全 文 ： 实验研究
驱虫斑鸠菊对体内外黑色素细胞中
黑色素小体作用的电镜观察
新疆自治区临床药学研究所(乌鲁木齐 830001) 李红健
中国药科大学新药筛选中心(南京 210038) 尚 靖
新疆自治区药物研究所(乌鲁木齐 830002) 徐建国
摘 要:目的:研究驱虫斑鸠菊在体内 、外对黑色素细胞中黑色素小体的影响 , 来探讨驱虫斑鸠菊治疗白癜风的机理。方
法:用电镜观察体外对培养的黑色素细胞及体内对棕色豚鼠皮肤内黑色素小体的影响。结果:在体外能提高黑色素细胞中
黑色素小体Ⅲ , Ⅳ型的比例 , 阳性对照组亦有不同程度的作用;在体内可增加棕色豚鼠皮肤内黑色素小体的数量比空白对
照组明显 ,但与阳性对照组相比变化不明显。结论:驱虫斑鸠在体内 、外可促进黑色小体向成熟化发展 , 这可能是驱虫斑鸠
菊治疗白癜风的分子机制。
关键词:驱虫斑鸠菊;黑色素细胞;黑色素小体;电镜
中图分类号:R291.5 文献标识码:A 文章编号:1006-6810(2007)06-0046-02
驱虫斑鸠菊(Vernonia Anthelmintica Willd)是一种菊科植
物 ,具有利湿消肿 , 驱虫镇痛的作用〔1〕 ,收载于《中华人民共
和国卫生部药品标准-维吾尔药分册》 , 维吾尔语称“卡力
孜然” , 药用部位为成熟瘦果。在维吾尔医学中常用来治疗
白癜风。我所把驱虫斑鸠菊制成注射液治疗白癜风 ,取得
了较好的疗效。本实验通过观察驱虫斑鸠菊在体外对培养
的黑色素细胞及体内对棕色豚鼠皮肤内黑色素小体的影
响 ,来初步探讨驱虫斑鸠菊治疗白癜风的机理 。
1 材料和方法
1.1 材料:驱虫斑鸠菊注射液(新疆自治区临床药学研究
所提供 , 批号:010608);制斑素(补骨脂)注射液(河南医科
大学制药厂 ,批号:000405),八甲氧补骨脂(8-MOP , 德国);
IBMX(Sigma);DMEM培养基(Gibco);F12 培养基(Gibco);霍
乱毒素(Sigma);bFGF(Sigma);氢化考的松(Sigma);胎牛血
清(Gibco);透射电镜(日立 H600 型);驱虫斑鸠菊提取物
(新疆自治区临床药学研究所提供);其它试剂为国产分析
纯。
1.2 实验动物:英国短毛豚鼠(新疆医学实验动物中心提
供),体重为 250～ 300g;按豚鼠花色和体重均衡分组 ,花色
以棕色为主 ,每组 5 只豚鼠。
1.3 方法
1.3.1 药物对体外培养的黑色细胞中黑色素小体的影响:
①黑色素细胞的原代培养〔2 , 3 ,4〕:取门诊行包皮环切术的包
皮 ,去除皮下组织 , 然后置于含双抗的组织清洗液中浸泡 3
次 ,每次 10min ,用剪刀修剪成 1mm ×2mm 的细条状 , 置于
0.25%胰酶中 4℃过夜消化 16 ～ 24h , 然后用小镊子轻轻将
表皮与真皮分离 , 将表皮组织置于 0.25%胰酶中 37℃消化
10min , 用血清终止消化 , 用剪刀剪碎表皮组织 , 轻轻吹打
5min , 筛网过滤后吸取细胞悬液于离心管中 , 1000r min , 弃
上清加入黑色素培养液(基础培养基未 DMEM F12 ,含 10%
小牛血清 , bFGF10ng ml , CT10ng ml , 氢化考的松 0.5μg ml
等);吹打细胞悬液 ,细胞计数 ,按 2～ 4×105 ml密度接种于
培养瓶中 ,于 37℃5%CO2 培养箱中进行培养。②将培养的
黑色素细胞传三代于 6 孔培养板 , 接种浓度为 1×106 ml ,
24h后加入不同浓度的药物 , 以培养液作空白对照 , 48h0.
25%胰酶消化 6 ～ 8 分钟获得细胞悬液 , 用 0.1M PBS 洗两
次 ,以 1000rpm 离心 5min ,细胞团加入 2.5%戊二醛固定 ,处
理后制片 ,扫描电镜观察并拍照。
1.3.2 药物对豚鼠皮肤内黑色细胞中黑色素小体的影响:
①将各组豚鼠背部的棕黄色区域 , 把各取材区的毛剃成
4cm2 的区域 , 给各组豚鼠分别在腿部肌肉注射药物 , 给药
容积 0.5ml ,每日 1 次 , 连续给药 21 天 , 以制斑素(补骨脂)
注射液为阳性对照 , 以不给任何药物刺激为空白对照;后用
乙醚麻醉 ,将取材区内的皮肤取下备用;②把新取的豚鼠皮
肤放入 4%戊二醛溶液中固定 ,并按照制作透射电镜片的
方法〔5 ,6〕把各组豚鼠皮肤制成电镜片。 ③在电镜下观察并
拍照 ,对电镜照片进行分析。
2 结 果
2.1 驱虫斑鸠菊对黑色素细胞中黑色素小体的影响:将纯
化培养的第三代黑色素细胞 , 接种于直径为 10cm 培养皿 ,
46 中国民族医药杂志 2007 年 6月第 6 期
DOI :10.16041/j.cnki.cn15-1175.2007.06.034
细胞接种浓度为 1×106 个 ml , 24h 后加入 20μg ml的驱虫
斑鸠菊提取物 , 1m M IBMX 和 54μg ml八甲氧补骨脂 ,离心
获细胞团 ,固定 , 制样 ,切片 , 在扫描电镜下观察。结果表明
驱虫斑鸠菊提取物在体外能提高黑色素细胞中黑色素小体
Ⅲ , Ⅳ型的比例 , 阳性对照组亦有不同程度的作用。见图
1。
图 1 驱虫斑鸠菊对体外培养的黑色素细胞中黑色素小体的影响
(电镜放大倍数为13500倍)
注:a.黑色素小体Ⅰ , Ⅱ型 b.黑色素小体Ⅲ , Ⅳ型
2.2 驱虫斑鸠菊对豚鼠皮肤内黑色细胞中黑色素小体的
影响:按 1.3.2 方法把各组豚鼠皮肤制成电镜片 ,在电镜下
观察并拍照 ,对电镜照片进行分析。结果可见:空白对照组
黑色素小体少 ,大小均匀 , 多为Ⅱ 、Ⅲ期 , 细胞界限不明显 ,
胞核大 ,核仁明显 , 核膜清晰;阳性对照组Ⅳ期黑色素小体
多 ,颗粒均较大 , 胞体界限不清楚 ,胞核界限不清楚 , 胞核边
缘不规则 ,变形明显;给药组Ⅳ期黑色素小体多 ,颗粒大 ,胞
体界限不清楚 , 胞核边缘清晰 , 核仁明显 ,黑色素细胞密度
高;表明驱虫斑鸠菊可增加棕色豚鼠皮肤内黑色素小体的
数量比空白对照组明显 ,但与阳性对照组相比变化不明显。
见图 2。
图 2 驱虫斑鸠菊对豚鼠皮肤黑色素小体的影响
(电镜放大倍数为17000倍)
注:a.黑色素小体Ⅰ , Ⅱ型 b.黑色素小体Ⅲ , Ⅳ型
3 讨 论
3.1 白癜风疾病的电镜超微结构显示:黑色素细胞 、黑色
素小体明显减少 , Ⅲ 、Ⅳ期黑色素小体更少 , 但可有黑色素
小体聚集 ,内部呈细颗粒状 ,且黑色素沉积不均匀〔7〕。
3.2 补骨脂素治疗白癜风历史悠久 , 与紫外线联合施治 ,
构成补骨脂光化学疗法 , 现已广泛用于临床 ,取得较好的疗
效 ,本法已成为公认的有效的较成熟的疗法〔8〕 , 因此本试验
选用补骨脂注射液作为阳性对照药物。
3.3 从黑色素细胞电镜照片看 ,驱虫斑鸠菊在体外能提高
黑色素细胞中黑色素小体Ⅲ , Ⅳ型的比例 ,阳性对照组亦有
不同程度的作用。
3.4 从动物电镜照片看 , 给药后黑色素细胞有明显变大 ,
胞质内可见黑色素小体 , 尤以 Ⅲ 、Ⅳ期黑色素小体为多;与
空白对照比:驱虫斑鸠菊注射液组可增加棕色脉鼠皮肤内
黑色素小体的数量;与阳性对照组比黑色素小体的数量变
化不明显。
3.5 通过对黑色素细胞中黑色素小体显微结构的研究 ,结
果表明驱虫斑鸠菊提取物可促进黑色素小体向成熟发展 ,
在体内可以使棕色豚鼠皮肤内黑色素颗粒增大增多 , 促进
黑色素小体成熟 ,这是否是驱虫斑鸠菊治疗白癜风的分子
机制还有待于进一步的验证。
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2007年 4 月 30 日收稿
472007年 6 月第 6期 中国民族医药杂志