全 文 ：第 28卷　第 1期 西北农业大学学报 Vol. 28 No. 1
2000年 2月 Ac ta Univ . Ag ric. Bo reali-occidentalis Feb. 2000
[文章编号 ]1000-2782( 2000) 01-0006-05
导入大赖草 DNA小麦后代的变异性状分析⒇
朱新产 ,廖祥儒 ,付增光
(西北农业大学分子生物学研究室 ,陕西杨陵 712100)
　　 [摘　要 ]　外源大赖草 DN A直接导入普通小麦 ,诱导小麦籽粒蛋白质组成及过氧化物
酶、酯酶、超氧化物歧化酶同工酶谱带发生了显著变化 ,蛋白质分别增加 44, 67, 85 ku新组
分 ,蛋白质和氨基酸含量分别提高 16. 82% , 15. 62% ,赖氨酸增长 42. 94% ,同工酶不同程度
出现了差异谱带 ,酶带缺失 ,酶活性增减的明显变化。 导入 DNA的变异小麦的籽粒色泽、硬
度、胚乳粉质等生物学性状都有一些改变 ,其变异现象在连续后代中依然表达。
[关键词 ]　小麦 ;大赖草 DN A;外源 DNA导入 ;蛋白质 ;同工酶
[中图分类号 ]　 Q343. 1+ 5　　　 [文献标识码 ]　 A
小麦的麦谷蛋白赋予面团弹性 ,醇溶蛋白赋予面团延伸性 ,弹性和延伸性是决定优良
加工品质的重要基础 [1, 2 ]。小麦加工品质的优劣与限制小麦品种品质遗传潜力的麦谷蛋白
质种类密切相关 ,特别是位于 1A, 1B, 1D染色体上 3个基因位点控制的高分子质量麦谷
蛋白亚基 ,它们对加工品质有不同的贡献 [3, 4 ]。小麦籽粒蛋白中所含人体必需氨基酸 ,尤其
是赖氨酸含量相对较低 ,其营养价值并不理想。 70年代以来已有小麦×豌豆 [5 ]、小麦×玉
米 [6 ]、小麦×高粱 [7 ]等小麦和异属植物远缘杂交研究 [8～ 11 ]。利用生物技术与传统育种方法
相结合 ,探究改良、培育、创造优质小麦新品种 ,不仅能促进分子育种研究 ,而且能丰富远
缘杂交遗传理论。本研究应用转基因技术将大赖草 DNA直接导入小麦 ,以期改良小麦的
某些生物学性状。
1　材料和方法
1. 1　材　料
　　大赖草 (Leymus racemosus ) ,由西北植物研究所遗传工程实验室提供 ,普通小麦
( Triticum aest ivum )超大穗类型 ,由西北农业大学农学系育种室提供。
1. 2　方　法
1. 2. 1　 DN A提取　取大赖草生长锥部组织 ,加液氮研磨成细粉 ,用热酚、氯仿-异戊醇法
提取分离 DNA,经岛津 UV-120紫外仪检测 , A260 /A280= 1. 893, A260 /A230= 2. 173,琼脂糖
电泳呈单一区带 ,表明提纯的 DNA达到导入作物所需的要求 [12, 13 ]。
1. 2. 2　导入 DNA试验　玻璃温室中盆栽小麦 ,每盆栽培 5株 ,在小麦返青期 ,向其分蘖
⒇ [收稿日期 ]　 1999-03-09
[基金项目 ]　陕西省自然科学基金资助项目 ( 99 SM05)
[作者简介 ]　朱新产 ( 1959- ) ,男 ,博士
节注射大赖草 DNA 10μL( 4～ 5 g /L) ,套袋 ,单穗收获 ,分别进行检测分析 ,变异株连续
种植 ,并进行相关的测试鉴定。
1. 2. 3　小麦籽粒蛋白质 SDS-PAGE　采用赵文明等 [1 4]的方法。
1. 2. 4　全氮量测定　用日本 Vs-K TP自动定氮仪 ,分析小麦籽粒全氮量。
1. 2. 5　氨基酸含量测定　用贝克曼 121-MB型氨基酸自动分析仪分析氨基酸含量。
1. 2. 6　同工酶 PAGE分析　参照薛应龙 [15 ]的方法 ,取小麦幼苗分蘖节部位 0. 5 g ,冰浴
中加 3 mL Tris-HCl( pH 8. 0)缓冲液 ,研磨提取酶 , 0～ 4℃离心 ,上清液即酶制备液 ,定量
点样每槽 20μL。 电泳胶片用日本岛津 Cs-930型双波长自动扫描仪扫描 ,过氧化物同工
酶和酯酶同工酶分别用波长 370和 525 nm ,超氧化物歧化酶采用反向扫描 ,波长 600 nm。
2　结果与分析
2. 1　变异小麦籽粒蛋白质构成
　　图 1表明 ,直接导入 DNA的变异小麦籽粒的蛋白质构成发生了显著变化 ,与对照小
麦相比较 ,变异小麦 M1新增加 85 ku蛋白组分 ; M2新增加了 44, 67 ku蛋白组分 , 36～
图 1　变异小麦种子蛋白 SDS-PAGE
P.豌豆 (示分子质量 ) ; CK.对照 ;
M 1, M 2.变异小麦 ,下图同。
67 ku蛋白质组分谱带型出现较大变化 (迁移
率 ) ,数目增多 ,含量也相对增高 ,这表明向小麦
直接导入外源基因能够诱导种子蛋白质发生重
大变异 ,改变小麦籽粒蛋白质的构成。
2. 2　变异小麦籽粒蛋白质和氨基酸含量
由表 1看出 ,直接导入 DNA的变异小麦籽
粒蛋白质和氨基酸含量出现明显不同 ,变异小
麦 M2变化最大 ,其蛋白质、赖氨酸、总氨基酸含
量分别增长 16. 82% , 42. 94%和 15. 62% ,这与
蛋白质组分数增加相一致。
表 1　变异小麦籽粒蛋白质、
氨基酸含量的变化 mg· g- 1
处理 蛋白质 赖氨酸 总氨基酸
CK 141. 5 3. 40 118. 75
M 1 150. 1 3. 69 125. 11
Δ 8. 6 0. 29 6. 36
M 2 165. 3 4. 86 137. 30
Δ 23. 8 1. 46 18. 55
　注: CK为对照 ; M1 , M2为变异小麦 ;Δ为增长值。
2. 3　变异小麦同工酶
图 2表明 ,直接导入 DNA的变异小麦的同工酶谱及活性与对照相比表现出较大差
异 ,其中过氧化物同工酶 ( POD)的谱带数及活性增加甚大 ,特别是 M2变异小麦 ,酶谱带
数增加 4条 ,相对活性提高 2. 147倍 ,与其蛋白质变化相一致 ;酯酶同工酶 ( EST) , M1变
异小麦增加 3条 ,活性相对提高 1. 66倍 ,而 M2变异小麦的酶谱带数和活性有所减少 ;超
氧化物歧化酶 ( SO D) , M1变异小麦酶谱变化甚小 ,而 M2变异小麦新增 2条酶带 ,但又有
7第 1期 朱新产等:导入大赖草 DNA小麦后代的变异性状分析
3条谱带消失 ,类似于其 EST的变化。
图 2　变异小麦同工酶电泳图谱 ( PAGE)
2. 4　变异小麦籽粒形态
直接导入 DNA的变异小麦籽粒与对照小麦相比有所不同 ,其 M1变异小麦籽粒型态
差别甚少 ,而 M2变异小麦籽粒颜色发红加深 ,硬度和胚乳粉质透明度增强 ,但其植株形
态在外观上都无多大变化。
3　讨　论
整体染色体结构的亲缘关系愈远 ,同源性愈小 ,从进化角度来看 ,部分基因间的结构
有可能保持一定的亲和性而发生杂交重组 [16, 17 ]。小麦返青期正值幼穗分化、细胞分裂 ,体
内代谢旺盛 , DN A大量合成 ,外源 DNA的导入容易参与体内 DNA的复制或重组过程 ,
或修饰调控基因 ,激活或抑制本身结构基因的表达 ,诱发其蛋白质构成发生变异 ,本研究
直接导入 DNA的变异小麦的蛋白质和同工酶谱变化 ,正是其验证。
选育作物优质新品种的前提是遗传变异 ,遗传变异来源于双亲间的 DNA交流 ,远缘
亲本间的性状交流可获得良好的品质育种效果 ,然而这种交流方式在远缘杂交中存在着
很大的限制性 ,尤其是受多基因家族控制 ,由多基因编码的种子贮藏蛋白质 [ 18 ] ,寻找和获
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得特定目的基因也是比较困难的 ,但通过外源 DNA直接导入 ,可较方便的诱导种子蛋白
发生变异 ,克服远缘杂交不亲和性的障碍 ,打破基因连锁关系 ,改良小麦营养品质及生物
学性状。本研究结果表明 ,导入 DNA的变异小麦籽粒的蛋白质、氨基酸含量都得到提高 ,
其营养价值有所改良 (赖氨酸含量的增高 )。
酶是基因和性状的联接物 ,因此 ,同工酶是从分子水平鉴别遗传变异或基因转移的一
种有效手段 ,可作为基因表达的一种良好标志。直接导入 DNA的变异小麦不同程度地出
现了 PO D, ES T和 SOD同工酶的差异酶带 ,酶带缺失、酶活性增强及酶活性减弱等现象 ,
证明直接导入的 DNA有可能引起调控代谢系统的改变或调控某些基因的表达。
外源 DNA转移的途径多种多样 ,其效果各不相同 ,并且程序大都较复杂。本研究结
果表明 ,简单、直接向小麦注射外源 DNA能有效地引起基因表达的变化 ,改良其生物学
特性 ,并且在连续种植的后代中 ,这些变异性状依然表达 ,稳定保持 ,但引起此变异现象的
分子作用机制还不清楚 ,其分子验证仍待深入研究。
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9第 1期 朱新产等:导入大赖草 DNA小麦后代的变异性状分析
An analy sis of v ariation characteris tics of the
progenies deriv ed from introducing leymus
racemosus gene into common wheat
ZHU Xin-chan, LIAO Xiang-ru, FU Zheng-guang
(Laboratory of Plant Molecularly B iology ,Northwestern Agr icul tural Un iversity, Yangl ing , Shaan xi 712100,China )
Abstract: Exogenous DN A direct ly int roduced into w heat plant induced striking
change in seed pro tein components of wheat and iso zymog ram o f pero xidase isozyme
( POD) , esterase iso zyme ( EST ) and superoxide dismutase ( SOD) . The proteins in-
creased by 44 ku, 67 ku, 85 ku new compoents, and the protein and amino acid contents
enhanced by 16. 85% and 15. 62% separately , Ly s increased by 42. 94% . Iso zyme also
show ed di fference isozyme bands, lo sing isozyme bands and increase and decrease of en-
zyme activi ty in varying deg rees. Some bio-characteristics of v ariant g rains deriv ed f rom
int roducing exogenous DN A into common wheat , such as colour, ha rdness, endosperm
trasparency etc, also show ed rema rkable changes. These variations can be stably ex-
pressed in successiv e pro genies.
Key words: wheat; leymus recemosus gene; ex ogenous DN A introduction; pro tein;
isozyme
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