全 文 ：收稿日期:2003-12-18
基金项目:河北省自然科学基金项目(301443)
作者简介:魏景芳(1957-),男 ,河北黄骅人 ,教授 ,博士 ,主要从事细胞工程与小麦种质资源创新研究工作。
小麦与多枝赖草耐盐纯合易位系的培育及 GISH鉴定
魏景芳1 ,秦　君2 ,王　淳1 ,李冬杰1 ,孙敬三3
(1.河北科技大学 生命科学与工程学院 ,河北 石家庄　050018;
2.河北省农林科学院 ,河北 石家庄　050051;3.中科院植物研究所 ,北京　100044)
　　摘要:以小麦与多枝赖草属间杂种花药培养获得的纯合后代纯系为材料 , 经过细胞学观察 、 田间选拔 、 抗性鉴
定 、 综合农艺性状调查以及小区产量对比试验 , 从中初步筛选鉴定出具有外源耐盐性状 、 且农艺性状好的材料 ,
再经分子标记(GISH)鉴定纯合易位系 。表明花药培养可有效克服小麦远缘杂交后代的疯狂分离 , 并可促进染色体
的结构变异 , 在短时间内获得大量具有丰富变异且可稳定遗传的后代 , 大大缩短了小麦远缘杂交导入外源基因的
年限。
关键词:小麦;多枝赖草;属间杂种;花药培养;易位系 GISH
中图分类号:S512.01　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2004)01-0040-04
Development and GISH Identification of Salt-tolerant
Translocation Lines Between Wheat and Leymus multicaulis
WEI Jing-fang1 ,Q IN Jun2 ,WANG Chun1 , LI Dong-jie1 , SUN Jing-san3
(1.Hebei University of Science and Technology ,Shijiazhuang　050018 ,China;
2.Hebei Academy of Agricultural and Forest ry Sciences ,Shjiazhuang　050051 ,China;
3.Institute of Botany ,Chinese Academy of Sciences ,Beijing 　100044 , China)
Abstract:Pure lines f rom anther culture of intergeneric hybrids between wheat and Leymus mult icaulis
were used to develop pure translocation lines w ith salt-tolerance and ideal ag ronomic characteristics through cyto-
logical detection , field selection , resistance assessment , comprehensive observation of ag ricultural characteristics ,
y ield t rials , and molecular markers(GISH).Results show ed that anther culture can obtain large number of breed-
true variants in a short time by avoiding excessive segregation of posterity and promoting structural variation of
chromosomes in offspring f rom wheat distant hybridization.This g reatly shortened the t ime in int roduction of
alien genes to w heat through distant hybridization.
Key words:Wheat;Leymus mut icaulis;Intergeneric hybrids;Anther culture;Translocation lines;GISH
　　多枝赖草(L.multicaulis Kar.et Kir.Tzvel.)系
小麦近缘属的一个种 ,产于新疆 ,生于平原绿洲之盐
渍化荒漠草甸 ,多年生。该种分布于欧亚地区不同
的生态环境下 ,拥有多种多样的变异类型 ,具有突出
的耐盐碱性 。开展小麦与多枝赖草远缘杂交 ,有望
获得具有多枝赖草耐盐等有益外源基因的小麦新种
质。董玉琛等[ 1] 成功地实现了小麦与多枝赖草的
属间杂交 ,魏景芳等[ 2]通过对小麦与多枝赖草属间
杂种后代材料进行花药培养 ,获得后代纯系 ,本文报
道了对其花培后代鉴定 、分析 ,选育耐盐易位系新种
质的结果。
1　材料和方法
1.1　供试材料
小麦与多枝赖草杂种后代材料:[(cs ×mu)cs]
丰 13 F5 ,其中 , cs为普通小麦中国春 ,mu 为多枝赖
华北农学报·2004 , 19(1):40-43
草 ,丰 7和丰 13为冬小麦品种丰抗 7号和丰抗 13
号。
普通小麦亲本材料(桥梁品种):莱州 953。
1.2　研究方法
1.2.1　花药培养　参照魏景芳等[ 2]的实验方法 。
1.2.2　抗盐鉴定　试验利用模拟性耐盐鉴定盐池
(盐池深 1 m 、土壤含盐量为 4‰及大田好土为对照
处理)。
耐盐系数=盐处理
ck处理
耐盐指数=材料耐盐系数
ck种耐盐系数
一级:耐盐指数≥1.3;二级:耐盐指数≥1.1;三
级:耐盐指数≥0.8;四级:耐盐指数≥0.5;五级:耐
盐指数<0.5。
1.2.3　细胞学分析　种子在 24 ～ 26 ℃黑暗中发
芽。待根长到 1 ～ 1.5 cm 时 ,剪取根尖 ,冰水(0 ～
4 ℃)预处理 20 h ,卡诺固定液固定;选择花粉母细
胞处于减数分裂中期的花药 ,用上述固定液固定 ,孚
尔根染色法染色 ,45%的醋酸或碱性品红染液压片 ,
镜检 。
1.2.4　染色体荧光原位杂交(GISH)　按随机引物
法以 Biotin-16-dUTP 标记多枝赖草染色体组 DNA
为探针 ,酶解离冰冻干燥法制作染色体标本 ,预处理
后将变性的杂交液滴加到标本上 ,加盖片封片 ,置于
分子原位杂交仪上(PHC-3 Techne 公司)温育杂交 ,
洗涤 , FITC 染色 , PI 复染后 ,荧光显微镜观察 、拍
照。参照马有志等[ 3]的实验方法 。
2　结果与分析
2.1　小麦与多枝赖草耐盐纯合易位系 L88的选育
过程
[(cs ×mu)cs]丰 13 F 5与普通小麦莱州 953杂
交 ,F 1花药培养 ,人工染色体加倍 ,获得双单倍体后
代。株行播种 ,农艺性状调查选择 ,结合抗性鉴定 ,
选择农艺性状好又具抗性的材料 ,其中第 88行综合
性状良好 ,耐盐 、抗旱 、秆壮 、株型好 、产量高 ,在实际
生产中示范应用 。定名为 L88 。
2.2　耐盐性鉴定
根据多枝赖草具有突出的耐盐碱性的特点 ,对
其与小麦杂交和花培后代 L88等农艺性状较好的
10个后代材料进行模拟盐池耐盐鉴定 ,以耐盐区域
试验的对照品种德选一号和科遗 26为对照 ,其耐盐
鉴定结果分别列于表 1 ～ 3。
从苗期结果看 ,10个材料中有 7个材料的耐盐
级别在一级以上 ,其中 L112 , L255和 L186的苗期
耐盐性表现最好 ,为对照材料的 4倍多。
表 1　苗期耐盐性鉴定
材料名称 耐盐系数 耐盐指数 耐盐级别 播种粒数
L108 0.12 1.09 3 50
L128 0.13 1.18 2 50
L116 0.32 2.91 1 50
德选一号(ck) 0.11 50
L88 0.23 2.10 1 50
L255 0.53 4.82 1 50
L84 0.31 2.82 1 50
L186 0.45 4.09 1 50
L112 0.50 4.55 1 50
L174 0.29 2.64 1 50
科遗 26(ck) 0.10 50
L226 0.10 0.91 3 46
表 2　返青期耐盐性鉴定
材料名称 盐处理分孽 ck处理分孽 耐盐系数 耐盐指数 耐盐级别
L108 0 226
L128 19 278 0.07 1.17 2
L116 29 332 0.09 1.50 1
德选一号(ck) 16 154 0.10
L88 9 185 0.05 0.83 3
L255 2 159 0.01 0.17 5
L84 0 209
L186 5 201 0.02 0.33 5
L112 3 216 0.01 0.17 5
L174 7 110 0.06 1.00 3
科遗 26(ck) 8 346 0.02
L226 0 277
　　表 2为返青期耐盐性鉴定结果 ,返青期的主要
调查指标是其分孽情况 ,从表中结果看出 ,其表现发
生了变化 , L116 达到了一级标准。 L128 , L88 和
L174也表现不错 ,达到了 2 ,3级 。
表 3 为成熟期耐盐性鉴定结果 ,成熟期的主要
指标是产量 ,从产量结果来看 ,有 4个材料在一级以
上 ,分别为:L128 , L88 , L174 和 L116。其中 L116
表现最好 ,达到了对照材料的 4 倍。说明小麦在不
同生育期的耐盐表现是不同的。
全生育期的综合评定耐盐级别 , L116 , L128 ,
L88 , L174等 4 个材料为一级 ,其中 L88 综合性状
表现突出 ,不仅耐盐碱性强 ,还具有很强的抗病性 ,
而且农艺性状好 ,植株高度适中 、秆壮 、株型好 、产量
高 ,较当地对照品种冀麦 32增产幅度在 15%以上 ,
1期 魏景芳等:小麦与多枝赖草耐盐纯合易位系的培育及 GISH 鉴定 41　
具有较大的生产潜力 ,在试种示范期间单产超过
600 kg ,并在特殊干旱的情况下 ,表现出特殊的抗旱
能力 ,较其他品种增产 100 kg 。已作为耐盐碱新品
系在黑龙港盐碱麦区示范 2万 hm2 。
表 3　成熟期耐盐性鉴定
材料名称 盐处理产量(g)
ck处理
产量(g)
耐盐
系数
耐盐
指数
耐盐
级别
L108 0 142.0
L128 12.5 101.0 0.12 1.8 1
L116 29.4 115.0 0.26 4.0 1
德选一号(ck) 7.0 95.5 0.07
L88 10.2 105.0 0.10 1.54 1
L255 3.2 85.5 0.04 0.62 4
L84 0 82.5
L186 5.3 90.0 0.06 0.92 3
L112 1.9 65.5 0.03 0.46 5
L174 7.4 70.5 0.10 1.54 1
科遗 26(ck) 5.9 105.0 0.06
L226 0 44
2.3　细胞学分析
L88的体细胞染色体数 , 2n=42 , PCM 减数分
裂染色体配对分析结果发现 ,其染色体构型为:2n=
21 Ⅱ ,均为环型二价体(图 1)。此外 ,通过对其他部
分花培后代植株花粉母细胞染色体配对 ,绝大部分
细胞中均为二价体(21个二价体),且基本为环状二
价体 ,说明大多数花培后代为纯合的二倍体 ,系由单
倍体加倍而来的 ,这部分植株大约占观察植株总数
的 90%;另外 10%左右的植株的花粉母细胞染色体
配对不太正常 ,其中包含了较为丰富的变异类型 。
减数分裂压片观察发现:有些细胞含有棒状二价体 ,
有些出现了环形四价体(19个二价体 、1 个四价体)
(图 2),后期出现染色体桥(图 3),说明花药培养结
果会导致染色体结构的变异。环形四价体的出现可
能由于自然加倍后染色体断裂产生了杂合易位 ,易
图 1　环型二价体
位染色体在减数分裂染色体配对过程中形成了环形
四价体 ,这就表明通过花药培养的方法有望获得染
色体易位 ,而后通过自交可以选择出纯合易位系 。
图 2　环形四价体
图 3　染色体桥
2.4　染色体荧光原位杂交
以小麦-多枝赖草耐盐易位系 L88为试材 ,生
物素(Bio tin-16-dUTP)标记多枝赖草总 DNA 为探
针 ,用非标记的亲本小麦莱州 953的染色体组 DNA
作为封闭 DNA ,进行染色体荧光原位杂交分析鉴
定 ,获得了间期核和有丝分裂中期外源染色体片段
(多枝赖草)存在的分子证据 。由于封闭 DNA的存
在 ,在分子杂交的竞争过程中 ,封闭 DNA 优先于自
己完全同源的小麦染色体 DNA 进行杂交 ,从而抑
制了探针与小麦染色体 DNA 的杂交 ,保证了探针
DNA与靶染色体-多枝赖草染色体 DNA 的杂交 ,
因此在多枝赖草染色体上可呈现出比小麦染色体更
强的杂交信号 。有丝分裂中期染色体 ,体细胞染色
体数为 2n=42 ,其中只有两条(一对)染色体上 ,短
臂的末端区域具有很强的杂交信号 ,则该区域为多
枝赖草染色体片段 ,说明 L88 为一纯合易位系 ,其
多枝赖草染色体易位于小麦染色体短臂的近端点
(图略)。
42　 华　北　农　学　报 19卷
3　讨论
本研究表明:花药培养是促进染色体结构变异 、
快速稳定分离 ,获得小麦属间杂种后代纯合易位系
的有效途径。花培后代包含了较为丰富的染色体变
异类型 ,说明花药培养结果会导致染色体结构的变
异。环形四价体出现于自然加倍后代 ,而人工加倍
后代中没有发现 ,其原因可能由于自然加倍后染色
体断裂产生了杂合易位。而人工加倍的在花药培养
过程中染色体断裂易位一定是发生在染色体加倍以
前 ,则易位染色体经过加倍就可直接获得纯合易位
系。花药培养中 , 自然加倍率一般只有 20% ～
30%,而 70%～ 80%的植株需要人工加倍 ,也就是
说获得纯合易位系的频率要大大高于杂合易位。因
此 ,花药培养不仅可稳定分离 ,而且可以促进产生易
位 ,有望在远缘杂交和染色体工程研究领域发挥更
大的作用。通过小麦属间杂种的花药培养 ,可在短
时间内获得大量具有丰富变异且可稳定遗传的后代
材料 ,有效克服小麦远缘杂交后代材料的疯狂分离 ,
获得纯合易位系。配以正确有效的田间观察 、选择
技术方法以及抗性鉴定等工作 ,可大大缩短远缘杂
交导入外源基因的年限。
选用优良的桥梁品种用于小麦远缘杂种后代的
花药培养 ,不仅可大幅度提高花药培养的出愈率 、自
然加倍率 ,还能同时导入桥梁品种诸多有益基因 ,从
而有效地提高后代的综合农艺性状 。本研究所创造
的耐盐易位系 ,不仅耐盐性好 ,而且农艺性状突出 ,
已在生产中得到应用 ,进一步说明了这一点。
导入小麦的外源染色体片段的准确鉴定是一个
亟待解决的问题[ 2] 。本研究在外源性状及细胞学分
析的基础上 ,通过染色体原位杂交 ,证实了外源染色
体片段的存在 ,但如何提高外源染色体 、尤其是小片
段易位的检出率仍需近一步加强研究 。
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