱虫斑鸿菊体
外对小鼠脾 T 、 B淋巴细胞增殖的影响 。
1
.
4
.
2 体内实验分组与给药 将 B砒 / c 纯系小鼠随
机分成 4 组 ,每组 or 只动物 : 驱虫斑鸿菊组 ,共设 3个
剂量组 ,分别是 :低剂量 ( v w ` L ) 87 . 5 呵 ( k g · d) , 为临床用量 5倍 ;中剂量 ( v w ~ M ) 175 州 ( k g · d) ,为临床用
量 or 倍 ;高剂量 ( v w ~ L ) 350 n娜 ( k g · d) , 为临床用量
20 倍 ,临用前用生理盐水配制 。 正常对照组注射生理
盐水 。 每天给药 1次 ,腹腔注射 ,每次 0 . 5 而 。
1
.
4
.
3 药物体内对小鼠脾 T 、 B 淋巴细胞增殖影响
采用 , H一刊 R掺人法 v[] 。 按上述分组和给药条件 ,
共给药 10 d ,第 1 天处死 。 无菌操作取小 鼠脾脏 ,
按常规方法制备脾细胞悬液 , 其他条件与体外实验
相同 。
1
.
4
.
4 脾细胞介导羊红细胞定量溶血分光光度实
验 s[] 按上述各剂量开始给药后 , 第 3 天腹腔注射
5% 羊红细胞悬液 0 . 2 耐只进行免疫 。 免疫后第 6
天 (即给药第 9 天 )将动物处死 。 取脾置于 H an k , 液
中 ,用 50 目不锈钢网分离脾细胞 , 调整细胞数为
5 x l护 耐 一 ’ , 在 24 孔板中 , 加脾细胞悬液 0 . 5 而 ,
:1 2咦渐鲜豚鼠血清补体 0 . 5 d 及 0 . 2% 羊红细胞
0
.
5 血 ,摇匀后 , 置 37 ℃水箱中孵育 l h , 2 0( X〕 r/ 而 n
离心 or 而 n ,吸取上清液置酶联仪中测定 41 3 ln 吸
光度 ,观察药物对抗体形成细胞活性的影响 。
1
.
4
.
5 迟发型超敏反应试验 [, 10 按同上方式给
药 ,于第 5 天小鼠腹部剪毛 3 cm x 3 Cm ,滴 50 川 1%
二硝基氟苯溶液致敏 ,第 10 天再滴 10 己 1% 二硝基
氟苯溶液于小鼠右耳进行攻击 。 第 n 天处死小鼠 ,
用直径 7 ~ 的打孔器在小鼠左右耳同一部位取耳片 ,求出左右耳片重量之差 ,或根据公式求出抑制百
分率 , 以检测驱虫斑鸿菊对细胞免疫影响 :
抑制百分率 (% ) 二 [ 1 一 (叽 /叽 ] 、 1的% ) 。 (盯 E 为实验性
治疗小鼠的右耳 一 左耳重量差 , 召几 为致敏小 鼠的
右耳 一 左耳重量差 ) 。
1
.
4
.
6 药物对小鼠免疫器官的作用 同上方式给
药 or d ,第 1 天处死小鼠 ,称体重 、胸腺重 、 脾重 ,按
下列公式计算胸腺指数 、脾脏指数 :
胸腺指数 二 胸腺重量 (叱l) 体重 ( g ) ,脾脏指数 二脾脏重量 (吨 )l 体重 ( g ) 。
1
.
4
.
7 流式细胞仪测定 B 淋巴细胞表面标志 7[]
无菌操作取小 鼠脾脏 ,研磨脾脏 , 用 20 目钢网过
滤 , 制备脾细胞悬液 ,用 RP M l l 64 0 无血清培养液冲
洗网 , 将脾细胞悬液置 10 时 试管 中 , 离心 2 (XX)
r/ 而 n , 10 而 n , 沉淀用约 1 耐 Rp M l l 64 0 无血清培养
液悬浮。 取 Z d 离心管 ,加人 0 . 1 血 细胞悬液 , 然
后加人荧光标记的抗体 10 川 ,室温放置 so 而 n 。 向
上述反应管中加人 1 . 5 而 红细胞裂解液 ,室温放置
巧 而 n ,离心弃上清 。 再用 RP M l l 64 0 无血清培养液
洗 2 次 ,离心 2 (XX) lr 而n , 10 而 n 。 加人固定液 0 . 5
而 ,配成细胞悬液 。 立即或次 日用流式细胞仪测定
结果 。 采用 乳伽恤 e : CE l 习ue st 软件系统对图形及
数据进行处理 ,得到测试结果 , 以不同浓度药物处理
后 B 淋巴细胞结合荧光抗体强度以 x 士 ￡表示 , 再
经 t 检验来比较各组间差别 。
2 结果
2
.
1 驱虫斑鸿菊体外对小鼠脾 T 、 B 淋巴细胞增殖
的影响 (见图 l) 由图 1可见 , 驱虫斑鸿菊浓度在
0
.
02 5
一 25
.以x h l lg l耐 范围时 , 可明显抑制 。 n A 刺
激的小鼠脾脏 T 淋巴细胞和 IJ名刺激的 B淋巴细胞
的〔3 H〕一份R 掺人量 ;经统计学处理 ( t 检验 )有非常
显著性的差异 ( 尸 < 0 . 0 1 ) , 同时 , 随药物浓度增加
抑制作用逐渐加强 ,显示出一定的剂量效应关系 ,说
明该药具有直接抑制小鼠脾 T 、 B 淋巴细胞增殖的
作用 。
2
.
2 驱虫斑鸿菊体内对小鼠脾淋巴细胞增殖的影
响 (见图 2 ) 由图 2 可见 : 驱虫斑鸿菊低 、 中、 高 3个
剂量组均可明显抑制小鼠脾脏 T 、 B 淋巴细胞的增
殖 。 经统计学处理 ( t 检验 )具有非常显著性差异
( 尸 < 0 . 01 ) , 说明该药除可在体外发挥抑制作用
外 ,体内也能抑制小鼠脾脏淋巴细胞增殖 。
2
.
3 驱虫斑鸿菊对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影
响 (见图 3) 图 3结果表明 : 驱虫斑鸿菊中 、高 2 个
洲P。qs^l妙。,.! .uldsó。召卜日洲
剂量组可明显降低小鼠胸腺指数 , 低 、 中 、 高 3 个剂
量组可明显降低脾脏指数 ,经统计学处理 ( t 检验 ),
有非常显著性差异 ( 尸 < 0 . 01 )。
2
.
4 驱虫斑鸿菊注射液对 SBR C致敏小鼠抗体生
成细胞的影响 图 4结果显示 : 驱虫斑鸿菊低 、 中, 、
高 3 个剂量组 570 ln 光密度值明显低于空白对照
组 ,且具有一定量效关系 。 显示该药可抑制小鼠血
清溶血素的产生 。 经统计学处理 ( : 检验 ) ,具有非
常显著性差异 ( 尸 < 0 . 01 ) , 说明驱虫斑鸿菊注射液
可抑制小鼠的体液免疫 。
.2 5 驱虫斑鸿菊对小 鼠皮肤迟发 型超敏反应
( DT H )的影响 图 5 结果表明 : 驱虫斑鸿菊低 、 中 、 、
高 3 个剂量都明显抑制迟发型超敏反应 。 经统计学
处理 ( t 检验 )有非常显著性的差异 ( 尸 < 0 . 01 ) 。 从
表 1结果也可看出 ,驱虫斑鸿菊 3 个剂量组与对照
组相比 ,抑制率均达到 50 % 以上 ,且随剂量增加 ,抑
制作用逐渐加强 , 进一步说明驱虫斑鸿菊对小鼠细
胞免疫有明显抑制作用 。
C o n t r o l 、 了W~ L V W . M V W ~ H
G r o u P
图 3
瑰 . 3
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驱虫斑鸿菊对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响
E伟eC t of v e m 侧吐出川山 d功加 6ca w川d on hT 那ul e 田 d
即】e in e 让lK e x
: C伪砰巴司 衍ht 二耐 , 尸 < 0 . 01 .
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图 4 驱虫斑鸿菊注射液对 SRB C 致敏小鼠抗体生成细胞的
影响
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No t e : 签 : C以 11四初 袱ht c on闹 , 尸 < 0 . 0 1 .
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C o n c e n t r a t io n o f m e d ie in e
图 1 驱虫斑鸿菊体外对小鼠 T 、 B 淋巴细胞增殖的影响
瑰 . I E价对 of ve 川. 吐皿n山 e功血币ca w 川d on 咧en T 、 B ce U
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Not e : 签 :伍月业曰 认 ht e叩 tr 日 , 尸 < 0 . 05 . C o n t r o l 、 z 、 V~ L V 、军. 卜I V 从几 11
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图 5 驱虫斑鸿菊对小鼠皮肤迟发型超敏反应 ( D n l )的影
响
瑰 . S E价对 of ve r n o n . 口目ht e ln 面 t ica on D n l
N o te ; 苍 : C o n 1P助己 iw ht con 园 , 尸 < .0 01 .
C o n t r o l V W
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H 表 1 驱虫斑鸿菊对迟发型超敏反应抑制率
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1 I n l l角妞i佣 of ve m Ol l ia a n ht e】m in柱份 on d e肠y ed t y讲 Or
图 2
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驱虫斑鸿菊体内对小鼠 T 、 B 淋巴细胞增殖的影响
E价戏 of ve r 目 in 班田ht e恤面柱ca w 川d on 印Il en T , B 戊 il
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: Q啊四曰 诫ht 咖 tr d , 尸 < 0 . 0 1 . VW , M
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表 2 驱虫斑鸿菊对 B 淋巴细胞表面抗原 C D 19表达活性的
影响
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p ll侧习 t e 砚『 ra Ce na t ige n CD珍 exP re因叭 fo 而 Ce
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N O t e : c on l l〕` 仪 1 wi th c O l l tn l) , l) 尸 < 0 . 05 , 2 ) 尸 < 0 . 0 1 .
的抗体 〔’翎 ] ;外周血 T 淋巴细胞及其亚群有异常改
变 lz[ 仍 ] ;免疫病理出现异常等区洲 ;临床上长期使用
P UVA
、氢化可的松等 ,可能也是通过对机体的免疫
抑制作用而发挥疗效的困 。
那么 , 驱虫斑鸿菊对白斑风的治疗是否也与免
疫系统有关呢? 本文的研究结果已经充分显示 , 该
药对体液免疫和细胞免疫都有明显的抑制作用 , 说
明该药对白瘫风的治疗作用可能与调节免疫系统功
能有关 , 同时从另一个侧面支持了 白瘫风发病的自
家免疫假说 。
2
.
6 马区虫斑鸿菊对 B 淋巴细胞表面抗原 C1D 9 表达
活性的影响 表 2 为采用流式细胞仪测定的 B 淋巴
细胞主要表面抗原 C1D 9 含量 , 从表中可见 ,驱虫斑
鸿菊对 CD 19 的表达有明显的抑制作用 , 显示驱虫
斑鸿菊对 B 细胞功能具有抑制作用 ,从而抑制体液
免疫作用 。
3 讨论
本文利用正常小鼠作为实验动物研究驱虫斑鸿
菊对机体免疫系统的影响 。 结果表明驱虫斑鸿菊注
射液浓度在 0 . 02 5 一 25 汉x x〕 m留而 范围内 ,体外可明
显抑制正常小鼠脾脏 T 、 B 淋巴细胞的增殖反应 ;浓
度分别为 55 . 7 m留( k g · d ) (临床用量 5 倍 ) 、 17 5 嗯 /
( k g
·
d ) (临床用量 10 倍 ) 、 3 50 m岁( k g · d ) (临床用量
20 倍 )时 ,在体内可明显抑制正常小鼠脾脏 T 、 B 淋
巴细胞的增殖反应 ,而且抑制作用强度与药物剂量
之间呈正相关 ;上述 3 个剂量 ,还可抑制胸腺指数和
脾脏指数 ,降低免疫器官的重量 ;降低脾脏抗体形成
细胞数量 ,抑制对胸腺依赖抗原 SBR C 的抗体应答
反应 ;明显抑制迟发型超敏反应 。 对 B 淋巴细胞分
化抗原 CD 19 的表达也具有明显的抑制作用 , 实验
组与对照组之间经统计学处理具非常显著性意义
( 尸 < 0 . 01 ) 。 上述结果显示驱虫斑鸿菊在体外体
内都可抑制小鼠的细胞免疫和体液免疫 。
驱虫斑鸿菊注射液作用是燥湿祛风 ,舒经通络 ,
活血化察 ,常用于治疗白瘫风 ,经多年临床应用显示
对白瘫风治疗有效率可达 80 % 以上 , 显示出较好的
治疗效果 。 近年来的研究多倾向于白瘫风发病机理
属于自家免疫疾病 ,患者的免疫功能常出现异常 : 如
患者伴有糖尿病 、 甲状腺机能亢进 、类风湿性关节炎
等其他自身免疫病的发病率较普通人群高 10 一 巧
倍 {川 ;与正常人相 比 , 白瘫风患者血清 、器官特异性
抗体的阳性率明显增高 [” 一 14长体内具有抗黑素细胞
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(编辑 张 慧 )
(上接第 580 页 )
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(编辑 许四平 )
·会讯 ·
20 3 年中国器官移植免疫学学术会议征文通知
为推动 21 世纪我国器官移植免疫学基础与临床研究的发展 ,增进国内外学术团体和科研人员的学术交流 , 由中华医学会
微生物与免疫学分会主办的 2 (X) 3 年中国器官移植免疫学学术会议拟定于 2X() 3 年 5 月上旬在南京举行 。 会议为中华医学会全
国一类会议 ,是新世纪全国器官移植免疫学的第一次学术盛会。 会议将邀请国内外器官移植学界著名专家 、 学者做专题演
讲 ,并就移植免疫的基础与临床研究成果进行交流和讨论 。 参会者同时将获得国家 I类继续教育学分。
一 、征文主题 :器官移植与移植免疫 。
二 、征文内容 : ( 1) 器官移植免疫学的现状与发展趋势 ; (2) 器官移植技术的最新研究进展 ; ( 3) 器官移植免疫耐受研究的成
果与进展 ; (4) 器官移植现代配型方法及其评价 ; ( 5) 新型免疫抑制剂的开发与应用研究 ; ( 6) 免疫抑制剂的临床应用经验。
三 、 征文要求 : ( 1 )50 一 8X() 字的论文摘要 ,打印稿并加盖单位公章 ,附加 3 . 5 英寸软盘 (保存为 研勺记文档 )或将摘要 D m a江至会议秘书处 ( u功 10百s at 巧 @ so hu . c om 或 ij而pe r l多 lj @ nsI n . co m) , 自留底稿不退稿 ; (2) 综述性文章请寄来全文 ; (3 )论文应具有先进性 、科学性 、 实用性 ,并按结构式格式书写 ,顺序为 : 文题 、 作者单位 、 邮政编码 、 姓名 、 目的 、 方法 、 结果 、讨论 、关键词等 ; 同
时欢迎暂无论文但对器官移植感兴趣的基层医院临床医生及从事免疫学教学和科研人员参加会议并交流经验 。
征文截止日期 : 2X(] 3 年 2 月 28 日。
来稿请寄 :南京市长乐路 68 号 ,南京医科大学附属南京第一医院泌尿外科研究室贾瑞鹏博士收。 邮政编码 : 21 《1】拓。 电
话 : 0 25 一 6 242 13 转 别 80 或 83 1 。
会议招展 :会议期间将开展丰富多彩的科技成果展及器官移植相关药品 、 仪器展 ,欢迎各有关厂商在会议期间举办产品
展示 。
论文评选 :本次会议组是中华医学会全国性会议 ,并出版论文集 ,大会组委会将从与会的会议论文中评选出中青年学者
优秀论文并进行奖励。
中华医学会微生物与免疫学分会
南京医科大学附属南京第一医院