全 文 ：图 4　薄荷脑薄层层析图谱
1.薄荷脑对照品;2 ～ 4.双青咽喉片样品;5.缺薄荷脑阴性对照
Fig 4　T LC chromatog rams of menthol
1.menthol reference sub stan ce;2 ～ 4.sample;5.negative sample
w i th ou t menthol
3　讨论
在鉴别金银花提取物中的绿原酸时选用了 4个
展开系统 ,醋酸丁酯-甲酸-水(7∶2.5∶2.5),紫外灯
下检视[ 1] ;醋酸乙酯-甲醇-甲酸(8∶1∶1)[ 2] ,紫外灯
下检视;醋酸乙酯-甲醇-水(10∶4∶6),氨熏后 ,紫外
灯下检视[ 3] ;醋酸乙酯-甲酸-水(8∶3∶2),1%三氯化
铁乙醇溶液显色 ,于 120 ℃烘约 5 min ,日光下检
视。结果前 3个展开系统均由于斑点分离不理想 、
阴性干扰等原因 ,未被选用;而最后一个展开系统分
离效果较理想 ,斑点清晰 ,重复性好 ,阴性对照不发
生干扰 ,故将其作为双青咽喉片中绿原酸的薄层色
谱鉴别方法。
青蒿油为多种化学成分组成的挥发性混合液 ,
其主要成分为樟脑和桉油精等[ 4] 。由于青蒿油无对
照提取物 ,故在鉴别青蒿油时 ,可以用自制的青蒿挥
发油作参照 ,并通过鉴别青蒿油所含的主要成分樟
脑和桉油精作为青蒿油的鉴别。实验中比较了不同
的展开剂:石油醚(30 ℃～ 60 ℃)-苯-丙酮(12∶8∶
0.2)、石油醚(30 ℃～ 60 ℃)-醋酸乙酯(20∶1)、石油
醚(30 ～ 60 ℃)-乙醚(6∶4)等展开系统[ 5] ,均因樟脑
斑点 Rf 值过低或桉油精斑点有其他斑点掩盖 ,分离
效果不好 。本试验所用展开剂分离效果较佳 ,喷以
2%香草醛硫酸溶液 ,加热显色后 ,斑点清晰 ,阴性对
照不发生干扰 。
可以用甘草酸铵作为鉴别甘草酸的对照品[ 6] 。
在其鉴别中选用中国药典甘草鉴别项下的展开系
统[ 1] ,分离效果理想 ,斑点清晰 。
采用薄层色谱鉴别的方法对双青咽喉片中的有
效成分绿原酸 、甘草酸 、青蒿油 、薄荷脑进行鉴别 ,简
便易行 ,层析分离清晰 ,斑点集中 ,阴性对照无干扰 ,
重复性好 ,专属性强 ,可用于该制剂的质量标准中的
鉴别方法 。
参考文献:
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[收稿日期] 2006-11-25
[ 基金项目] 湖北省重点攻关课题(编号:2002P1105)　[ 作者简介] 于丽秀 ,女 ,硕士研究生 , E-mail:yu li xiu@yahoo.com.cn　[ 通讯作者] 陈
东生 ,男 ,主任药师 ,硕士生导师 , E-mail:yjk chen@yah oo.com.cn
不同方法提取菝葜中有效成分及其生物活性的测定
于丽秀1 ,华小黎2 ,童大刚2 ,陈东生2 　(1.华中科技大学同济医学院 2005 级硕士研究生;2.华中科技大学附属协和医
院 ,湖北 武汉 430022)
[ 摘要] 　目的:考察微波辅助提取与常规提取对菝葜中有效成分提取率的影响 , 及不同提取方法所得有效成分对钙调神经磷
酸酶(CaN)活性的影响。方法:采用微波辅助提取与常规提取方法提取菝葜中的有效成分 , 以 CaN 的活性为指标测定不同提
取方法所得有效成分对 CaN 活性的影响。结果:微波辅助提取菝葜中的有效成分的提取率优于常规提取法 ,并且微波提取所
得的有效成分对 CaN 的抑制作用大于常规提取。结论:微波辅助提取不仅缩短了提取时间 、节约了生产成本 , 而且提取所得
有效成分对 CaN 具有较强的抑制作用。
[ 关键词] 　菝葜;微波辅助提取;常规提取;钙调神经磷酸酶;抑制作用
[中图分类号] R927.2　　[ 文献标识码] A　　[文章编号] 1001-5213(2008)02-0124-04
Different methods for the extraction of active components in Smilax china Linn .and determina-
tion of the components biological activity
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YU Li-xiu1 ,H UA Xiao-li2 ,TONG Da-gang2 ,CHEN Dong-sheng2(1.Tongji Medical College of H uazhong Unive r-
sity of Science and Technolo gy;2.Union Hospital , Huazhong Unive rsity o f Science and Technolog y , Hubei Wuhan 430022 ,
China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To investig ate the influence o f M icrow ave-assisted ext raction and traditional e xtr action methods to
the extr action of the activ e components in S milax china L .and obse rve the active componentss effec t on the activity of calci-
neurin (CaN).METHODS　Microw ave-assisted ex traction and traditional ex traction we re used to ex tract the ac tive compo-
nents in S milax .china L ..The CaNs activity w as used as the index of the influence of activ e com ponents ex tr acted by diffe r-
ent methods.RESULTS　Microw ave-assisted ex tract ha s higher ex traction ratio of active components in Smila x china L.than
traditional ex traction method.The active components ex tracted by M icr ow ave-assist ex trac t have stronger inhibiting activ ity on
CaN than tha t ex tracted by traditional ext raction method.CONCLUSION　Microwave-assisted extr action ha s mo re me rits than
traditional ex traction me thod such as reducing the extr action time , sav ing co st and stronge r inhibiting activity of the ex tracted
active components on CaN.
KEY WORDS:Smila x china L .;micr ow ave- assisted ex traction;tr aditional ex trac tion;calcineurin;inhibition
　　菝葜(Sm ilax china L .)系百合科菝葜属植物 ,
具有消肿解毒 、祛风利湿 、抗炎镇痛 、抗肿瘤等药理
活性 [ 1-3] ,还具有治疗免疫性疾病 、参与体内免疫活
动调节的活性[ 4-5] ,并且主要有效成分集中在正丁醇
部位(主要为甾体皂苷)。作为免疫抑制剂的靶
酶———钙调神经磷酸酶(CaN)在免疫活动中起着极
其重要的作用。菝葜发挥免疫抑制作用的机制与其
抑制 CaN的活性密切相关 ,如何提高菝葜中有效成
分的提取率成为科研工作者关注的焦点 。微波在天
然药物的提取方面具有一定的优势[ 6-7] ,为此本实验
以CaN 的活性为指标 ,利用微波辅助提取法提取菝
葜中的有效成分 ,并与常规提取方法进行比较 ,寻找
提取菝葜中有效成分的最佳提取方法 。另外 ,实验
还通过测定所得提取物中总皂苷的含量 ,为菝葜中
的皂苷对 CaN活性具有抑制作用提供一定的佐证 。
1　材料
UV -2450型紫外分光光度计(SHIMADZU);
MDS -6型温压双控微波消解/萃取仪(上海新仪微
波化学科技有限公司);菝葜(采自湖北省大悟县 ,经
武汉协和医院中药鉴定室鉴定),对硝基磷酸酚(p-
NPP , sigma公司);钙调磷酸酶测试盒(biomol Re-
search Labo rato ries);薯蓣皂苷(中国药品生物检定
所 ,批号 1539 -200001);乙醇 ,二甲亚砜等所用试
剂均为分析纯 ,水为注射用水(自制)。
2　方法与结果
2.1　有效成分的提取
2.1.1　微波辅助提取法　称取菝葜粗粉(粒度 20
目)10 g ,浸泡 2 h后 ,提取温度 100 ℃,溶剂浓度约
为0.1 mol·L-1的氢氧化钠水溶液 ,液固比 5∶1 ,提
取时间 9 min 。提取后滤过 ,合并滤液 ,旋转蒸发 ,
浓缩至膏状。浓缩物置 60 ℃真空干燥器中至干 ,备
用。
2.1.2　常规提取法　称取菝葜粉末 10 g ,浸泡 2 h
后 ,置圆底烧瓶中 ,加0.1 mol·L-1的氢氧化钠水溶
液煎煮回流 2次 , 每次 3 h , 趁热滤过合并滤液 , 旋
转蒸发 ,浓缩至膏状。浓缩物置 60 ℃真空干燥器中
至干 ,备用。
2.2　不同提取方法所得产物中总皂苷的含量测
定[ 8]
2.2.1　总皂苷标准曲线的制备　精密称取薯蓣皂
苷对照品 , 用甲醇配成 273 mg·L-1的对照品溶液。
分别精密吸取 0.1 , 0 .15 , 0 .20 , 0 .25 , 0 .30 , 0 .35 ,
0.40 mL 对照品溶液及0 .40 mL 甲醇于 8支 10 mL
试管中 , 于 70 ℃恒温水浴锅上蒸干 , 各试管再分
别加入0 .20 mL 5%香草醛冰醋酸溶液及0 .80 mL
高氯酸 ,摇匀后置于 70 ℃恒温水浴锅中保温 15
min , 取出迅速加入 4 mL 冰醋酸摇匀 , 在 462 nm
处测定吸光度(A)。以加甲醇管为空白对照 , 以浓
度(C)对 A 回归 , 得方程 A =0.016 9 C+0.069 7
(r =0.998), 表明薯蓣皂苷在 5 ～ 20 mg·L-1与吸
光度线性良好 。
2.2.2　菝葜中总皂苷含量的测定　分别称取微波
提取与常规提取所得干燥固体0.1 g 各 3份 ,分别各
用 25 mL 水超声溶解 ,再分别以 45 mL 正丁醇萃取
3次 ,合并正丁醇萃取液 , 回收至干 , 各加入 5 mL
甲醇溶解 ,再分别移取0.2 , 0.26 mL 于 2支 10 mL
试管中 ,按照总皂苷标准曲线的制备项下测其吸收
度 ,分别取 3份的平均值 ,根据回归方程计算出提取
物中相应的总皂苷含量 。微波提取的吸收度为
0.278 ,皂苷的含量为3 .02%;常规提取的吸收度为
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0.291 ,皂苷的含量为1.48%。
2.2.3　微波提取与常规提取方法的比较　由结果
得知 ,在提取溶剂(0.1 mol·L-1的氢氧化钠水溶
液)、液固比(5∶1)、浸泡 2 h 、提取温度为 100 ℃等条
件相同的情况下 ,与常规提取方法相比微波辅助提
取大大缩短了提取时间 ,提高了有效成分的提取率 。
2.3　菝葜中有效成分对 CaN活性影响实验
2.3.1　CaN活性测定的原理　CaN 在体外能够水
解对硝基磷酸酚(p-N PP)小分子底物 ,水解后的产
物 420 nm 处有最大吸收。结合 CaN 的酶学特点及
药物与靶酶结合的相关性质 ,确定以 p-NPP 为底
物。通过测定底物水解产物的光密度 OD值 ,确定
药物对 CaN 的活力变化的影响。一般 OD值与酶
的活性成正比关系。OD值越小 ,酶活力值越弱 ,药
物对 CaN的活性抑制作用越强 。药物对 CaN 的抑
制作用公式如下:
抑制率(%)=(1-OD药+酶 -OD药对照
OD酶 )×100 %
2.3.2　菝葜中有效成分对 CaN 活性影响的测定方
法
(1)菝葜样品液的配制　分别取微波及常规提
取方法所得干燥固体各0.5 g ,以 25 %DMSO 溶液
超声溶解制成 5 g·L-1的样品溶液 ,再按照一定的
比例稀释 ,制成 1 ,0 .2 , 0.04 g·L-1的样品溶液 ,备
用。
(2)实验分组情况　空白对照组:水;药物对照
组:菝葜样品溶液;酶对照组:酶溶液;实验组:菝葜
样品溶液+酶溶液;其中各菝葜提取样品溶液 ,在某
一浓度时 ,实验组均设 3个平行管 ,并设 3个平行酶
对照管 ,检测结果取平均值。
2.3.3　CaN 活性的测定 　取洁净的试管若干 ,置
冰浴上 ,向每一支试管中分别加入不同浓度的药液
10 μL 、酶溶液 10 μL 于冰浴中孵育 5 min ,然后分
别依次加入测活液 180 μL ,混匀 ,置 30 ℃的水浴中
反应 20 min ,取出 ,立即加入终止液1 800 μL ,用分
光光度计在 420 nm 处上测定 OD 值。测定不同浓
度时药物对 CaN 的抑制作用。根据 OD值分别计
算不同提取方法所得菝葜提取物对 CaN 活性抑制
率的大小 ,结果见表 1 。
2.3.4　不同提取方法的提取物对 CaN 活性抑制作
用的比较　不同提取方法的所得提取物对 CaN 活
性抑制作用的趋势图见图 1。由趋势图可知:随着
提取物浓度的增大 ,菝葜中有效成分对 CaN 的抑制
作用逐渐增强 ,且在较高浓度时表现出较强的抑制
作用;在条件相同的条件下 ,微波辅助提取所得提取
物对 CaN 的抑制作用较常规提取方法强 ,以上实验
数据说明微波辅助提取所得菝葜有效成分的生物活
性优于常规提取方法所得菝葜有效成分的生物活
性。
表 1　常规水提物及微波炉水提物对酶活性的影响结果
Tab 1　The results o f inf luence of traditional and microwave
ex traction to the activity of calcineurin
浓度/
g·L -1
OD值酶
酶 药物对照 (药+酶)均值
活抑制率
/ %
A B A B A B A B
0 0 0 0.253 0.243 0 0
0.04 0.000 0.000 0.246 0.320 2.77 2.17
0.2 0.253 0.327 0.001 0.002 0.239 0.309 5.93 6.12
1 0.004 0.001 0.238 0.274 7.51 16.51
5 0.015 0.014 0.233 0.216 13.83 38.23
注:A 为常规提取物 , B为微波提取物
图 1　不同提取方法对酶的抑制作用
◆-常规提取法;□-微波辅助提取法
Fig 1　Th e enzyme inhibi ting ef fects of th e ext ract s f rom dif feren t
methods
◆-T radit ional method;□-Microwave assi sted method
3　讨论
微波提取是最新发展起来的新技术 ,其提取的
原理是以微波穿透性加热 。由于微波是穿透式加
热 ,大大节省了提取时间 。常规提取方法 3 h 的完
成的提取工作 ,微波辅助提取设备只需几分钟便可
完成 。传统热的提取是以热传导 、热辐射等方式由
外向里进行 ,而微波辅助提取则是里外同时加热 ,没
有高温热源 ,消除了热梯度 ,从而使提取质量大大提
高 ,有效地保护了原料中化学成分的功能 。从 2种
不同的提取方法所得的提取物对 CaN 活性的抑制
作用可以看出:微波辅助提取能更好的保护菝葜中
有效成分的药理活性 ,在相同的浓度下微波辅助提
取物对 CaN活性的抑制作用均优于常规提取法所
得提取物 ,充分的说明的微波辅助提取在天然药物
的提取方面存在较大的优势 ,易于在提取方面得到
推广应用 。
本课题组通过实验证明菝葜提取物对胸腺有抑
制作用 ,能降低 CD+3 CD+4 T 细胞的水平 ,从而抑
制 CD+3 CD+4 T 细胞介导的迟发型超敏反应 ,减轻
了 AA 小鼠的继发性足肿胀。而抑制 CaN 活性的
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免疫抑制剂 ,是通过能阻断 TCR 的信号传导通路 ,
使 T 细胞不能活化 ,从而发挥免疫抑制作用。由此
我们推测菝葜提取物可能具有抑制 CaN 活性的作
用 ,实验证明此推测是正确的 ,菝葜提取物对 CaN
的活性具有一定的抑制作用 ,且随着提取物浓度的
增大其抑制作用有逐渐增强的趋势 。这一发现为进
一步开发菝葜的药理作用 ,扩大其临床应用的范围 ,
提供了一定的理论基础 ,同时也为寻找新的 CaN 抑
制剂具有一定的指导意义 。
参考文献:
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[收稿日期] 2007-06-12
[ 基金项目] 重庆市教委基金资助项目(编号:KJ051304);教育部“春晖计划”资助项目(编号:Z-2005-1-55006)　[ 作者简介] 江虹 ,女 ,教授 ,电
话:023-72094121 , E-mai l:jianghongch @163.com
几种酸性染料与小诺霉素的显色反应及应用
江虹1 ,何丽平2 ,陈邦进3 　(1.长江师范学院化学及环境科学系 , 重庆 408100;2.重庆涪陵区计量质量检测中心 , 重庆
408000;3.四川中医药高等专科学校 ,四川 成都 621000)
[ 摘要] 　目的:建立测定小诺霉素(MIVC)含量的方法。方法:利用几种酸性染料与 MINC 的显色反应 , 建立分光光度法测定
其含量。结果:在酸性条件下 , 刚果红(COR)、依文思蓝(EVB)及滂胺天蓝(POB)与 MINC 反应生成红色或蓝色缔合物 ,最大
显色波长为 678 nm(EVB)和 692 nm(POB),线性范围分别为 0.2 ～ 8.4 , 0.2 ～ 7.5 mg·L-1 , 表观摩尔吸光系数分别为 8.3×
103 , 5.2×103 L·mo l-1·cm -1;最大褪色波长为 502 ～ 620 nm ,线性范围分别为0.1 ～ 7.5 , 0.1～ 9.3 , 0.1～ 8.4 mg·L-1 ,表观摩
尔吸光系数(ε)分别为2.34×104 , 4.05×104 , 2.06×104L·mo l-1·cm -1 ;当 EVB和 PDB 体系用双波长叠加测定时 ,ε值分别为
4.90×104 , 2.56×104 L·mol-1·cm -1 。结论:CUR 褪色法 , EVB、PDB 显色法和褪色法以及双波长叠加法均可用于市售药物
中小诺霉素含量的测定。
[ 关键词] 　小诺霉素;刚果红;依文思蓝;滂胺天蓝;显色反应;分光光度法
[中图分类号] R927.2　　[ 文献标识码] A　　[文章编号] 1001-5213(2008)02-0127-04
Color reactions of a few acid dye with micronomicin and their applications
JIANG Hong
1 ,HE Li-ping 2 ,CHEN Bang-jin3(1.Depar tment of Chemistry and Environmental Science , Yang tze No r-
mal Colleg e , Chongqing 408100 , China;2.Chongqing Fuling Center of metr ological Examina tion and Quality Inspection ,
Chongqing 408000 , China;3.Sichuan T raditional Chinese Medicine College , Sichuan Chendu 621000 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　A new method for the determina tion of micronomicin has been developed.METHODS　Sever al acid
dye reagents we re used to determine micronomicin by colour reaction with spectrophotome try.RESULTS　In the acid condition ,
congo red(COR)and evans blue(EVB)and pontamine sky blue(POB)reacts with micronomicin(MINC)to form red o r blue ion
asso ciation complexes.The maximum abso rption w aveleng ths at 678nm(EVB)and 692nm(POB), their linear ranges o f 0.2-
8.4 , 0.2-7.5mg· L-1 w ere obtained respectively , their apparent mo lar absorptivities(ε)w ere 8.3×103 and 5.2×103 L·mol-1
·cm -1 ;The max imum fading w aveleng ths were lo ca ted betw een 502 and 620 nm , the linear ranges o f 0.1-7.5 , 0.1-9.3 and
0.1-8.4 mg·L -1 were observed .their apparent mo la r absorptivities(ε)w ere 2.34×104 , 4.05×104 and 2.06×104 L·mol-1·
cm -1;When the dual-w aveleng th over lapping absorption spec trometr y was used to determine the mic ronomicin of ev ans blue
and pontamine sky blue sy stem , their mo lar abso rptivitiesεw ere 4.90×104 and 2.56×104 L·mo l-1·cm -1 .CONCLUSION　
·127·中国医院药学杂志 2008年第 28卷第 2期 Chin H osp Pharm J , 2008 Jan , Vol 28 , No.02