全 文 ：中国药房 2007年第 18卷第 33期 China Pharmacy 2007 Vol.18 No.33 · 2577·
·中药工艺与制剂·
综合评分法筛选驱虫斑鸠菊水提取液澄清工艺 Δ
于鲁海 * ,李燕菊 ,孙 力 ,尚 靖 ,徐建国(新疆维吾尔自治区人民医院临床药学研究所 ,乌鲁木齐市 830001)
中图分类号 R94;R283 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2007)33-2577-03
摘 要 目的:优化驱虫斑鸠菊水提取液的澄清工艺 。方法:采用正交试验设计 , 以浸膏量 、浸膏中紫铆素和总黄酮含量为评分指
标 , 筛选驱虫斑鸠菊水提取液的澄清条件 。结果:驱虫斑鸠菊水提取液的澄清条件为:ZTC 1+1型澄清剂的加入顺序为先加入
0.5%(g ·mL -1)澄清剂 B溶液 ,再加入 1.0%(g ·mL -1)澄清剂 A 溶液;澄清剂 B和 A 的最佳用量分别为 2.0%(V/V)和 0.5%
(V/V);反应温度分别为(80±1)℃和(60±1)℃;反应时间均为 2h 。结论:该工艺简便、可行 ,可为实际生产提供理论依据 。
关键词 驱虫斑鸠菊;正交试验;综合评分法;澄清工艺
Optimizing of Clarifying Technology of Water Extract of Vernonia Anthelmintica Willd.by Comprehen-
sive Grading Method
YU Luhai , LI Yanju , SUN Li , SHANG Jing , XU Jianguo (The Clinical Pharmaceutical Insti tute , Xinjiang
Urumqi Autonomous Reg ion Peoples Hospi tal , U rumqi 830001 , China)
ABSTRACT OBJECT IVE:To optimize the clarify ing technology of w ate r ex tract o f Vernonia an thelm intica Willd..
M ETHODS:T he clarifying conditions o f w ate r ex tract o f Vernonia anthelm intica Willd.were optimzed by orthogonal test
design with the contents o f the ex tract and those o f Butin and Tota l flavonoids in the ex trac t as indexes fo r the grading.RE-
SULTS:The optim al clarify ing procedure w as as fo llow s:the adding sequence o f ZTC 1+1 natural clarify ing agents w as 0.5%
(g ·mL -1)B solution preceded 1.0% (g ·mL -1)A solution;the optim al am ount fo r B solution w as 2.0%(V/V)as against
0.5%(V/V)fo r A solution;the reaction temperatures solution and A solution w ere (80±1)℃and (60±1)℃, respectively ,
w ith a reaction time of 2 hours for bot h.CONCLUSION :The clar ify ing technology o f Vernonia anthelmi ntica Willd.w as
simple and feasible , w hich serves as a theoretical basis fo r the prac tical production.
KEY WORDS Vernonia anthelmin tica Willd.;Orthogonal test;Com prehensive grading method;Clarify ing tech no logy
Δ国家高新技术研究发展计划项目资助课题(2002AA 2Z3226)
*副主任药师。研究方向:天然药物研究与开发。电话:0991-
8562367。E-mail:ylh0226@sohu.com
能 ,发挥健脾消食作用的 。
参考文献
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(收稿日期:2007-02-12 修回日期:2007-06-25)
驱虫斑鸠菊 Vernonia anthelmi ntica Willd.为菊科一年
生草本植物 , 是新疆维吾尔医生习惯用的药材 。其药用部位为
驱虫斑鸠菊植物的成熟果实 ,具有清除异常黏液质 、驱虫、消肿 、散
寒 、止痛的作用 ,用于治疗湿寒性胃痛、肝病 、白癫风等症[1 ] 。本文
以筛选的活性部位和活性成分为目标物 , 选用 ZTC1+1型天
然澄清剂 , 对驱虫斑鸠菊水提取液的澄清工艺进行了筛选 , 并
通过综合评分法优化驱虫斑鸠菊水提取液的澄清工艺条件 。
1 材料
1.1 仪器
1100型高效液相色谱仪 、 8453型紫外分光光度计 (美国
Agilent公司);BP 211D 型电子天平(德国 Sarto rius公司)。
1.2 试药
驱虫斑鸠菊成熟果实 (采自新疆阿克苏地区扎木台乡 , 经
北京医科大学药学院天然药物教研室艾铁民教授鉴定为菊科
植物驱虫斑鸠菊 Vernonia anthelmi ntica Willd.);芦丁对照
品(中国药品生物制品检定所 ,批号:0080-9705);紫铆素对照
品 (新疆维吾尔自治区人民医院临床药学研究所自制 , 批号:
000516 ,色谱纯度大于 99.0%);ZTC-预处理剂 A 、ZTC-预
处理剂 B 、ZTC-Ⅳ型澄清剂 A 、ZTC-Ⅳ型澄清剂 B(天津正
天成澄清技术有限公司);乙腈为色谱纯 , 水为去离子水 , 其余
· 2578· China Pharm acy 2007 Vol.18 No.33 中国药房 2007年第 18卷第 33期
表 1 正交试验结果
Tab 1 Results of orthogonal test
试验号 因素 评价指标
A B C D E 紫铆素含量/mg· g -1 总黄酮含量/mg· g -1 浸膏量/g 综合评分
1 1 1 1 1 1 13.76 392.1 1.677 96.84
2 1 2 2 2 2 11.51 291.4 1.772 78.81
3 1 3 3 3 3 9.14 247.9 1.847 66.06
4 1 4 4 4 4 10.39 206.4 1.713 65.82
5 2 1 2 3 4 12.40 313.8 1.596 83.61
6 2 2 1 4 3 10.58 215.6 1.899 68.21
7 2 3 4 1 2 9.87 207.9 1.932 64.97
8 2 4 3 2 1 12.00 278.2 1.701 78.95
9 3 1 3 4 2 12.32 334.2 1.671 85.68
10 3 2 4 3 1 8.76 269.5 1.877 67.01
11 3 3 1 2 4 8.13 263.9 2.277 65.75
12 3 4 2 1 3 11.02 302.7 1.881 78.60
13 4 1 4 2 3 10.26 334.0 1.917 79.20
14 4 2 3 1 4 8.86 258.9 2.307 68.03
15 4 3 2 4 1 9.42 253.1 2.447 70.04
16 4 4 1 3 2 11.74 371.0 2.063 88.94
K 1 307.5 345.3 319.7 308.5 312.8
K 2 295.7 282.1 311.1 302.7 318.4
K 3 297.0 266.8 298.7 305.6 292.1
K 4 306.2 312.3 277.0 289.8 283.2
R×4 11.8 78.5 42.8 18.7 35.2
试剂均为分析纯 。
2 方法与结果
2.1 驱虫斑鸠菊水提取液的制备
称取驱虫斑鸠菊成熟果实适量 , 置于圆底烧瓶中 , 加入 10
倍量水 ,浸泡 1h ,回流提取 3次 ,每次 1h ,过滤 , 合并滤液 ,按
1∶10比例水浴浓缩 ,备用 。
2.2 驱虫斑鸠菊水提取液的澄清工艺
2.2.1 ZTC-Ⅳ型澄清剂的配制(按说明书方法配制如下):
①1.0%(g ·mL -1)澄清剂A 溶液:取适量澄清剂 A 组分加少
量去离子水 , 搅拌成糊状 , 加去离子水至足量 , 溶胀 24h以上 ,
备用 。②0.5%(g ·mL -1)澄清剂 B溶液:取适量澄清剂 B组分
加少量 0.5%(V/V)醋酸溶液 , 搅拌成糊状 ,加 0.5%醋酸溶
液至足量 ,溶胀 24h 以上 ,备用 。
2.2.2 澄清液的制备:量取 “2.1”项下驱虫斑鸠菊水提取液
150mL , 按正交表的设计要求 , 用稀盐酸溶液或 0.1mol· L -1
的氢氧化钠溶液调 pH 值;在提取液中加入适量预处理剂 A ,
直接煮沸 , 温度降至(55±1)℃后 , 加入同量的预处理剂 B , 恒
温 6h ,取出 ,煮沸 15min ,放置;在(80±1)℃下搅拌加入澄清剂
B溶液适量 , 恒温 2h , 且每隔 30min缓慢搅拌 1次 , 2h后降温
至(60±1)℃,缓慢搅拌加入适量澄清剂 A 溶液 ,恒温 2h ,每隔
1h搅拌 1次 ,2h后取出冷却 ,用去离子水补至足量 ,备用 。
2.2.3 供试品溶液的制备:取“2.2.2”项下澄清液 , 以 3 000r ·
min
-1离心 10min ,移取上清液 ,备用 。
2.3 紫铆素的含量测定
2.3.1 色谱条件 :色谱柱为 Zorbax S B -C 18(250mm ×
4.6mm , 5μm), 流动相为乙腈-0.02mol· L -1磷酸二氢钾溶
液 , 梯度洗脱(0min , 16∶84;20min , 16∶84;50min , 24∶76;
60min , 16∶84),流速为 1.0mL ·min -1 ,检测波长为 280nm ,柱
温为室温 ,进样量为 20μL 。色谱见图 1 。
2.3.2 对照品溶液的制备:精密称取紫铆素对照品 4.95mg ,
置于 50mL量瓶中 , 加甲醇溶解并用流动相稀释至刻度 , 制成
0.099mg ·mL -1的对照品溶液 。
2.3.3 线性关系考察 :精密吸取对照品溶液 0.5 、1.0 、2.0 、
3.0 、4.0 、5.0mL , 分别置 5mL 量瓶中 , 加流动相稀释至刻度 , 摇
匀 ,分别吸取上述溶液各 20μL ,进样测定 。以紫铆素浓度(C ,mg)
对峰面积(A)进行线性回归 ,得回归方程为 C=0.000 07A +
0.001 8(r=0.999 9)。结果表明 ,紫铆素检测浓度在 0.049 5 ～
0.495mg 范围内与峰面积积分值呈良好线性关系 。
2.3.4 精密度试验:取同一供试品溶液 , 重复进样 6次 。结
果 ,紫铆素峰面积积分值的 RSD =0.79%(n=6)。
2.3.5 稳定性试验:取同一供试品溶液 , 在 24h内分别于不
同时间进样 。结果 ,紫铆素峰面积积分值的 RSD=0.41%。
2.3.6 加样回收率试验:取已知含量驱虫斑鸠菊药材适量 ,
共 9份 , 按高 、中、低 3种浓度分别加入对照品约 0.80 、1.00 、
1.20mg 各 3份 , 加入 10倍量提取溶媒 , 回流提取 3次 , 每次
1h ,合并 ,浓缩 ,定容 ,过滤 ,测定 。结果 ,平均回收率为 90.2%,
RSD =2.8%(n =9)。
2.3.7 样品含量测定:分别吸取对照品溶液和供试品溶液各
20μL , 注入液相色谱仪 , 测定峰面积 , 用外标法计算供试品溶
液中紫铆素的含量 。结果详见表 1 。
图 1 高效液相色谱
A.对照品;B.供试品;1.紫铆素
Fig 1 HPLC
A.reference subs tance;B.tes t samp le;1.Bu tin
中国药房 2007年第 18卷第 33期 China Pharmacy 2007 Vol.18 No.33 · 2579·
2.4 总黄酮的含量测定
按照部颁标准 [ 1 ]的方法 ,以芦丁为对照品 ,经 NaNO 2 -
Al(NO 3)3-NaOH显色反应 ,在波长 510nm 处测定“2.2.3”项
下供试品溶液的吸光度 ,计算总黄酮含量 。结果详见表 1 。
2.5 浸膏量的测定
精密移取 “2.2.3”项下供试品溶液 10mL , 置于干燥至恒
重的蒸发皿中 ,水浴蒸干 ,残渣于 105℃干燥至恒重 ,取出 ,置干
燥器中放置 30min后称定重量 ,计算浸膏量 。结果详见表 1。
2.6 正交试验设计 [2 ～4]
根据预试验结果 , 选出处理前 pH值 (A)、预处理剂用量
(B)及澄清剂用量(C)3因素 ,每个因素采用 4水平进行试验 ,
对测定的浸膏量 、浸膏中紫铆素和总黄酮含量等 3个指标采用
综合评分法进行评定 , 优化澄清工艺的条件 。正交试验结果详
见表 1;因素水平详见表 2;方差分析结果详见表 3。
表 2 因素水平
Tab 2 Factors and levels
水平 因素
A B(A∶B) C(0.5%B∶1.0%A)
1 不调pH 0∶0 0∶0
2 4 0.2%∶0.2% 2.0%∶0.5%
3 7 0.4%∶0.4% 4.0%∶1.0%
4 10 0.1%∶0.1% 6.0%∶1.5%
表 3 综合评分方差分析结果
Tab 3 Variance analysis of comprehensive grading
方差来源 离均差平方和 自由度 方差 F P
A 27.89 3 9.30 0.214 0.883
B 904.62 3 301.54 6.944 0.022
C 258.01 3 86.00 1.981 0.218
误差(D+E) 260.55 6 43.42
按 L 16(45)正交表的要求 , 分别测定上清液的紫铆素浓度 、
总黄酮浓度和浸膏量 , 通过计算 , 分别得到浸膏中紫铆素和总
黄酮的含量 ,在此基础上 ,进行多指标综合评分 。评分时以各指
标的最大值为参照将数据进行归一 , 再给出不同权重 。浸膏中
紫铆素含量和总黄酮含量以及浸膏量的权重系数分别为 0.5 、
0.4、 0.1 , 以综合值进行统计分析 。综合评分 Y =0.5×X 1×
100/13.76+0.4×X 2×100/392.1+0.1×X 3×100/2.447(式
中 , Y 为综合评分;X 1为因素A ;X 2为因素B;X 3为因素 C)。
直观分析表明 , 以综合评分为标准 , 在所选因素水平范围
内 ,预处理剂(因素 B)的使用对驱虫斑鸠菊提取液指标成分的
影响最大 ,其次为澄清剂(因素 C)的使用 ,酸碱度(因素 A)的
的影响最小 。以空白列 D 和 E 作为误差项进行方差分析 ,结果
表明 ,因素 B为主要影响因素 ,具有统计学意义(P <0.05),因
素 A 和因素 C则无统计学意义 。结合澄清效果综合考虑 ,对驱
虫斑鸠菊提取液不调节酸碱度 ,不使用预处理剂 ,澄清过程中 ,
在 (80±1)℃下搅拌加入 2.0%(V/V)0.5%的澄清剂 B溶
液 , 恒温 2h , 且每隔 30min缓慢搅拌 1次 , 2h后降温至(60±
1)℃, 缓慢搅拌加入 0.5%(V/V)1.0%的澄清剂 A 溶液 , 恒
温 2h ,每隔 1h搅拌 1次 ,2h后取出冷却。
2.7 验证试验
经 ZTC-Ⅳ型澄清剂处理的提取液有絮凝物出现 , 离心
后液体清亮 , 其紫铆素含量为 14.42mg ·g -1 , 总黄酮含量为
309.5mg ·g -1 , 浸膏含量为 11.0mg ·mL -1;而未经处理的提
取液离心后不清亮 ,其紫铆素含量为 12.80mg ·g -1 ,总黄酮含
量为 405.5mg ·g -1 ,浸膏含量为 11.5mg ·mL -1。提示所优选
的澄清工艺可行 。
3 讨论
ZTC-Ⅳ型天然澄清剂由 A 、B 2组分组成 , 通过依次加
入 2组分 , 先与药液中的可溶性大分子形成复合物 , 进而形成
絮状物 ,经过滤或离心 ,以达到除杂目的 。根据使用天然澄清剂
的目的 , 本文以浸膏中紫铆素含量和浸膏中总黄酮含量作为考
察指标 ,两指标含量越高 ,表明除杂效果越好 [5 ] 。同时 ,考虑到
澄清过程除了除去蛋白质 、鞣质等物质外 , 还可造成其它组分
的丢失 , 由于中药成分的复杂性 , 以及存在许多可能对药效有
贡献的活性成分不甚清楚和中药治疗机制可能是多组分 、多靶
点的作用方式 , 因此认为过度的澄清可能使其它未知有效成分
损失过大 , 故将澄清后的浸膏量也作为综合评分的考察指标之
一 , 提取液经澄清剂澄清后浸膏量越高 , 提示其它组分损失可
能性越小 ,同时紫铆素和总黄酮的转移率越高 。
综合评分法的权重系数是按照各指标的重要程度给予
的 。本文根据测定指标与药效筛选结果的相关度以及各指标测
定方法的准确性确定权重系数 。由于在体外筛选试验中 , 紫铆
素和驱虫斑鸠菊总黄酮均有促进黑色素细胞增殖的作用 , 所以
权重系数较大;由于总黄酮采用以芦丁为对照品 , 以 NaNO 2-
Al(NO 3)3-NaOH 的显色反应方法进行含量测定 ,尽管此方法
应用很普遍 , 但与高效液相色谱法测定紫铆素含量比较 , 其分
析方法的专属性稍显不足 , 故确定紫铆素和总黄酮的权重系数
分别为 0.5和 0.4 ,而浸膏量的权重系数设定为 0.1。
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