全 文 ：麦类作物学报　 2005, 25( 4): 10～ 14
Journa l of T riticeae Crops
　
普通小麦与偏凸山羊草代换系的细胞学和 RAPD鉴定
徐如宏 , 杨英仓 , 任明见 , 张庆勤
(贵州大学麦作研究中心 ,贵阳 550025)
摘　要:为了解偏凸山羊草与普通小麦杂种后代抗白粉病种质 BC5-2的遗传组成 ,对其进行了细胞学和
RAPD鉴定。 结果表明 , BC5-2根尖细胞染色体数目为 2n= 42,花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ ( PM C M Ⅰ )染色
体构型为 2n= 21Ⅱ 。 经核型和 C-分带分析初步证明 BC5-2为偏凸山羊草的双代换系 ,其中一对为偏凸山羊草
的 2MV染色体 ,另一对为 6MV染色体 ,在 BC5-2中被代换的小麦染色体是 1B和 6A染色体。对 BC5-2及其亲
本进行 RAPD分析 ,在 100个随机引物中有 2个引物在 BC5-2中扩增出偏凸山羊草的特异 DN A带 ,它们分别
记为 S2011550、 S20031000,进一步证明 BC5-2是一个普通小麦与偏凸山羊草的双代换系。
关键词: 偏凸山羊草 ; 代换系 ; 核型 ; C-带 ; RAPD
中图分类号: S 512. 1; S 336　　　　文献标识码: A　　　　文章编号: 1009-1041( 2005) 04-0010-05
Cytological and RAPD Anal ysis of Wheat-Ae. ventricosa Substitution Line
XU Ru-hong, YANG Ying-cang, REN Ming-jian, ZAHNG Qing-qin
(Wheat Research Center of Guizh ou University, Guiyang, Guizh ou 550025, China)
Abstract: In this study , the cy tolog y and Random amplified polymorphic DNA( RAPD) w ere performed
to study the genetic component of powdery mildew resistance germplasm BC5-2, w hich deriv ed from the
progeny of Aegilops V entricosa and common wheat. The results show ed: the number of chromosome in
the root tip cells of BC5-2 w as 2n= 42 and the chromosome configuration at PMC M Ⅰ was 2n= 21Ⅱ .
Further analy sis by Karyotype and C-banding pattern indicated that the BC5-2 w as an alien disomic substi-
tution line and the alien chromosomes in BC5-2 were 6MV ( substitute 1B) and 2MV ( substitute 6A) . A-
mong 100 random 10-base primers, tw o of them could amplified the chromosome-specific polymorphic
DN A segment of Aegilops Ventricosa in BC5-2. Then further revealed that BC5-2 is an alien disomic sub-
sti tution line of Aegilops. V entricosa in common wheat.
Key words: Aegilops ventricosa; Substi tution line; Karyo type; C-banding pattern; RAPD
小麦白粉病是由白粉菌 (Erysiphe graminis f. sp. tritici )引起的世界性真菌病害 ,它是普通小麦叶部
病害中危害较为严重的病害之一 [1 ]。我国小麦白粉病菌生理小种的研究始于 20世纪 70年代末 ,到 1995
年 ,有记录的小种已达 60多个 [2 ]。选育抗病品种是防治小麦白粉病危害的最经济有效的措施。不断发掘
和利用新的抗白粉病基因 ,特别是小麦野生近缘植物中的有效抗白粉病基因 ,并将它们转移到小麦的遗
传背景中 ,是小麦遗传育种工作者的当务之急 [3～ 8 ]。
偏凸山羊草 ( Aegilops. Ventricosa, DDMVMV , 2n= 28)是小麦亚族山羊草属中的一种草本植物 ,对小
麦白粉病、锈病等高抗或免疫 ,具有耐盐、抗寒、蛋白质含量高等优良性状 ,是小麦遗传育种的极好种质
资源 [9 ]。 本实验室用硬粒小麦和偏凸山羊草杂交 ,并以普通小麦进行回交 ,在其杂种后代中选育出多个
抗病株系 ,其中的一个后代株系 BC5-2在田间对白粉病和条锈病表现高抗～ 免疫 ,故利用细胞学和
RAPD技术对其遗传组成进行了鉴定。
1　材料和方法
1. 1　材料
供试的普通小麦品种旱优 2号引自中国农科院作物所 ,小麦近缘物种偏凸山羊草 ( Ae. ventricosa, 2n
收稿日期: 2004-12-05　　　　修回日期: 2005-03-04
基金项目: 贵州省小麦“十五”攻关项目 [ ( 2001) 1112, ( 2001) 1115 ]。
作者简介: 徐如宏 ( 1970- ) ,男 ,副教授 ,主要从事小麦抗病 、品质育种研究。
= 4x= 28 DDM
V
M
V )和硬粒小麦 ( Trit icum durum Desf . 2n= 28, AABB)引自中国农科院品资所。其他
材料均由本实验室保存。
利用硬粒小麦与偏凸山羊草杂交 ,得到杂种 F1 ,用普通小麦旱优 2号对杂种 F1进行回交 ,经花粉母
细胞观察 ,选择染色体数在 42～ 44的植株回交 5～ 6代 ,在回交后代中进行体细胞染色体观察 ,鉴定出
一个体细胞染色体数为 42的小麦材料 ,命名为 BC5-2。
1. 2　方法
1. 2. 1　细胞学鉴定　核型和 C-带分析: 将 BC5-2的种子在室温下浸泡至露白 , 4℃冰箱中低温处理 24
h,然后在 26℃条件下发芽 ,根长 1 cm左右时剪取根尖 ,将根尖在冰水混合物中冷冻处理 25 h,然后换
卡诺固定液 (乙醇∶乙酸= 3∶ 1,体积比 ) 4℃固定 1～ 3 d,再用乙酸 -洋红染色和 45%的乙酸分色 ,最后
压片、镜检并照相。进行核型分析时观察 10个细胞 ,以统计体细胞染色体数目 ,核型分析则取 3个细胞
核型数据的平均值。核型分析按照 Levan的标准进行 [ 10]。
在做核型分析的同时选取分裂相好的制片进行染色体 C-带的分析 ,采用的 C-带流程参照 Gill[ 11]的
方法进行 ,略有改动。流程如下:制片冷冻揭盖片后 ,干燥制片于 45%醋酸中 50℃处理 5～ 10 min→同温
度水洗 ,晾干→ 50℃ 5% Ba( OH) 2溶液处理 5～ 8 min→同温度水洗晾干→ 2× SSC溶液 50℃保温 5～
10 min→同温度水洗 ,晾干→ 2. 5% Gimesa染色液染色 15～ 30 min→二甲苯透明→镜检照相保存。
花粉母细胞减数分裂染色体构型分析: 取花粉母细胞处于减数分裂中期Ⅰ 的花药 ,卡诺固定液 (乙
醇∶乙酸= 3∶ 1,体积比 )固定 ,室温条件下用 5 mol /L盐酸解离 3 min,改良卡宝品红染色 ,然后压片、
镜检并照相保存。
1. 2. 2　 RAPD鉴定　 DNA提取参照倪中福等 [12 ]的方法进行 ,略有修改。取单株叶片在含有 1 mL预热
提取缓冲液 ( 100 mmol /L Tris-HCl, 50 mmol /L EDT A, 100 mmol /L NaCl, 1. 0% SDS)的研钵中磨碎后
转至 1. 5 mL的离心管中 , 65℃水浴温育 1小时 ,其间颠倒 2次 ,然后用等体积氯仿-异戊醇 ( 24∶ 1)抽提
10 min,在 10 000 r /min离心 10 min后取出上清液加等体积氯仿 -异戊醇 ( 24∶ 1)重复上述抽提过程 ,最
后取出上清加 2倍体积的预冷无水乙醇沉淀 DNA,挑出 DNA用 70%的乙醇洗 2～ 3次 ,稍干燥后用适
量的 1× TE溶解并保存备用。
1. 2. 3　 RAPD分析　扩增反应液体积为 25μL,其中 10 mmol /L Tris-HCl ( pH 8. 8) , 50 mmol /L KCl,
2. 0 mmol /L MgCl2 , Nonidet P40 0. 08% , 0. 2 mmol /L dN TPs, 1 U Taq酶 , 50 ng 10碱基随机引物 (均
购自上海生工生物工程技术服务有限公司 ) , 20～ 50 ng模板 DNA,加 ddH2O至终体积 25μL, 1滴矿物
油覆盖后 ,反应在 Perkin-Elmer Thermo Cycles 480上进行。筛选引物的反应程序参照刘红彦等 [13 ]的方
法进行 ,略有修改: 94℃预变性 3 min; 94℃ 1 min, 38℃ 1 min, 72℃ 2 min,预扩增 5个循环 ; 94℃ 10 s、
38℃ 1 min、 72℃ 2 min,扩增 35个循环 ;最后 72℃延伸 5 min,反应产物在 4℃保存。
PCR产物经 1%琼脂糖凝胶 (加溴化乙锭 0. 5μg /mL)电泳检测或经 5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电
泳 ( PAGE)银染检测。电泳结果用 UV P凝胶成像分析系统观察照相并保存。
2　结果与分析
2. 1　 BC5-2的细胞学分析结果
分别采用乙酸 -洋红染色法和改良卡宝品红染色压片法对 BC5-2的根尖细胞和花粉母细胞减数分
裂中期Ⅰ ( PMC MⅠ )染色体数目和构型进行了观察。 结果表明 ,其根尖细胞染色体数目为 2n= 42,花
粉母细胞减数 PMC M Ⅰ染色体构型为 2n= 21Ⅱ 。说明这个材料具有良好的细胞学稳定性。
对 BC5-2和回交亲本旱优 2号进行了染色体核型和 C-带的分析 ,结果见图 1～ 4和表 1、表 2。回交
亲本旱优 2号核型公式为: 2n= 6x= 42= 32m+ 10sm ( 4SAT) ,具有 16对中部、 5对近中部着丝粒染色
体 ,其中有 2对随体染色体 ,在染色体组中没有近端着丝粒染色体。
利用旱优 2号的核型和 C-带分析结果 ,以及之前所作的偏凸山羊草核型和 C-带结果 [14 ] ,对 BC5-2
的 C-带研究表明 ,其核型公式为: 2n= 6x= 42= 30m+ 10sm ( 2SAT)+ 2st,其中有 15对中部、 5对近中
部和 1对近端着丝粒染色体 ,其中仅有 1对随体染色体。 从分析结果看 , BC5-2比旱优 2号多 1对近端
·11·4期 徐如宏等: 普通小麦与偏凸山羊草代换系的细胞学和 RAPD鉴定
图 1　 BC5-2体细胞染色体
Fig. 1　 Somat ic chromosomes of BC5-2　　　　　　　　
图 2　旱优 2号体细胞染色体
Fig. 2　 Somatic chromosomes of Hanyou 2
图 3　 BC5-2体细胞染色体 C-带
Fig. 3　 C-banding pattern of
somatic chromosomes of BC5-2
　　　　　　　　　　　　　　　图 4　旱优 2号体细胞染色体 C-带Fig. 4　 C-banding pattern of
somatic chromosomes of Hanyou 2
表 1　 BC5-2染色体组的相对长度与臂比
Table 1　 Chromosome relat ive length
and arm rat io of BC5-2
染色体编号
No. of
chromosomes
相对长度 (% )
Relativ e
length
臂比
Arm ratio
( L /S)
类别
Classif ication
1A 3. 53 1. 85 sm
2A 5. 22 1. 21 m
3A 4. 21 1. 21 m
4A 4. 01 1. 67 m
5A 4. 50 1. 68 m
2M( 6A) 4. 22 1. 91 sm
7A 4. 89 1. 05 m
6M ( 1B) 4. 82 3. 52 st
2B 5. 07 1. 15 m
3B 5. 78 1. 31 m
4B 4. 58 1. 21 m
5B 5. 94 1. 72 sm
6B* 3. 53 1. 83 sm
7B 4. 84 1. 50 m
1D 3. 13 1. 51 m
2D 3. 94 1. 30 m
3D 5. 33 1. 50 m
4D 3. 84 1. 52 m
5D 5. 63 2. 02 sm
6D 3. 53 1. 22 m
7D 5. 31 1. 17 m
注: * 为随体染色体 ,不计算长度。
Note: * m ean satelli te ch romosomes, length of SAT
is not calculated.
着丝粒染色体 ,而少了 1对中部和 1对随体染色体 ,说明
BC5-2为旱优 2号与偏凸山羊草 MV染色体的异代换
系 ,即 BC5-2中含有 2对偏凸山羊草的染色体。 C-带分
析表明 ,其中一对为 2MV染色体 ,另一对为 6MV染色体
(图 3) ,在 BC5-2中被代换的小麦染色体是 6A和 1B染
色体。
2. 2　 BC5-2的 RAPD鉴定结果
以抗白粉病种质系 BC5-2及其亲本旱优 2号、中国
春、节节麦和偏凸山羊草为材料提取 DNA,选用 100个
随机引物进行了 RAPD分析。其中有 3个引物多次扩增
均无扩增产物 ,占总数的 3% ;其余 97个引物均能扩增
出较清晰的 DNA带 ,占总数的 97%。 有 2个引物 ,编号
为 S2011和 S2003,在 BC5-2及偏凸山羊草间扩增的带
型与其它亲本具有多态性差异并且经多次重复结果稳
定。引物 S2003在偏凸山羊草和 BC5-2中扩增出 1条约
1 000 bp的带 ,该带在旱优 2号、中国春和节节麦中没有
出现 (图 5) ; 引物 S2011在偏凸山羊草和 BC5-2中扩增
出 1条约 550 bp的带 ,而该带在亲本旱优 2号、中国春
和节节麦中也没有出现 (图 6)。
因此 S2011550和 S20031000可作为 BC5-2抗白粉
·12· 麦　类　作　物　学　报 25卷
病种质系中偏凸山羊草 ( 6MV、 2MV染色体 )的特异性连锁标记。由此证明在 BC5-2中含有偏凸山羊草
的遗传物质 ,结合细胞学分析结果进一步证明 BC5-2是一个普通小麦与偏凸山羊草的双代换系。
表 2　旱优 2号染色体组的相对长度与臂比
Table 2　 Chromosome relat ive length
and arm ratio of Hanyou 2
染色体编号
No. of
Chromosomes
相对长度 (% )
Relativ e
length
臂比
Arm ratio
( L /S)
类别
Classif ication
1A 3. 21 1. 73 sm
2A 5. 08 1. 17 m
3A 3. 71 1. 38 m
4A 3. 52 1. 57 m
5A 3. 71 1. 70 m
6A 3. 91 1. 02 m
7A 5. 08 1. 17 m
1B* 4. 49 2. 53 sm
2B 5. 08 1. 17 m
3B 5. 78 1. 35 m
4B 4. 69 1. 40 m
5B 5. 08 1. 72 sm
6B* 4. 29 1. 75 sm
7B 4. 49 1. 56 m
1D 3. 32 1. 43 m
2D 4. 30 1. 20 m
3D 3. 91 1. 50 m
4D 3. 71 1. 65 m
5D 3. 99 2. 12 sm
6D 3. 52 1. 25 m
7D 4. 69 1. 18 m
注: * 为随体染色体 ,随体不计算长度。
Note: * m ean satelli te ch romosomes, length of SAT
is not calculated.
3　讨 论
迄今为止已经正式命名的小麦抗白粉病主效基因共
有 42个 (其中包括 18个复等位基因 ) ,分布在 29个染色
体位点上 ,编号从 Pm 1至 Pm 29[15～ 17 ]。其中 Pm7、Pm 8、
Pm 17、Pm20来自黑麦 , Pm12来自拟斯卑尔脱山羊草 ,
Pm 13来自高大山羊草 , Pm 19来自方穗山羊草 , Pm 21
来自簇毛麦 ,其余都来源于小麦属 [18 ]。为了实现抗源多
样化 ,有效地控制白粉病的发生流行 ,不仅要加快现有抗
源转育 ,还要大力拓宽新的抗源。在小麦近缘属植物中鉴
定新的抗白粉病基因并将其转移到小麦中 ,对于促进小
麦抗白粉病育种具有重要意义。
细胞学观察结果表明 , BC5-2的根尖细胞染色体数
目为 42, PMC M Ⅰ 可正常联会成 21个二价体 ,通过
RAPD分析进一步证明在 BC5-2中含有偏凸山羊草遗
传物质 ,是一个普通小麦与偏凸山羊草的双代换系。虽然
经细胞学和 RAPD分析证实 BC5-2是一个双代换系 ,但
关于 BC5-2中的抗白粉病基因是否来源于偏凸山羊草
中的 6MV、 2MV染色体仍不能肯定。因为其亲本之一的
硬粒小麦也具有抗性基因并可能在遗传过程传递到
BC5-2中 ,对此 ,我们需要对 BC5-2中的抗白粉病基因来
源和抗性进行深入的鉴定和研究才能得出结论。不过 ,由于 BC5-2综合农艺性状较好且对白粉病呈成
株期高抗 ,可考虑将其作为抗白粉病基因的桥梁材料应用于抗病育种中。
1. 中国春 ; 2. BC5-2; 3. 偏凸山羊草 ; 4.节节麦 ; 5. 旱优 2号 ; M. 标准 DNA
1. Chinese Spring; 2. BC5-2; 3. Aegilops ventricosa; 4. Aegilo ps squarrosa; 5. Hanyou 2; M . Maker
图 5　引物 S2003扩增的 RAPD图谱
Fig. 5　 Result of RAPD with primer S2003　　　　　　　　　 图 6　引物 S2011扩增的 RAPD图谱Fig. 6　 Result of RAPD with primer S2011
将外源染色体附加或代换到普通小麦遗传背景中育成附加系或代换系是转移外源基因的重要方
式 ,它不仅可用于进一步创造异代换系和易位系 ,同时也可用于物种间染色体组亲缘关系、基因互作、基
·13·4期 徐如宏等: 普通小麦与偏凸山羊草代换系的细胞学和 RAPD鉴定
因表达等遗传研究 [4～ 5 ]。 本研究从旱优 2号与偏凸山羊草杂交后代中鉴定的双代换系遗传背景较为简
单 ,而且农艺性状较好 ,在小麦的遗传改良中具有重要利用价值。本研究利用细胞学、 RAPD分析相结合
的方法进行了异代换系的鉴定 ,提高了结果的可靠性 ,同时获得了异代换系的若干形态和 RAPD标记 ,
为进一步追踪鉴定代换的有关偏凸山羊草染色体提供了有价值的参考信息。
PCR-RAPD技术在植物病害研究中尚处于逐步应用阶段。许多研究表明 , RAPD标记的稳定性和
重现性较差 ,在染色体组大而复杂的六倍体小麦中尤其如此 [19～ 20 ] ,所以 RAPD标记在小麦育种的分子
标记辅助选择中受到一定程度的限制。我们在利用同一引物对同一材料进行扩增时 ,有些非主要条带确
实存在稳定性和重现性的问题。但值得一提的是 ,在我们进行的数十次扩增中 , S2011550和 S20031000
两个片段每次都能稳定地出现。所以 RAPD的稳定性可能与引物性质、扩增条件、电泳条件及目标片段
长短等有关 ,在各项因素都比较合适时 , RAPD仍不失为一种稳定的分子标记。
参考文献:
[1 ]　 Zhang Q S, Li Z S. Presen t status of w heat breeding and related g enetic study in China[ J] . Wheat Inform. Science, 1993, 76: 1— 15.
[2 ]　段霞瑜 ,盛宝钦 ,周益林 . 小麦白粉病生理小种的鉴定及病菌毒性的监测 [ J] . 植物保护学报 , 1998, 25( 1): 31- 35.
[3 ]　胡英考 ,辛志勇 . 小麦抗白粉病基因定位与分子标记 [ J ]. 生物技术通报 , 2000, ( 6): 5- 8.
[4 ]　王洪刚 ,张建民 ,刘树兵 ,等 . 抗白粉病小麦 -中间偃麦草异附加系的细胞学和 RAPD鉴定 [ J ]. 西北植物学报 , 2000, 20( 1): 64— 67.
[5 ]　李丹丹 ,王洪刚 ,刘树兵 ,等 . 抗白粉病小偃麦异代换系的细胞学鉴定和 RAPD分析 [ J ]. 作物学报 , 2003, 29( 4) : 525— 529.
[6 ]　李雪莉 ,郑有良 ,魏育明 ,等 . 小麦抗白粉病优质高产 T1BL /1RS易位系的鉴定与分析 [ J ]. 四川农业大学学报 , 1999, 17( 4): 367—
373.
[7 ]　刘润堂 ,白建荣 ,温琪汾 ,等 . 小麦白粉病抗性基因的导入及 AFL P分析 [ J ]. 植物遗传资源学报 2003, 4( 4): 331— 333.
[8 ]　李　辉 ,陈　孝 ,辛志勇 ,等 . 普通小麦 - 簇毛麦 6DL /6VS抗白粉病易位系的选育及鉴定 [ J ]. 中国农业科学 1999, 32( 5): 9— 15.
[9 ]　张卫兵 ,徐如宏 ,张庆勤 . 硬粒小麦与偏凸山羊草部分双二倍体的核型研究 [ J] . 种子 , 1998, ( 2): 1— 3.
[10 ]　 Levan A, Fredga K, Sandberg A A. Nomencalature for cen tromeric posi tion on ch romosomes [ J] . Hereditas, 1964, 52: 201- 220.
[11 ]　 Gill B S, Friebe B, Endo T R. Standard karyotype and nomenclature system for deseripi tion of ch romosome bands and st ructural aber-
rations in wh eat ( Triticum aestivum ) [ J] . Genom e, 1991, 34: 830- 839.
[12 ]　倪中福 ,张义荣 ,梁荣奇 ,等 . 从 CIMM YT引进的人工合成六倍体小麦 D染色体组微卫星分子标记的遗传差异 [ J ]. 遗传学报 ,
2002, 29( 6): 542- 548.
[13 ]　刘红彦 ,牛永春 ,钟　鸣 . 小麦 RAPD分析中温度循环参数的优化 [ J]. 麦类作物学报 , 2001, 21( 4): 1- 4.
[14 ]　徐如宏 ,张卫兵 ,王　歆 . 偏凸山羊草的核型和 C-带研究 [ J ]. 种子 , 2000, ( 1): 6— 8.
[15 ]　 Jarve K, Peush a H O, Tsymbalova J, et al. Chromosomal location of a Triticum timopheevi eviiderived pow dery mildew resis tance gene
t ransferred to common w heat [ J]. Genome, 2000, 43( 2): 377— 381.
[16 ]　 Mcln tosh R A, Dev os K M, Dubcovsk y J, et al . Catologue of gene symbols for w h eat [ J] . Wheat Information Service, 2001, 93( sup-
pl. ): 40— 60.
[17 ]　段双科 ,许育彬 ,吴兴元 . 小麦白粉病菌致病性和抗病基因及抗病育种研究进展 [ J] . 麦类作物学报 , 2002, 22( 2): 83— 86.
[18 ]　李丹丹 ,王洪刚 ,刘树兵 ,等 . 抗白粉病小偃麦异代换系的细胞学鉴定和 RAPD分析 [ J ]. 作物学报 , 2003, ( 29) 4: 525- 529.
[19 ]　刘志勇 ,孙其信 ,李洪杰 ,等 . 小麦抗白粉病基因 Pm 21的分子标记鉴定和标记辅助选择 [ J] . 遗传学报 , 1999, 26( 6): 673- 682.
[20 ]　陈建莉 , Richard R-C Wang,薛秀庄 ,等 . 用 Langdon二体代换系统建立小麦染色体 RAPD标记 [ J]. 遗传学报 , 1996, 23( 1): 32—
39.
·14· 麦　类　作　物　学　报 25卷