全 文 ：第 34卷　第 6期
2010年 11月
南京林业大学学报(自然科学版)
JournalofNanjingForestryUniversity(NaturalScienceEdition)
Vol.34, No.6
Nov., 2010
htp://www.nldxb.com
　收稿日期:2009-12-07　　　　修回日期:2010-09-13
　基金项目:浙江省自然科学基金项目(Y3090091);浙江林学院博士启动基金(2008FR021);南京林业大学 “十一五 ”人才工程项目
　作者简介:张启香(1975—),副教授 ,博士。 ＊方炎明(通信作者),教授。 E-mail:afang200202@yahoo.com.cn。
　引文格式:张启香 ,胡恒康 , 方炎明.铁线莲 `Multi-Blue体细胞胚诱导和植株再生 [ J].南京林业大学学报:自然科学版 , 2010,
34(6):18-22.
铁线莲 `Multi-Blue体细胞胚诱导和植株再生
张启香1, 2 ,胡恒康 3 ,方炎明 1＊
(1.南京林业大学森林资源与环境学院 , 江苏　南京　210037;2浙江农林大学林业与生物技术学院 ,
浙江　临安　311300;3.江西农业大学园林与艺术学院 , 江西　南昌　330045)
摘要:以铁线莲品种`Multi-Blue的茎尖为外植体 , 1/2MS为基本培养基 ,进行胚性愈伤组织和体
细胞胚的诱导及植株再生条件的选择。结果表明:茎尖外植体在 1/2MS+TDZ(1.0 mg/L)+
NAA(0.5 mg/L)+2 %蔗糖 +0.7 %琼脂的固体培养基中培养时可形成淡黄色块状至颗粒状愈
伤组织 ,经继代培养后可逐渐形成胚性愈伤组织;体细胞胚诱导以 1 /2MS+TDZ(0.2 mg/L)+
IBA(0.1mg/L)+ABA(0.3mg/L)+CH(0.5g/L)为佳 ,诱导率可达 96%;而适宜的体细胞胚萌
发培养基为 1 /2MS+6-BA(0.2 mg/L)+IBA(0.05 mg/L)。体胚再生植株经驯化后 ,移栽成活
率可达 80%以上 。
关键词:铁线莲`Multi-Blue ;体细胞胚;植株再生
中图分类号:S718　　　　文献标志码:A　　　　文章编号:1000-2006(2010)06-0018-05
EmbryogenesisandplantregenerationofClematis` Multi-Blue
ZHANGQi-xiang1, 2 , HUHeng-kang3 , FANGYan-ming1＊
(1.CollegeofForestResourcesandEnvironment, NanjingForestryUniversity, Nanjing210037, China;2.Schoolof
ForestryandBiotechnology, ZhejiangA＆FUniversity, Linan311300, China;3 ColegeofLandscape
ArchitectureandArt, JiangxiAgricultureUniversity, Nanchang330045, China)
Abstract:UsingstemtipofClematis`Multi-Blue asexplantsand1/2 MSasculturemedia, thesuitableconditionsfor
inductionofembryogeniccalusandsomaticembryos, aswellasplantregeneration, weredetermined.Theresultsindica-
tedthattheoptimalconditionsforinductionofembryogeniccaluswere1/2 MSsupplementedwith1.0 mg/LTDZ,
0.5mg/LNAAand2% scourseplus0.7% agar.Explantsculturedinthissolidmediumcouldformyelowmassiveor
granularcalusandproducedembryogeniccallusaftersubculture.Suitablemediaforsomaticembryoinductionwere1/2
MSaddedwith0.2 mg/LTDZand0.1mg/LIBAplus0.5 g/LCH, withaninductionrateof96%.Thegermination
rateofsomaticembryoswasthehighestwhentheplantgrowthregulatorswere0.2mg/L6-BAand0.05 mg/LIBA.The
plantletswithrootweresuccessfullytransplantedtothemediumwithvermiculite.Thesurvivalrateofregenerationplant
couldbeuptoatleast80 %.
Keywords:Clematis`Multi-Blue ;embryogenesis;plantregeneration
　　铁线莲属(ClematisL.)大多为常绿或落叶的
多年生木质藤本植物 ,花大色艳 ,花型多变 ,花期
长 ,园艺用途广泛 ,观赏价值高 ,是非常优良的垂
直绿化材料 , 在国外的垂直绿化中具有重要地
位 。该属植物也具有较高的药用价值 [ 1] ,是我国
许多中医临床和民间常用的利尿通淋或祛风止痛
类药物 。由于铁线莲属植物多数存在结实少或萌
发时间长 、发芽率低等问题 ,不宜采用有性繁殖 ,
园林栽培应用受到限制 。为了扩大铁线莲属植物
优良栽培品种的繁殖以及育种平台的建立 ,国内
外学者陆续开展了相关研究:Leifert等 [ 2]使用 1 /
2MS培养基对 C.montana`Rubens进行培养获
得丛生芽 。Mitrofanova等 [ 3]对体细胞胚胎发生和
器官发生途径所获得铁线莲属植物的亲缘关系进
行了较详细的研究 。倪新等 [ 4]报道了红花铁线
莲茎 、叶及花梗等外植体的愈伤组织和植株再生
　第 6期 张启香 ,等:铁线莲`Multi-Blue 体细胞胚诱导和植株再生
并获得了大量的分化苗 。泽仁旺姆等 [ 5] 对甘青
铁线莲(C.tangutica)进行了组织培养研究 ,解决
了该植物种子萌发时间长 、发芽率低等问题 ,大
大提高了繁殖率 。张启香等 [ 6]对铁线莲 `Multi-
Blue 组织培养后发现 , 1 /2MS为茎尖培养的最
佳培养基 。铁线莲 `Multi-Blue是由荷兰引进的
一个优良的铁线莲属植物的杂交栽培品种 ,为铁
线莲 `ThePresident 的变种 , 1983年注册于荷
兰 ,其萼片 、雄蕊均花瓣状 , 具有较高的观赏价
值 ,有性繁殖很难产生可育的种子 ,且种子难以
保持该品种母本的优良性状 [ 7] ,生产中通常对其
进行扦插繁殖 ,但繁殖系数较低 。笔者以铁线莲
`Multi-Blue的茎尖为外植体进行组织培养 ,获得
体细胞胚培养体系 ,以期为铁线莲属植物新品种
培育及转基因工作的开展提供参考 。
1　材料与方法
1.1　材料
供试材料为南京林业大学树木园内种植的铁
线莲`Multi-Blue ,该品种 2004年 5月从荷兰引
进 ,取当年萌发新枝的茎尖作为试验外植体。
1.2　处理及诱导方法
剪取铁线莲 `Multi-Blue当年萌发新枝的茎
尖 ,依次进行自来水冲洗 2 h、70 %乙醇灭菌 30 s、
无菌水冲洗 3 ～ 4次 、稀释 10倍的 NaClO灭菌
20 min并抽真空 、无菌水冲洗 5次后 ,用灭菌滤纸
吸干表面水分 ,接入配制好的培养基中[ 8] 。基本培
养条件:1 /2MS为基本培养基 , 蔗糖质量浓度
20 g/L,琼脂质量分数 0.7 %, pH=5.7, 温度
(25±1)℃, 光照 /黑暗 (光照 16 h/d, 光照度为
2 400 lx)条件下培养。
(1)胚性愈伤组织诱导。采用 TDZ和 NAA进
行正交试验 ,共设置 16个处理 ,每因素设 4个水
平 ,每个处理 10瓶 ,每瓶接种 2个茎尖 ,重复 3次。
诱导率 =(诱导出胚性愈伤组织外植体的数量 /接
种外植体的数量)×100%, 6周后统计诱导率。
(2)体细胞胚诱导 。对生长调节物质和复合
添加物的种类及水平进行优化筛选 ,采用 TDZ、
IBA、ABA和 CH(水解酪蛋白)进行正交试验 ,每因
素设 4个水平 ,共设置 16个处理 ,每处理 10瓶 ,每
瓶接种 2 ～ 4块胚性愈伤组织 ,重复 3次 ,进行铁线
莲 `Multi-Blue 体细胞胚的诱导 , 6周后统计诱
导率。
(3)体胚发育与植株再生。以 1/2MS为基本
培养基 ,生长调节物质选用 6-BA(0、0.2、0.4和 0.6
mg/L)和 IBA(0、0.01和 0.05 mg/L)进行完全组
合 。每个处理 10瓶 ,每瓶接种 4个体胚 , 重复 3
次 。光照条件下培养 (光照 16 h/d, 光照度为
1 500 lx), 30 d后转移至新鲜培养基中 , 6周后统
计出苗率。
1.3　数据处理
采用 EXCEL和 SigmaPlot8.0系统软件对实验
数据进行统计分析 ,实验数据均为 3次重复的平
均值。
2　结果与分析
2.1　植物生长调节物质对铁线莲 `Multi-Blue胚
性愈伤组织诱导的影响
　　实验发现 ,茎尖接入诱导培养基后约 15 d开始
启动(图 1-1),长出的愈伤组织淡黄色 ,晶莹 、透明
(图 1-2)。 25 d左右出现少许褐变 ,经继代培养
后 ,褐变停止 ,并开始长出黄绿色 、快速增殖的胚性
愈伤组织(图 1-3)。显微镜下观察发现:非胚性愈
伤组织结构松散 ,细胞较大 ,胞间隙明显;而胚性愈
伤组织细胞多为圆球状 ,细胞质浓 ,细胞核较大 ,胞
间隙小 ,结构紧凑。生长调节物质的种类及配比对
胚性愈伤组织的诱导及生长有较显著的影响(表
1),尤其是 TDZ对胚性愈伤组织的诱导起着至关重
要的作用。当 TDZ浓度为 0时 , 4个处理(A1、A2 、
A3、A4)下胚性愈伤组织的诱导率均低于 20%,随着
TDZ浓度的提高诱导率明显升高 ,当 TDZ的质量浓
度为1.0mg/L时达到最高(图 2),然后随着浓度提
高诱导率下降 ,说明过高浓度的 TDZ对铁线莲的胚
性愈伤组织诱导产生了一定的抑制作用。当 TDZ
为 1.0 mg/L时 , 4个处理(A9 、A10 、A11 、A12)的诱导
率较高 ,其中 A10处理诱导率最高 ,达 90.0 %,而且
胚性愈伤组织形成速度较快 ,生长良好。当 TDZ质
量浓度为0.5mg/L时 ,胚性愈伤组织形成速度较慢 ,
诱导率低 ,其中 A7处理有褐化现象。而当 TDZ质
量浓度增加至 1.5 mg/L时 ,愈伤组织产生速度较
快 ,但胚性愈伤组织诱导率较低 ,褐化现象较严重 ,
愈伤组织结构疏松。方差分析表明 ,诱导率以 TDZ
的作用最为明显 ,且 TDZ各水平之间存在极显著差
异 ,诱导率随着浓度的升高而呈先升高后降低的变化
趋势。而 NAA各水平之间存在显著性差异(图 2)。
由进一步多重比较结果可以看出 , A10与其他
处理均存在极显著差异 ,而且愈伤组织形成快 ,诱
导率高 ,愈伤组织呈透明状 。根据统计结果按诱导
率均值进行优选 ,以 A10处理 ,即 1.0 mg/LTDZ和
0.5mg/LNAA组合处理最优 。
19
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 34卷
图 1　铁线莲`Multi-Blue体细胞胚诱导和植株再生
Fig.1　EmbryogenesisandplantregenerationofClematis`Multi-Blue
　　注:1.茎尖接种后 2周;2.从茎尖诱导的愈伤组织;3.胚性愈伤组织;4.体胚从愈伤组织中发生;5.鱼雷胚;6.子叶胚;7.体胚萌发;8.幼
苗;9.再生植株移栽。
表 1　不同生长调节物质对铁线莲`Multi-Blue 胚性愈伤组织诱导的影响
Table1　EffectsofdifferentplantgrowthregulatorsonembryogenesiscallusofC.`Multi-Blue
处理
treatment
生长调节物质 /(mg·L-1)
plantgrowthregulatorconcentration
TDZ NAA
诱导率 /%
inductionrate
处理
treatment
生长调节物质 /(mg·L-1)
plantgrowthregulatorconcentration
TDZ NAA
诱导率 /%
inductionrate
A1 0.0 0.0 0.00±0Ml A9 1.0 0.0 73.47±0.47Cc
A2 0.0 0.5 16.67±1.65Ji A10 1.0 0.5 90.00±1.0Aa
A3 0.0 1.0 14.00±0.14Kj A11 1.0 1.0 78.00±0.6Bb
A4 0.0 2.0 10.87±0.13Lk A12 1.0 2.0 66.00±1.5Dd
A5 0.5 0.0 57.14±0.86Fe A13 1.5 0.0 45.83±0.8Hg
A6 0.5 0.5 65.96±0.04Dd A14 1.5 0.5 65.22±0.22Dd
A7 0.5 1.0 64.00±1.0DEd A15 1.5 1.0 58.00±1.0Fe
A
8 0.5 2.0 50.00±1.5Gf A16 1.5 2.0 41.30±0.3Ih
　　注:同一列中小写字母不同者示差异显著(p<0.05);大写字母不同者示差异极显著(p<0.01)。
2.2　植物生长调节物质及复合添加物对铁线莲
`Multi-Blue体细胞胚诱导的影响
　　当 TDZ浓度较低时 ,体细胞胚诱导率随其浓度
升高而增加 ,当质量浓度为 0.2 mg/L时诱导率达到
最高 ,为 36.25%,然后随着 TDZ浓度升高 ,诱导率
逐渐降低且材料易玻璃化 , 0.2mg/L与其余处理间
存在极显著差异(图 3)。当 IBA为 0.1mg/L时 ,诱
导率为 39.33%,且与其他处理间存在极显著差异 。
添加低浓度的 ABA有利于铁线莲`Multi-Blue体细
胞胚的增殖 ,当质量浓度为 0.3 mg/L时 ,增殖系数
最高。水解酪蛋白(CH)对铁线莲 `Multi-Blue体细
胞胚的增殖具有明显影响 ,质量浓度为 0.5g/L时
效果最好 ,与其余处理存在极显著性差异(图 3)。
对各处理进行方差分析及多重比较结果显示 , TDZ
(0.2 mg/L)+IBA(0.1mg/L)+ABA(0.3mg/L)+
CH(0.5 g/L)处理与其余处理之间存在极显著差
20
　第 6期 张启香 ,等:铁线莲`Multi-Blue 体细胞胚诱导和植株再生
图 2　TDZ和 NAA浓度对铁线莲`Multi-Blue胚性愈伤
组织诱导的影响
Fig.2　EffectsofTDZandNAAoninductionofsomatic
embryos
异 ,增殖系数最高达到 96 %。因此 , C.`Multi-Blue
体细胞胚的诱导 、增殖培养基以该处理为最佳选择 ,
即 1 /2MS+TDZ(0.2 mg/L)+IBA(0.1 mg/L)+
ABA(0.3mg/L)+CH(0.5 g/L)。
图 3　不同浓度植物生长调节物质对铁线莲`Multi-Blue体
细胞胚诱导的影响
Fig.3　EffectsofTDZ, IBA, ABAandCHonmultiplica-
tionofsomaticembryosofC.`Multi-Blue
2.3　铁线莲 `Multi-Blue体细胞胚的发育与植株
再生
　　胚性愈伤组织形成体细胞胚经继续培养即可萌
发 (图 1-4),大部分体细胞胚能经类似合子胚的球
形胚 、心形胚 、鱼雷胚(图 1-5)以及子叶形胚时期
(图 1-6)并大量萌发(图 1-7),进而形成再生植株
(图 1-8、1-9)。实验结果显示 , 1/2MS+6-BA
(0.2mg/L)+IBA(0.05 mg/L)处理效果最佳 ,出苗
快 ,苗粗壮 ,幼苗叶色嫩绿 ,出苗率达 86.81%。
2.4　再生植株的移栽及管理
体胚萌发后 ,当瓶苗长至 2cm高 ,且根叶发达
时 ,从瓶中取出洗去幼苗根部培养基 。采取体细胞
胚出苗后苗木发育阶段控制和生理胁迫相结合的
方法 ,移栽成活率可达到 80 %。移苗基质有珍珠
岩 、蛭石 、营养土等 。移栽的小苗 1周内其生长环境
的空气湿度须保持在 95% ～ 100%,此时可开始进
行叶面施肥 ,成活后则进行适当的根部施肥。 1个
月内的管理要求特别细致 ,并且注意湿度与温度的
协调。
3　讨　论
目前 ,国内对铁线莲属植物的研究大多局限在
其分类 、种质资源分布等 ,对野生种的引种 、驯化 、
繁殖 、选育等的应用研究报道较少 [ 9-10] 。该研究
在铁线莲 `Multi-Blue体胚发生初步研究的基础
上 ,进一步优化体胚发生条件 ,并成功完成植物再
生 。在前期研究中 ,笔者曾以 2, 4-D来诱导体胚发
生 ,但实验材料褐化较严重 ,导致实验失败 ,所以改
用 NAA、IBA等生长素类物质来诱导体胚发生。此
次实验中选用生长素类物质为 IBA,与张启香等 [ 6]
在体细胞胚诱导时选用的 NAA不同 ,分析发现其
诱导效应也不同 , 说明生长素类物质对铁线莲
`Multi-Blue体胚诱导有较显著的影响。铁线莲
`Multi-Blue体细胞胚诱导的过程中 ,不同部位的
外植体来源和不同培养条件下产生的愈伤组织颜
色和质地均有所区别 ,其中以茎尖诱导的块状至颗
粒状愈伤组织为最佳 ,且能发育成正常植株 ,但其
培养周期较长 ,这与 Mandegaran[ 11]以 C.integrifolia
L.×C.viticelaL.的节间为外植体进行组织培养获
得体细胞胚的结果相类似。与 HanumanaikaRaja
Naika等 [ 12]以 ClematisgourianaRoxb.的茎段为外
植体进行培养不同 ,该实验中适合胚性愈伤组织诱
导的最佳细胞分裂素为 TDZ,而非 BA。培养过程
中 ,外植体易出现玻璃化现象 ,一旦发生很难逆转。
一般认为 ,适当降低培养基中 NH4 +有利于抑制玻
璃化苗的产生 [ 12] ,试验发现 ,降低培养基中的盐
浓度(如 1 /2MS)以及增加培养基中琼脂的含量
能有效缓解此症状 。胚性愈伤组织形成体细胞胚
后 ,大部分体细胞胚能经类似合子胚的球形胚 、
心形胚 、鱼雷胚以及子叶形胚时期发育成熟并形
成再生植株 ,但也有部分胚性愈伤组织转变为非
胚性愈伤组织或形成畸形体细胞胚 ,不能正常发
育 ,所以在胚性愈伤组织形成后 ,需及时调整激
素种类及配比以利于体细胞胚的形成和发育 。
ABA是植物中最为重要的激素之一 ,它与种子休
眠 、根系发育 、叶片枯萎 、抗旱反应等生理过程都
有极为密切的关系 [ 13] 。研究表明 ,内源 ABA与
植物体胚发生存在一定的相关性 [ 14] 。该研究中 ,
ABA的添加有利于体细胞胚的增殖 ,其原因可能
是外源 ABA引起体细胞胚的内源 ABA发生变
化 ,从而使体细胞胚重新脱分化并使体细胞胚增
21
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 34卷
殖 ,但不同质量浓度的 ABA处理效果差异显著 ,
以 0.3 mg/L效果最佳 , 说明体细胞胚增殖与
ABA浓度间存在剂量效应 ,这与王清连等 [ 15] 在
棉花中的研究结果一致 。
以铁线莲 `Multi-Blue的侧芽茎尖为外植体
进行胚性愈伤组织及体细胞胚的诱导 ,在适合的条
件下体细胞胚能正常发育及成熟 ,成功获得了由体
细胞胚萌发的再生植株且移栽成活 ,为铁线莲属植
物进行分子育种提供了良好的理论基础。但体细
胞胚形成的数量较少 ,体细胞胚的发生及其同步化
调控技术的机理仍需进一步研究。
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(责任编辑　郑琰燚)
22