全 文 ：滴定法纯度标准值。计算结果为 0.001 75。
表 7　溴库伦滴定法的合成标准不确定度评定分量　
Tab.7　Uncertaintyevaluationofcoulometrymethod　
项目 亚砷酸根溶液标准物质
方法的
重复性
称量 /
mg
进样体积 /
μL
定容体积 /
mL
丹皮酚相对
分子质量
仪器的电流 /
mA
仪器中计时器 /
s
实验取值 0.5g 0.998 95 15.92 100 10 166.173 9 0.998 5 185.4
标准不确定度数值 0.000 001 2μg 0.000 483 7 0.010 20 0.051 02 0.008 165 0.004 19 0.001 074 　0.051 02
相对标准不确定度 0.000 002 40 0.000 484 20 0.000 640 70 0.000 510 20 0.000 816 50 0.000 025 21 0.001 076 00　0.000 275 20
1.9.4.2　总合成不确定度计算 　数学模型为:uc(总) =
u2测量 +S2H +S2(b1) ,式中 uc(总 )表示总合成不确定度 ,
u测量表示测量产生的合成不确定度 , SH表示均匀性产生
的不确定度 , S(b1)表示稳定性产生的不确定度。计算
结果为:0.001 75。
1.9.5　扩展不确定度计算　数学模型为 U=kuC(总),
式中 U表示扩展不确定度;k表示包含因子;uC(总)表示
总合成不确定度 。k取 2,置信水平 P为 95%,总合成
不确定度计算结果为 0.003 5。
1.10　丹皮酚化学纯度标准值与不确定度表示 　
(99.87±0.35)%(k=2, P =0.95)。
2　讨论　
笔者在本实验中制备的丹皮酚化学纯度标准物质
有较高的化学纯度。标准物质的包装有效保证了样品
的稳定性 ,适于储藏与运输。研究获得了标准物质的化
学纯度标准值与不确定度评估结果 ,为量值溯源和传递
提供了科学依据。标准物质定值时采用两种不同原理
方法可有效克服不同技术与方法的缺陷 ,使定值结果更
加科学准确。笔者在本实验中完成的丹皮酚化学纯度
标准物质研制尚属首次 ,并已获得带 CMA标志的国家
一级标准物质证书(证书编号:GBW09509)。化学纯度
标准物质研制将对我国药品的质量有效控制起到积极
的促进作用[ 10-12] 。
[ DOI] 　10.3870/yydb.2011.02.003
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菝葜药理活性部位的纯化＊
胡丽玲 ,廖婧 ,于丽秀 ,华小黎 ,陈东生
(华中科技大学同济医学院附属协和医院药剂科 ,武汉　430022)
[摘　要 ] 　目的　确定大孔吸附树脂纯化菝葜药理活性部位并保证其化学成分整体性的最佳工艺。方法　以甾
体总皂苷的含量为指标 ,选用 D101大孔吸附树脂纯化 ,采用三级管阵列检测器-高效液相色谱法建立各纯化物色谱图。
结果　最佳纯化工艺为:先分别用纯化水和 3倍柱体积的 30%乙醇洗脱去杂质 , 再收集 4倍柱体积的 70%乙醇洗脱液
得皂苷 , 最后用 95%乙醇清洗树脂。结论　该纯化工艺所得纯化物的纯度高 , 化学成分整体性好。
[关键词 ] 　菝葜;活性部位;甾体总皂苷;大孔吸附树脂;三级管阵列检测器-高效液相色谱法;纯化物
[中图分类号 ] 　R286;R965　[文献标识码 ] 　A　[文章编号 ] 　1004-0781(2011)02-0148-05
·148· HeraldofMedicineVol.30No.2 February2011
PurificationofPharmacologicalActivePartsinSmilaxchinaL.
HULi-ling, LIAOJing, YULi-xiu, HUAXiao-li, CHENDong-sheng(DepartmentofPharmacy, Union
HospitalAfiliatedwithTongjiMedicalColege, HuazhongUniversityofScienceandTechnology, Wuhan
430022, China)
ABSTRACT　Objective　TofindoutthebestprocessforpurificationofpharmacologicalactivepartsfromSmilaxchinaL.
withmacroporousadsorptiveresinsandbiochemicalintegrity.　Methods　D101 macroporousadsorptiveresinwasusedtopurify
compoundsandthecorrespondingchromatogrammapsweresetupwithDAD-HPLCaccordingtothecontentoftotalsteroidal
saponins.　Results　Thebestprocedurewasthatelutedthecompoundswithdistilledwaterand3BV30% ethanoltoeliminate
theimpurities, collectedthe4BV70% ethanoleluenttogainthesteroidsaponinsandwashtheresinwith95% ethanolatlast.
　Conclusion　Thepurifiedsubstancesobtainedfromthisprocessarewithhighpurityandgoodbiochemicalintegrity.
KEYWORDS　SmilaxchinaL.;Pharmacologicalactiveregion;Totalsteroidalsaponins;Macroporousadsorptiveresins;
DAD-HPLC;Purification
　　菝葜(SmilaxchinaL.)具有显著的生物活性 ,大
量药理研究发现 ,其有显著的抗炎 、抗菌 、抗肿瘤 、抗氧
化等作用[ 1-3] ,临床单用或与其他药物配伍主要用于治
疗慢性盆腔炎 ,具有良好的疗效 [ 4] 。通常认为 ,菝葜
正丁醇提取部位是中药菝葜主要的药理活性部位 ,研
究发现该部位对慢性盆腔炎 、特发性血小板减少性紫
癜的疗效以及对钙调磷酸酶活性的抑制作用均优于菝
葜的其他部位[ 5-9] ,同时发现该部位主要是皂苷类化合
物发挥疗效 [ 5, 10-11] 。笔者在本实验中拟采用大孔吸附
树脂纯化方法 ,以总皂苷的含量为评价指标 ,利用三极
管阵列检测器-高效液相色谱(DAD-HPLC)法建立纯
化物色谱图 ,从而探讨提取含量较高的菝葜正丁醇部
位的方法 ,并为从整体上建立菝葜正丁醇部位的质量
评价方法提供实验依据。
1　仪器与试药　
LC-20ATvp高效液相色谱仪(SPD-M20Avp二极
管阵列检测器 , LC-20AT泵 , SIL-20A自动进样器 , LC
solution工作站 ,日本岛津公司), AUW220D电子分析
天平(日本岛津公司),旋转蒸发仪(上海亚荣), D101
大孔吸附树脂(天津南开大学化工厂),树脂柱(玻璃
柱 3根 , 3 cm×50 cm)。
菝葜根茎(湖北福人有限公司提供 ,经华中科技
大学同济医学院附属协和医院中药鉴定室鉴定为菝葜
S.china的根茎),甾体总皂苷对照品(含量:95%,中
国药品生物制品检定所),乙腈 、甲醇为色谱纯 ,水为
重蒸水 ,乙醇 、石油醚 、正丁醇 、香草醛 、高氯酸 、冰醋酸
[收稿日期] 　2010-06-12　[修回日期] 　2010-07-25
[基金项目 ] 　＊湖北省科委重点攻关计划项目资助(基金
编号:2002P1105)
[作者简介 ] 　胡丽玲(1984 -), 女 , 浙江丽水人 , 在读硕
士 , 主要研究方向:天然药物制剂与活性成分。 电话:027 -
85726073, E-mail:zjqyhll@163.com。
[通讯作者 ] 　陈东生 ,男 , 主任药师 , 硕士生导师 ,主要研
究方向:天然药物制剂及其活性成分。电话:027-85726073。
等均为分析纯。
2　方法与结果　
2.1　提取　菝葜药材根茎粉碎 ,取 200 g, 6倍体积
60%乙醇浸泡 2 h后冷凝回流提取 3 h,重复 2次 ,合
并 2次提取液 ,旋转蒸发回收乙醇得浸膏;温水溶解所
得浸膏 ,石油醚与水溶液体积比 1：1萃取 3次 ,弃去
石油醚部分 ,除去粗提物中的挥发油及脂类;水饱和的
正丁醇与水溶液体积比 1：1萃取 3次 ,合并正丁醇部
位 ,浓缩 、干燥即得菝葜正丁醇提取物 。
2.2　总皂苷标准曲线的绘制[ 12] 　精密称取甾体总皂
苷对照品 10 mg,溶于无水乙醇 ,定容于 10 mL量瓶。
精密吸取 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140 μL标准品溶液
于试管中 ,于 70 ℃恒温水浴锅上挥去溶剂 ,各加入
5%香草醛冰醋酸溶液 0.2mL,高氯酸 0.8mL,摇匀后
置于 70 ～ 80℃恒温水浴锅中保温 15min,置于冰浴终
止反应后放至室温 ,各加冰醋酸 4 mL摇匀 ,以随行试
剂为空白对照 ,于 462 nm波长处测定吸光度 ,得回归
方程为:Y=0.009 73X-0.005 80, r=0.999 7,样品在
4 ～ 28 μg· mL-1线性关系良好 。
2.3　大孔吸附树脂纯化　将大孔树脂加入乙醇中 ,湿
法装柱(径高比为 1：7), 3根柱子平行操作 ,上柱后
保持乙醇液面高度 ,浸泡过夜。用乙醇以 1 ～ 5倍柱体
积 ·h-1的流速通过树脂层 ,洗至流出液加同体积水混
合后不呈白色浑浊为止 。后用大量纯化水以 1 ～ 5倍
柱体积 ·h-1的流速通过树脂层 ,洗至无醇味后上样 ,
上样量按药材质量与树脂质量比为 1：1,用温水溶
解 ,过滤后以 5倍柱体积 · h-1的流速通过树脂层 ,保
持药液高于树脂层面 1 cm。平衡 2h后 ,第一步 ,先用
纯化水以平均流速 5倍柱体积 · h-1洗柱 ,洗至糖反应
呈阴性 ,洗脱未被吸附的皂苷类及如糖等极性大的物
质;第二步 , 3根柱子各用 0%, 20%, 30%乙醇洗柱 ,比
较该步对下一步皂苷纯化的影响;第三步 ,用 70%乙
醇洗脱得皂苷;最后用 95%乙醇洗脱树脂中残留的极
性小的杂质 [ 13] 。以每 1倍柱体积为 1份 ,收集第二步
·149·医药导报 2011年 2月第 30卷第 2期
和第三步的洗脱液 ,经适当稀释后 ,按 “ 2.2”项下方法
测定其甾体总皂苷的含量 ,结果见表 1。
2.4　纯化物样品的收集　表 1结果显示 ,用 4倍柱体积
的 70%乙醇洗脱后 ,大部分皂苷已洗脱下来 ,继续洗脱意
义不大 ,因此确定 70%乙醇的洗脱量为 4倍柱体积。菝
葜正丁醇提取物上样平衡后 ,用纯化水洗至糖反应呈阴
性 ,收集以下纯化物:①收集直接用 4倍柱体积的 70%乙
醇洗脱液 ,记为纯化物 A;②2倍柱体积的 20%乙醇洗脱
除杂质后 ,收集 4倍柱体积的 70%乙醇洗脱液 ,记为纯化
物 B;③各用 2, 3, 4倍柱体积的 30%乙醇洗脱除杂质后 ,
分别收集 4倍柱体积的 70%乙醇洗脱液 ,分别记为纯化
物 C、D、E。分别取 “2.3”项原上样溶液及纯化物 A、B、C、
D、E液各 20μL, 按“2.2”项下方法测定其甾体总皂苷的
含量 ,测得原上样液 、纯化物 A、纯化物 B、纯化物 C、纯化
物 D、纯化物 E的总皂苷浓度分别为 1.246 2, 1.300 8,
1.661 5, 1.810 2, 1.903 1, 1.898 6mg·mL-1。即各样品溶
液的甾体总皂苷含量大小为:原上样液 >纯化物 A>纯化
物 B>纯化物 C>纯化物 E。将所收集的各纯化物溶剂
蒸干 ,置干燥器中备用。
2.5　各纯化物的 HPLC测定　
2.5.1　色谱条件 　色谱柱:HypersilODS-2 C18柱
(250mm×4.6 mm, 5 μm),流动相:水(A)-乙腈(B),
流速:0.8 mL· min-1 , 色谱峰光谱采集范围:190 ～
400nm;检测波长:210 nm;柱温:30 ℃;进样量:
10 μL;梯度洗脱程序为 0.01 , 20, 40, 80 min乙腈 B浓
度分别为 8%, 15%, 15%, 35%。
2.5.2　样品溶液的制备　分别精密称取 “ 2.1”项下
所得的正丁醇提取物(记为原提取物),及纯化物 A、
B、C、D、E各 0.02g。以甲醇溶解并定量转移至 10mL
量瓶中 ,加甲醇至刻度 ,摇匀。
2.5.3　测定方法　分别精密吸取各供试品溶液 10μL,
注入液相色谱仪 ,按 “2.5.1”项色谱条件 ,记录70 min色
谱图 ,即得。测得的原提取物 、各纯化物的色谱图见图
1。
2.6　方法学考察 [ 14] 　
2.6.1　空白对照　以甲醇溶液作为空白对照品 ,按
“2.5.1”项下色谱条件进样 ,所得图谱除在约 5min有
溶剂峰外 ,无其他干扰峰。
2.6.2　精密度实验　取纯化物 D溶液 ,按 “2.5.1”项
下色谱条件连续进样 5次 ,分别对 2, 5, 9, 10号峰的相
对保留时间和峰面积比值进行考察 。结果表明 ,各峰的
相对保留时间 RSD<0.3%,峰面积比值 RSD<3.0%。
2.6.3　重复性实验　取 “ 2.1”项下所得的正丁醇提
取物 5份 , 按纯化物 D的纯化工艺进行纯化 , 按
“ 2.5.2”项下方法制备样品溶液 ,按照 “2.5.1”项下色
谱条件进行分析 ,分别对 2, 5, 9, 10号峰的相对保留时
间和峰面积比值进行考察 。结果表明 ,各共有峰相对
保留时间 RSD<1.0%,峰面积比值 RSD<3.0%。
2.6.4　稳定性实验　取纯化物 D溶液 ,按 “ 2.5.1”项
下色谱条件 ,分别于 0, 2 , 4, 8, 12, 24 h进样分析 ,考察
2, 5, 9, 10号峰的相对保留时间和峰面积比值 ,结果表
明 ,各共有峰相对保留时间 RSD<1.5%,峰面积比值
RSD<3.0%,表明供试品溶液在 24h内基本稳定 。
3　结论　
比较图 1中的 6张色谱图 ,可知:①正丁醇提取
物用大孔吸附树脂纯化后 ,甾体皂苷的相对含量有明
显提高;②随着纯化程度的加深 , 10min之前的杂质峰
逐渐消失 ,基线逐步下降 ,有些原本含量小 ,隐藏在杂
质中无法检测的物质 ,逐渐显现出来 ,如 12 , 13 , 14, 15
号峰;③先用 30%乙醇除杂质的效果比用 20%的效果
好 ,通过比较 2, 3, 4倍柱体积的 30%乙醇用量发现 ,
用 3倍柱体积的效果优于 2倍柱体积 ,而 4倍柱体积
除杂质的效果与 3倍柱体积的相近 ,且会因用量的加
大而洗去极性相对较大的皂苷 ,如 14号峰 ,从而影响
表 1　各组分洗脱液的甾体总皂苷浓度　
Tab.1　Thetotalsteroidalsaponinsconcentrationofeachcomponenteluent　
柱一
乙醇浓度 /
% 序号
总皂苷浓度 /
(mg· mL-1)
柱二
乙醇浓度 /
% 序号
总皂苷浓度 /
(mg· mL-1)
柱三
乙醇浓度 /
% 序号
总皂苷浓度 /
(mg· mL-1)
0 … 20 1 0.005 6 30 1 0.006 1
… 2 0.012 5 2 0.015 7
… 3 0.011 4 3 0.013 1
… 4 0.010 7 4 0.012 4
70 1 1.354 2 70 1 1.978 2 70 1 2.107 2
2 2.008 9 2 2.912 6 2 3.189 3
3 1.870 8 3 2.008 3 3 2.109 7
4 0.674 8 4 0.391 3 4 0.193 8
5 0.097 2 5 0.008 3 5 0.006 9
·150· HeraldofMedicineVol.30No.2 February2011
图 1　各供试品溶液的 HPLC图谱　
A.原提取物;B.纯化物 A;C.纯化物 B;D.纯化物 C;E.纯化物 D;F.纯化物 E
Fig.1　HPLCchromatogramsoftestsolutions　
A.extraction;B.purificationcontentA;C.purificationcontentB;D.purificationcontentC;E.purificationcontentD;F.purificationcontentE
菝葜正丁醇提取部位化学成分的整体性。因此 ,菝葜
药理活性部位———正丁醇提取部位的最佳纯化程序
是:先用纯化水洗脱至糖反应呈阴性 ,再用 3倍柱体积
的 30%的乙醇洗脱除去杂质 ,收集 4倍柱体积的 70%
乙醇洗脱液 ,最后用 95%乙醇清洗树脂。此时所得纯
化物的纯度较高 ,结果显示该纯化物即纯化物 D的甾
体皂苷含量比常规提取法所得样品即原上样液的含量
提高了 34.4%,并且其化学成分整体性好。
4　讨论　
据文献 [ 15]报道 ,菝葜正丁醇提取物在大孔吸附
树脂中的解吸率随乙醇浓度增大而增大 ,当乙醇浓度
为 40%时 ,其对皂苷的解吸率约为 38%,为减少去杂
质过程皂苷的损失并保证较好的去杂质效果 ,笔者选
用 20%, 30%乙醇进行去杂质;当乙醇浓度超过 70%
时 ,其对皂苷的解吸率增加很小 , 用 80%乙醇比用
70%乙醇增加的值较小 ,影响不明显 ,而增加乙醇浓度
会洗脱更多的杂质 ,例如色素 、树脂等 ,降低总皂苷纯
度 ,所以笔者在本实验选用 70%乙醇为洗脱液。
色谱条件的选择。①检测波长:笔者考察了 190 ～
400nm不同检测波长处的色谱图 ,结果表明210 nm处的
色谱图特征性强 ,信息丰富 ,因此选择 210nm作为检测
波长;②流动相:实验中考察了水-甲醇 、水-乙腈 、0.05%
磷酸水溶液-乙腈等多种流动相系统 ,结果表明采用水-
乙腈作为流动相进行梯度洗脱时 ,各色谱峰分离度较
好;③本实验还考察了柱温为 35, 30, 25℃以及进样量为
40, 20, 10 μL的色谱图 ,当柱温为 30 ℃, 进样量为 10
μL时 ,各色谱峰分离度及峰形较好。同时 2倍保留时
间的色谱图显示 , 70 min后无其他色谱峰干扰测定 ,因
此实验只采集前 70min的色谱图 。
[ DOI] 　10.3870/yydb.2011.02.004
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重组人促红细胞生成素对心肌梗死大鼠
心肌细胞凋亡与线粒体融合基因 2表达的影响＊
孙瑜1 , 涂志业2 ,糜涛3 ,王颖4 ,赵金平 1 ,曹文静 5 ,陈莉莉 3 ,郭小梅 2
(华中科技大学同济医学院附属同济医院 1.胸心外科;2.心血管内科;3.综合内科;4.消化内科;5.检验科 ,武汉
　430030)
[摘　要 ] 　目的　探讨不同剂量重组人促红细胞生成素(rHu-EPO)对心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡和线粒体融合基
因 2(Mfn2蛋白)表达的影响。 方法　将 64 只成年 SD大鼠随机分为模型组 、大剂量治疗组(负荷量 rHu-EPO
5 000 U· kg-1 +rHu-EPO1 500 U· kg-1术后第 2, 4, 6天腹腔注射)、小剂量治疗组(负荷量 rHu-EPO5 000 U· kg-1 +rHu-
EPO750 U· kg-1术后第 2, 4, 6天腹腔注射)和假手术组 ,每组 16只。分别于术后 24h和 2周采用脱氧核苷酸末端转移
酶介导的缺口末端标记法检测心肌细胞凋亡 , 免疫组织化学法检测 Mfn2蛋白表达。 结果　术后 24 h假手术组 、模型
组 、大剂量治疗组 、小剂量治疗组心肌细胞凋亡指数分别为 0, (60.99±5.28), (36.97±2.68), (38.10±3.41);Mfn2蛋
白免疫组化染色平均吸光度分别为(0.080 6±0.013 4), (0.295 2 ±0.024 9), (0.125 3 ±0.020 9), (0.120 2±0.019
7)。术后 2周假手术组 、模型组 、大剂量治疗组 、小剂量治疗组凋亡指数分别为 0, (50.08±8.00), (26.54±2.97), (24.16
±3.74), Mfn2蛋白免疫组化染色平均吸光度分别为(0.095 3 ±0.007 3), (0.247 3 ±0.019 1), (0.146 1 ±0.012 6),
(0.154 2±0.010 6)。与假手术组比较 ,模型组凋亡指数和 Mfn2蛋白表达显著增加(均 P<0.05);与模型组比较 ,大 、小剂
量治疗组凋亡指数和 Mfn2蛋白表达显著减少(均 P<0.05);大剂量治疗组与小剂量治疗组凋亡指数和 Mfn2蛋白表达差
异无统计学意义。结论　心肌梗死后即刻给予负荷剂量 rHu-EPO并术后减量维持治疗 1周可显著降低 Mfn2蛋白表达 , 减
少心肌细胞凋亡;rHu-EPO大 、小剂量维持给药对 Mfn2蛋白表达的调控作用和抗凋亡作用均差异无统计学意义。
[关键词 ] 　重组人促红细胞生成素;心肌梗死;凋亡;Mfn2蛋白
[中图分类号 ] 　R543.3;R965　　　[文献标识码 ] 　A　　　[文章编号 ] 　1004-0781(2011)02-0152-05
EffectsofRecombinantHumanErythropoietinonApoptosisandMitofusin2Protein
ExpressioninRatMyocardiumafterAcuteMyocardialInfarction
SUNYu1 , TUZhi-ye2 , MITao3 , WANGYing4 , ZHAOJin-ping1 , CAOWen-jing5 , CHENLi-li3 , GUO
Xiao-mei2 (1.DepartmentofCardio-ThoracicSurgery;2.DepartmentofCardiology;3.Departmentof
Gerontology;4.DepartmentofGastroenterology;5.DepartmentofClinicalLaboratory, TongjiHospitalAfiliated
withTongjiMedicalColege, HuazhongUniversityofScienceandTechnology, Wuhan430030, China)
ABSTRACT　Objective　Toinvestigatetheefectsofrecombinanthumanerythropoietin(rHu-EPO)atdifferentdoseson
myocardialapoptosisandMfn2proteinexpressioninratswithmyocardialinfarction.　Methods　Atotalof64 adultSprague-Dawley
ratswereusedanddividedrandomlyinto4 groups:myocardialinfarction(MI)rats, whichweretreatedwith5 000U· kg-1 loading
dosefollowedbyamaintenancedoseof1 500 U· kg-1 for1 weekofrHu-EPO(MITH)(highdose), andlowdoseofMITL(a
loadingdosefolowedbyamaintenancedoseof750U· kg-1 for1week), respectively, andshameperatedrats.Twenty-fourhoursand
2weeksafteroperation, myocardialapoptosiswasassessedbyinsituterminaldeoxynucleotidyltransferase(TdT)-dUTPnick-end
labeling(TUNELstaining)andMfn2proteinexpressionwasmeasuredwithimmunohistochemistrystaining.　Results　Twenty-four
hoursafteroperation, apoptosisindex(AI)inshamoperated, MI, MITHandMITLratswas0, (60.99±5.28), (36.97±2.68)and
(38.10±3.41), respectively;meanopticaldensity(MOD)ofMfn-2 proteininfourgroupswas(0.080 6±0.0134), (0.295 2±
0.024 9),(0.125 3±0.020 9)and(0.120 2±0.019 7), respectively.Twoweeksafteroperation, AIinshamoperated, MI, MITH
andMITLratswas0, (50.08±8.00), (26.54±2.97)and(24.16±3.74);MODofMfn-2 proteininfourgroupswas(0.095 3±
0.007 3),(0.247 3±0.019 1), (0.146 1±0.012 6)and(0.154 2±0.010 6).Twenty-fourhoursand2 weeksafteroperation, AI
·152· HeraldofMedicineVol.30No.2 February2011