全 文 ：作者简介:王涛(1979 -),男 ,硕士 ,主要从事药物学的教学 、研究工作。
Em ai l:w angtaom ary@ zzu. edu. cn
菝葜乙酸乙酯提取物抗癌机制研究
王　涛 ,杨华山
(郑州大学护理学院 ,河南 郑州 450052)
摘要:目的　菝葜属百合科植物 ,为一种常用中药 , 目前所用的菝葜提取物多为其 40%的乙醇提取物 , 本实验室首创了菝葜的乙酸
乙酯提取工艺并对其进行了抗癌活性研究 ,旨在探讨其抗肿瘤作用及机制 。方法　流式细胞仪分析菝葜乙酸乙酯提取物对肿瘤细
胞细胞周期的影响;用荧光显微镜和琼脂糖凝胶电泳观察菝葜乙酸乙酯提取物诱导细胞凋亡的作用。结果　菝葜乙酸乙酯提取物
可有效抑制肿瘤细胞的增殖 ,并通过对肿瘤细胞直接杀伤和促进肿瘤细胞凋亡来发挥作用。结论　菝葜乙酸乙酯提取物具有抗肿
瘤作用 , 有进一步开发的价值。
关键词:菝葜;抗肿瘤;细胞凋亡
中图分类号:R730.52　　文献标识码:A　　文章编号:1673 - 5412(2007)02 - 0129 -03
Expe rimen tal S tud ies on Anti-Tumor E ffects of Sm ilax China L Extract o fE thy laceta te
W ang Tao, Yang Huashan
(Nursing College of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China)
Abstrac t:Objec tive　Chine se he rb Sm ilax China L (SCL) is a liliaceous p lant w hich is in comm on use. Now, the preparations o f Sm ilax
are usually ex trac ted by 40% e thano l, we w ere invented a new m eans to ex tract the effec tivem a te rial in Sm ilax and m ade much research on
it’ s ac tion of an ti-cance r. This study was designed to inve stiga te the an ti-cancer ac tiv ity o f SCL ex tract by ethy lace tate and the re lated m echa-
nism . Methods　The effec t o f SCL ex trac t on tum o r ce lls pro liferation, cell cycle d istribution and apop to sis inducing we re de te rm ined by
m ouse m ode l and ce llmo lecu lar bio log icalm e thods includingMTT assay, aga rose ge l e lectropho re sis, flow cytome try and Hoechst 33342 /P I
fluore scen t staining. Resu lts　SCL extract show ed pro life ra tion inhibition on severalm ouse tumo r ce lls and HepG 2 ce lls by k ill tum o r ce lls di-
rec tly and induc ing apoptosis. Conclu sions　SCL show ed pro liferation inh ibition on seve ra l tum or, and further studies on this effec t w ill be
proceeded.
K ey words:Sm ilax China L;anti-tum o r;apoptosis
　　菝葜(Sm ilax China L)又名金刚藤 、金刚刺等 ,属
百合科植物 ,为一种民间常用药物。千百年来 ,广泛应
用于祛风湿 、利小便 、消肿毒 、治疗关节炎 、水肿 、镇痛
等 ,疗效确切 [ 1] 。国外还将其用于过敏性哮喘 、牛皮
癣等的治疗 。目前 ,作者尚未见国内外有关菝葜抗肿
瘤的系统报道。
为进一步提高传统中药菝葜治疗多种疾病的疗效
的样标含量 ,富集有效成分 ,使根据其制成的各类药物
成为真正符合三少 、三效 、五方便要求的现代中药 ,本
实验室率先改进了菝葜的提取工艺 (已申请专利 )。
经研究表明 ,菝葜乙酸乙酯提取物为其治疗多种疾病
的最有效成份。作者通过对其进行体内 、体外抗肿瘤
的研究 ,发现菝葜的乙酸乙酯提取物可以在体内外有
效抑制多种肿瘤细胞的生长 ,如:小鼠肿瘤细胞 S180 、
EAC、H22及人肝癌细胞 HepG2。本文探讨了菝葜乙酸
乙酯提取物抗肿瘤作用的相关机制 ,该研究有望拓宽
传统中药菝葜的应用范围 。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
1. 1. 1　细胞株　肝癌细胞株 HepG 2由华中科技大学
同济医学院公共卫生学院提供 。用含体积分数 10%
胎牛血清 、100u /mL青霉素 、100μg /mL链霉素的 RP-
M I-1640培养基 ,在 37℃ 5%CO 2的培养箱中培养 。
1. 1. 2　药物处理　将菝葜原料饮片加入到乙酸乙酯
中 ,充分浸泡 ,然后进行加热回流提取 ,得到乙酸乙酯
回流提取液 ,再回收提取液中的乙酸乙酯即得菝葜的
乙酸乙酯提取物 。将该提取物用生理盐水 (加 0. 1%
PVP)溶解 ,配成实验所需各浓度。实验同时设空白对
照组和阳性对照组 ,阳性药选用 5-氟尿嘧啶 。
1. 1. 3　试剂　RPM I-1640培养基 、胎牛血清 、胰蛋白
酶均为 G ibco产品;Hoeche st33342、碘化丙啶 (propidi-
um iodide)、RNA酶 、DNA标记 、细胞裂解液均为 Sig-
ma产品;琼脂糖凝胶为日本和光制药工业株式会社产
品;5-氟尿嘧啶购于上海旭东海普药业有限公司。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　琼脂糖凝胶电泳检测药物对 HepG2细胞
129 肿瘤基础与临床 2007年 4月第 20卷第 2期
总 DNA的作用　收集经 0. 83 g /L、 0. 083 g /L、0. 0083
mg /L的菝葜乙酸乙酯提取物作用 24 h的 HepG2细
胞 。分别加入细胞裂解液后 37℃静置过夜 , 4℃、
12 000 r /m in离心取沉淀即得总 DNA ,加入适量 TE缓
冲液溶解 ,用 1. 5%的琼脂糖凝胶于 1×TBE缓冲液中
电泳 2 h以分离总 DNA , 10 V /cm。然后用 5μg /mL
EB染色 10m in,紫外灯下检测 、拍照[ 2] 。
1. 2. 2　流式细胞仪检测诱导 HepG 2细胞凋亡及对细
胞周期的影响　离心收集经菝葜乙酸乙酯提取物分别
作用 12、24、 36 h后的 HepG2细胞 ,经 - 20℃予冷的
70%乙醇固定过夜后离心收集沉淀 ,加入 1 g /L RNA
酶 A 溶液 37℃消化 30 m in, PBS 洗涤后留 PBS
0. 5mL,用 100μg /mL的碘化丙啶(PI)50μL 4℃下染
色 30m in,用流式细胞仪在 488 nm波长下分析 [ 3] 。
1. 2. 3　荧光显微镜检测药物对 HepG 2细胞核形态学
特征的影响　分别将 Hoechst33342和碘化丙啶 (PI)
配成 100 μg /mL的母液 ,用前等量混合。细胞经药物
处理 16、24、48 h后分组收集 ,每个标本取 200 μL移
入 Eppendo rf管中 ,加入荧光染料 Hoechst 33342至终
浓度 10 μg /mL,碘化丙啶 (PI)20 μg /mL, 37℃下染色
15 m in,取 20 μL细胞悬液迅速滴于载玻片上 ,加盖玻
片 ,紫外光激发 ,在荧光显微镜下观察可见 4种细胞形
态:活细胞 (VN)染为蓝色 ,核呈正常结构;早期凋亡
细胞(VA)染为蓝色 ,核呈固缩状或圆珠状;非凋亡的
死亡细胞(NVN)染为红色 ,核呈正常结构;晚期凋亡
细胞(NVA)也染为红色 ,但可见明显的染色质凝聚 ,
细胞凋亡率可由以下公式计算 [ 4] :
凋亡率 = VA +NVA
VN +NVN +VA+NVA ×100%
1. 3　统计学处理　实验资料以 –x ±s表示 ,用 SAS软
件进行统计处理 。
2　结果
2. 1　琼脂糖凝胶电泳检测结果　空白对照组细胞
DNA提取物经琼脂糖凝胶电泳后只检测到一条总
DNA条带 ,而用 0. 83 g /L, 0. 083 g /L, 0. 0083 g /L乙酸
乙酯提取物处理 24 h后 ,均检测到细胞发生凋亡时由
于 DNA的规律性降解而形成的梯状条带 , 如图 1
所示。
M. DNA m arker; 1 ～ 4. SCL提取物在 0 g /L、 0. 83 g /L、
0. 083 g /L、0. 0083 g /L剂量时对 H epG2总 DNA的影响。
　　图 1　不同浓度菝葜乙酸乙酯提取物诱导
24 h后 H epG
2
细胞电泳条带
2. 2　流式细胞术分析结果　空白对照组中 Sub G1期
细胞含量较低 ,而随作用时间的延长 ,不同浓度的菝葜
乙酸乙酯提取物作用后的 HepG 2细胞均见 Sub G 1期
细胞百分率逐渐增高 ,见图 2。与相应的空白对照组
相比有统计学意义 (P <0. 05),存在明显的时间依赖
性和浓度依赖性 ,见表 1。
图 2　0. 083 g /L菝葜乙酸乙酯提取物诱导后 H epG2细胞流式细胞仪 DNA直方图
2. 3　荧光显微镜检测细胞核变化结果　在荧光显微
镜下 ,可以观察到存活细胞和凋亡早 、晚期及坏死的细
胞 ,见图 3。观察表明 ,菝葜乙酸乙酯提取物具有直接
杀死 HepG 2以及诱导肝癌细胞 HepG 2凋亡的双重作
用 ,给药初期 ,镜下可见染为红色的死亡细胞大多核呈
正常结构 ,判为正常死亡。药物作用 0、12、24、36 h其
凋亡率分别为 5%、7%、13. 5% 、28. 5%,随诱导时间
的延长 ,凋亡率增高 ,呈时间依赖关系 ,见表 2。但在
药物处理 36 h后 ,倒置显微镜下明显可见细胞碎片增
多 ,荧光染色检测见坏死细胞增多。
130 JOURNAL OF BAS IC AND CLIN ICAL ONCOLOGY Vol. 20 No. 2 Ap r. 2007
表 1　流式细胞仪分析菝葜乙酸乙酯提取物(SCL)对人肝癌细胞细胞周期的影响
给药时间(h) 分组 SubG1(%) G0 /G1(%) S(%) G2 M/ (%)
12 空白组 6. 38±1. 58 34. 12±6. 58 34. 57±4. 16 25. 12±6. 98
0. 0083 g /L组 6. 08±1. 87 33. 02±6. 52 28. 76±3. 46 24. 24±4. 05
0. 083 g /L组 8. 60±2. 52 33. 70±7. 57 28. 56±1. 88 27. 89±4. 06
0. 83 g /L组 15. 27±4. 671) 29. 51±8. 66 29. 33±5. 26 25. 51±4. 21
24 空白组 5. 44±1. 15 39. 15±9. 62 33. 26±6. 33 22. 47±2. 54
0. 0083 g /L组 8. 36±1. 66 35. 16±2. 84 35. 31±2. 16 21. 87±1. 54
0. 083 g /L组 11. 26±6. 231) 29. 60±1. 48 27. 45±2. 05 25. 77±3. 21
0. 83 g /L组 19. 65±1. 691) 30. 03±2. 84 23. 67±4. 65 17. 34±5. 79
36 空白组 6. 47±1. 08 37. 20±2. 65 31. 39±6. 13 22. 34±2. 05
0. 0083 g /L组 16. 35±1. 141) 28. 56±3. 28 28. 33±1. 67 25. 78±1. 89
0. 083 g /L组 21. 66±1. 082) 25. 33±3. 26 24. 46±2. 94 21. 74±1. 66
0. 83 g /L组 31. 54±2. 942) 19. 16±1. 58 18. 73±3. 34 16. 84±1. 72
　1)与空白组比较 P <0. 05;2)与空白组比较 P <0. 01
图 3　菝葜乙酸乙酯提取物作用 0, 12, 24 h后 HepG 2细胞细胞核在荧光显微镜下形态(×200)
　　表 2　0. 083 mg /m L菝葜乙酸乙酯提取物作用不同
时间后 H epG2细胞在荧光显微镜下结果
处理时间
(h)
细胞数量(n)
VN NVN VA NVA 合计 凋亡率(%)
0 196 3 0 1 200 0. 50
12 180 6 10 4 200 7. 00
24 165 27 16 11 200 13. 50
36 150 34 36 21 200 28. 50
3　讨论
利用现代分离分析技术 ,采用细胞生物学和分子
生物学方法以及动物模型进行中药提取部位和主要成
分的筛选 ,是中药现代化研究的重要手段 。通过 Ho-
echst33342 /PI双荧光活染法在荧光显微镜下观察发
现菝葜乙酸乙酯提取物作用后 ,随药物浓度的增加以
及作用时间的延长 ,细胞死亡呈上升趋势 ,且早期死亡
细胞以正常死亡为主 。药物作用 24 h后 ,可见大量细
胞呈现体积变小 ,细胞核皱缩致密等凋亡特征;流式细
胞仪检测结果显示 ,随药物浓度的增加和作用时间的
延长 , G 0 /G1期 、S期 、G2 M/ 期细胞比例逐渐减少 , Sub
G 1期细胞逐渐增多。 DNA ladder被认为是细胞凋亡
的典型特征 。本文利用琼脂糖凝胶电泳的方法检测了
菝葜乙酸乙酯提取物对肿瘤细胞总 DNA的影响 ,实验
结果显示出清晰的 DNA条带 。综上所述 ,无论从形态
学还是从生化学角度 ,都可以证实菝葜的乙酸乙酯提
取物可以有效抑制肿瘤细胞的增殖 ,且该作用通过其
对细胞的直接杀伤作用和诱导细胞的凋亡得以实现 。
随后 ,我们将进一步对菝葜乙酸乙酯提取物的活
性成分进行继续分离 ,鉴定其结构 ,并系统地研究其对
细胞凋亡相关蛋白的作用以及机体免疫功能的影响 ,
进一步阐述其抗肿瘤作用的机制 ,为将其开发为抗癌
新药奠定基础。
参考文献:
[ 1] 　中国中医研究院中药研究所.全国中草药名鉴 [M ] .北京:人民卫
生出版社 , 1996:112.
[ 2] 　Dong JW , Zhu HF, Zhu WZ, et a.l Interm ittent hupoxia at tenuates
ischem ia /reperfus ion induced apop tosis in card iac myocytes via regu-
lating Bcl-2 /Bax exp ress ion[ J] . C ell Res, 2003, 13(5):385 -391.
[ 3] 　 Pan Q , Li DG, Lu HM , et a.l An tiproliferative and p roapoptotic
ef fects of som atostatin on activated hepatic stellate cells[ J] . W orld J
G as troen terol, 2004, 10(7):1015 - 1018.
[ 4] 　Wang JH , X ing QT, YuanM B. An tineop last ic effects of octreotide on
hum an gal lb ladder can cer cells in vi tro[ J] . W orld J G astroen tero l,
2004, 10(7):1043 - 1046.
(收稿日期:2006 - 09 - 12)
131 肿瘤基础与临床 2007年 4月第 20卷第 2期