全 文 :张月雅,顾德峰. 正交试验优化蓝靛果忍冬组织培养条件[J]. 江苏农业科学,2016,44(1):68 - 70,115.
doi:10. 15889 / j. issn. 1002 - 1302. 2016. 01. 017
正交试验优化蓝靛果忍冬组织培养条件
张月雅,顾德峰
(吉林农业大学园艺学院,吉林长春 130118)
摘要:以蓝靛果忍冬组培苗为材料,采用正交试验对影响蓝靛果忍冬分化、增殖、生根的因素进行优化筛选。结果
表明,蓝靛果忍冬分化的最优组合为 MS + 2. 0 mg /L 6 - BA + 0. 3 mg /L NAA + 30 g /L 蔗糖,分化率可达 98. 43%,各因
素的影响程度为 6 - BA > NAA >蔗糖;增殖的最优组合为 MS + 25 g /L 蔗糖 + 1. 5 mg /L 6 - BA + 0. 3 mg /L NAA,增殖
系数为 3. 81,各因素的影响程度为蔗糖 > 6 - BA > NAA;生根的最适宜培养基为 1 /2 MS + 0. 5 mg /L IBA + 1. 0 mg /L
NAA,生根率达 100%、平均生根数 5. 29 条、平均根长 1. 45 cm,各因素的影响程度为 IBA >基本培养基 > NAA。
关键词:蓝靛果忍冬;正交试验;组织培养;分化;增殖;生根
中图分类号:S663. 904 + . 3 文献标志码:A 文章编号:1002 - 1302(2016)01 - 0068 - 03
收稿日期:2015 - 01 - 09
基金项目:吉林省科技发展计划(编号:20110262)。
作者简介:张月雅(1993—),男,安徽合肥人,硕士研究生,主要从事
园林植物与观赏园艺研究。E - mail:tulipazhyy@ 163. com。
通信作者:顾德峰,教授,主要从事观赏园艺及组织培养工作。
E - mail:gu. df@ 163. com。
蓝靛果忍冬(Lonicera edulis Turcz.)为忍冬科忍冬属落叶
灌木,别称蓝靛果、羊奶子、黑瞎子果、山茄子,主要分布于我
国东北、华北、内蒙古等地区,在俄罗斯、日本、朝鲜等国也有
分布,是一种新兴野生浆果资源[1 - 2]。蓝靛果忍冬富含氨基
酸、维生素、矿质营养元素,营养保健价值极高,可鲜食或加工
为饮料、果酒、果酱、果糕。近年来,大量研究表明蓝靛果忍冬
的药用价值很高,具有清热解毒、稳定血压、改善肝脏、防止血
管破裂、抗疲劳、抗肿瘤[3 - 6]等功效。
正交设计试验是确定最佳试验方案的有效方法,具有省
时省力的优点。我国自 20 世纪 70 年代将正交设计应用于植
物组织培养,现已广泛应用于银杏等多种植物的组织培养条
件筛选中[7 - 13]。蓝靛果忍冬野生资源丰富,但其分布不均
匀,并随人类的大量采摘而日益减少。为使蓝靛果忍冬得到
广泛应用,大面积人工栽培开始兴起,利用转基因技术、组织
培养技术选育优良品种进行工厂化育苗已成为发展趋势。关
于蓝靛果忍冬组织培养的报道较多,而应用正交试验法优选
蓝靛果忍冬组织培养条件的研究则很少。本研究采用正交试
验方法对蓝靛果忍冬分化、增殖、生根培养基进行优化筛选,
为蓝靛果忍冬的种质保存、工厂化育苗提供技术支撑。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
试验于 2014 年 3—11 月在吉林农业大学园林生物技术
实验室进行,蓝靛果忍冬组培苗由该实验室提供。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 分化、增殖培养基筛选 本试验选用 MS 为基本培养
基,以蔗糖、6 - BA、NAA 的质量浓度为因素和水平,采用
L9(3
4)正交表设计 3 因素 3 水平正交试验。剪取约 2. 0 cm
的茎段,分别接种于各不同组合的培养基中。每个处理重复
3 次,每个重复接种 8 瓶,每瓶 5 个茎段。培养 30 d 后,分别
统计分化率及增殖系数。分化率 =分化苗茎段数 /接种茎段
数 × 100%;增殖系数 =增殖后不定芽总数 /接种不定芽总数。
1. 2. 2 生根培养基筛选 利用 L9(3
4)正交试验设计生根培
养基,以基本培养基(1 /4MS、1 /2MS、3 /4MS)、IBA(0. 5、1. 0、
1. 5 mg /L)、NAA(0. 5、1. 0、1. 5 mg /L)为 3 个因素,每个因素
设置 3 个水平。将分化增殖培养获得的健壮无菌苗切成
3. 0 ~ 3. 5 cm 的茎段,接种于上述培养基中。每个处理重复 3
次,每个重复接种 8瓶,每瓶 5个茎段。培养 42 d后,统计生根
率、平均生根数、平均根长。生根率 =生根茎段 /接种茎段 ×
100%;平均生根数(条)=总生根条数 /接种茎段数;平均根
长(cm)=根长总和 /总生根条数。
上述培养基均添加琼脂 11 g /L、蔗糖 25 g /L(分化、增殖
培养基除外),并将 pH 值调至 5. 8,于 121 ℃高压蒸汽灭菌
20 min。
1. 2. 3 培养条件 温度(25 ± 1)℃、光照时间 12 h /d、光照
强度 2 500 lx。
1. 2. 4 数据统计 采用 Excel 2010 软件、SPSS 17. 0 软件对
试验数据进行方差分析,采用 SSR 法进行差异显著性检验。
结果以“平均值 ±标准差”表示。
2 结果与分析
2. 1 不同蔗糖及激素质量浓度对蓝靛果忍冬分化的影响
由表 1 可知,不同蔗糖及激素质量浓度配比对蓝靛果忍
冬分化率的影响存在一定差异。其中组合 5 分化率最高为
88. 50%,组合 1 分化率最低为 56. 53%,两者相差 31. 97%。
就分化率而言,不同蔗糖、6 - BA、NAA 质量浓度的极差(R)
分别为 9. 17、17. 52、11. 21,表明各因素对蓝靛果忍冬分化率
影响的主次顺序为 6 - BA 质量浓度 > NAA 质量浓度 >蔗糖
质量浓度,即 6 - BA质量浓度对蓝靛果忍冬分化率的影响最
大,NAA质量浓度次之,蔗糖质量浓度的影响相对较小。各
元素最优水平为 2. 0 mg /L 的 6 - BA、0. 3 mg /L 的 NAA、
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30 g /L的蔗糖,因此可通过极差分析得到其分化的最优组合
为 MS +2. 0 mg /L 6 - BA +0. 3 mg /L NAA +30 g /L 蔗糖。正
交试验设计是一种均一设计,不可能包含所有组合处理,因此
该最优组合并未在试验中得以显示。经后期试验验证,该组
合分化率高于正交设计中所有其他组合,可达 98. 43%。由
方差分析结果(表 2)可知,各因素对分化率的影响差异极显
著(P < 0. 01)。根据 F 值大小(6 - BA,24. 203 > NAA,
11. 509 >蔗糖,8. 091)分析,影响分化率的主要因素为 6 - BA
质量浓度,此结果与极差分析结果一致。
表 1 不同蔗糖及激素质量浓度配比对蓝靛果忍冬分化率及增殖系数的影响
处理
蔗糖
(g /L)
6 - BA质量浓度
(mg /L)
NAA质量浓度
(mg /L)
分化率
(%) 增殖系数
1 20. 0 1. 0 0. 1 56. 53 ± 2. 73fE 1. 16 ± 0. 12dC
2 20. 0 1. 5 0. 2 59. 58 ± 2. 57efDE 1. 43 ± 0. 13dC
3 20. 0 2. 0 0. 3 77. 47 ± 0. 78bcABC 1. 81 ± 0. 05dBC
4 25. 0 1. 0 0. 2 58. 65 ± 1. 17efE 1. 57 ± 0. 12dC
5 25. 0 1. 5 0. 3 88. 50 ± 0. 28aA 3. 81 ± 0. 03aA
6 25. 0 2. 0 0. 1 72. 60 ± 1. 82cdBCD 2. 68 ± 0. 17bB
7 30. 0 1. 0 0. 3 66. 73 ± 2. 02deCDE 1. 94 ± 0. 06cdBC
8 30. 0 1. 5 0. 1 69. 96 ± 1. 04cdCDE 2. 02 ± 0. 08cdBC
9 30. 0 2. 0 0. 2 84. 41 ± 1. 77abAB 2. 47 ± 0. 22bcB
k1(分化率) 64. 53 60. 64 66. 36
k2(分化率) 73. 25 72. 68 67. 54
k3(分化率) 73. 70 78. 16 77. 57
R(分化率) 9. 17 17. 52 11. 21
k1(增殖系数) 1. 47 1. 56 1. 95
k2(增殖系数) 2. 68 2. 42 1. 82
k3(增殖系数) 2. 14 2. 32 2. 52
R(增殖系数) 1. 21 0. 86 0. 70
注:同列数据后不同小写字母、大写字母分别表示差异显著(P < 0. 05)、差异极显著(P < 0. 01)。下表同。
表 2 蓝靛果忍冬分化率及增殖系数方差分析
性状 变异来源 Ⅲ型平方和 自由度 均方 F值 P值
分化率 蔗糖 484. 355 2 242. 178 8. 091** 0. 003
6 - BA 1 448. 911 2 724. 456 24. 203** 0. 000
NAA 688. 980 2 344. 490 11. 509** 0. 000
误差 598. 649 20 29. 932
增殖系数 蔗糖 6. 585 2 3. 293 26. 080** 0. 000
6 - BA 4. 073 2 2. 036 16. 129** 0. 000
NAA 2. 595 2 1. 298 10. 277** 0. 001
误差 2. 525 20 0. 126
注:分化率 R2 = 0. 996(校正 R2 = 0. 994),增殖系数 R2 = 0. 981(校正 R2 = 0. 975);“**”表示在 0. 01 水平下差异极显著。
2. 2 不同蔗糖及激素质量浓度配比对蓝靛果忍冬增殖系数
的影响
由表 1 可知,3 种因素对蓝靛果忍冬增殖系数的影响由
大到小依次为蔗糖质量浓度、6 - BA 质量浓度、NAA 质量浓
度,R 值分别为 1. 21、0. 86、0. 70。可见,蔗糖质量浓度对蓝
靛果忍冬增殖的影响最大。结合方差分析结果(表 2)可知,
蓝靛果忍冬增殖的最佳组合为 MS + 25 g /L 蔗糖 + 1. 5 mg /L
6 - BA + 0. 3 mg /L NAA,为正交试验的处理 5。该处理的增
殖系数达 3. 81,与其他处理间差异极显著,且该处理的蓝靛
果忍冬叶片多而深绿,植株高大健壮。
2. 3 不同基本培养基及激素质量浓度配比对蓝靛果忍冬生
根的影响
在蓝靛果忍冬生根培养过程中,不同培养基、不同激素配
比组合对生根效果影响较大,生根率、平均生根数、平均根长
表现出不同变化规律(表 3)。由各因素对蓝靛果忍冬根系不
同性状影响的极差分析可知,对于生根率性状而言,基本培养
基极差为 13. 00,IBA极差为 25. 27,NAA 极差为 11. 38;对于
平均生根数而言,基本培养基极差为 0. 99,IBA 极差为 1. 54,
NAA极差为 0. 73;对于平均根长而言,基本培养基极差为
0. 31,IBA极差为 0. 52,NAA极差为 0. 22。从生根率、平均生
根数、平均根长的情况来看,IBA 质量浓度均是决定蓝靛果忍
冬生根最重要的因素。可见,对于基本培养基均有 k2 > k1 >
k3;对于 IBA均有 k1 > k2 > k3;对于 NAA均有 k2 > k3 > k1,方差
分析结果(表 4)表明各因素均达到显著差异水平(P <
0. 05)。
由 F值大小可知,各性状均以 IBA的 F值最大,表明 IBA
质量浓度是决定蓝靛果忍冬生根最重要的因素,此结论与极
差分析所得结论一致。在本试验设计范围内,得到蓝靛果忍
冬生根的较优组合为 1 /2 MS + 0. 5 mg /L IBA + 1. 0 mg /L
NAA(处理 4),此处理生根率高达 100%、平均生根数5. 29条、
平均根长 1. 45 cm,该处理所得蓝靛果忍冬的根数多、根系粗
壮、愈伤组织很少、组培苗生长良好。
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表 3 不同基本培养基及激素质量浓度配比对蓝靛果忍冬生根的影响
处理 基本培养基
IBA质量浓度
(mg /L)
NAA质量浓度
(mg /L)
生根率
(%)
平均生根数
(条)
平均根长
(cm)
1 1 /4 MS 0. 5 0. 5 95. 08 ± 0. 56abAB 4. 64 ± 0. 13bAB 1. 39 ± 0. 07aA
2 1 /4 MS 1. 0 1. 0 86. 70 ± 3. 07bcdABCD 3. 91 ± 0. 08cdBCD 1. 24 ± 0. 06abAB
3 1 /4 MS 1. 5 1. 5 56. 40 ± 5. 60gF 2. 48 ± 0. 10gF 0. 59 ± 0. 04eD
4 1 /2 MS 0. 5 1. 0 100. 00 ± 0. 00aA 5. 29 ± 0. 21aA 1. 45 ± 0. 05aA
5 1 /2 MS 1. 0 1. 5 90. 86 ± 0. 68abcABC 4. 24 ± 0. 11bcBC 1. 32 ± 0. 10abA
6 1 /2 MS 1. 5 0. 5 68. 95 ± 1. 95efgDEF 3. 14 ± 0. 08efDEF 0. 85 ± 0. 14cdeBCD
7 MS 0. 5 1. 5 81. 50 ± 2. 76cdeBCDE 3. 69 ± 0. 09cdeCD 1. 08 ± 0. 11bcABC
8 MS 1. 0 0. 5 63. 94 ± 2. 38fgEF 2. 64 ± 0. 09fgEF 0. 72 ± 0. 07deCD
9 MS 1. 5 1. 0 75. 40 ± 0. 56defCDE 3. 37 ± 0. 11deDE 0. 90 ± 0. 10cdBCD
k1(生根率) 79. 39 92. 19 75. 99
k2(生根率) 86. 60 80. 50 87. 37
k3(生根率) 73. 61 66. 92 76. 25
R(生根率) 13. 00 25. 27 11. 38
k1(平均根数) 3. 67 4. 54 3. 47
k2(平均根数) 4. 22 3. 59 4. 19
k3(平均根数) 3. 23 3. 00 3. 46
R(平均根数) 0. 99 1. 54 0. 73
k1(平均根长) 1. 07 1. 30 0. 98
k2(平均根长) 1. 21 1. 09 1. 20
k3(平均根长) 0. 90 0. 78 1. 00
R(平均根长) 0. 31 0. 52 0. 22
表 4 蓝靛果忍冬根系方差分析
性状 变异来源 Ⅲ型平方和 自由度 均方 F值 P值
生根率 基本培养基 762. 263 2 381. 132 7. 429** 0. 004
IBA 2 880. 983 2 1 440. 492 28. 077** 0. 000
NAA 758. 862 2 379. 431 7. 396** 0. 004
误差 1 026. 088 20 51. 304
平均根数 基本培养基 4. 437 2 2. 219 19. 518** 0. 000
IBA 10. 871 2 5. 436 47. 817** 0. 000
NAA 3. 125 2 1. 562 13. 744** 0. 000
误差 2. 274 20 0. 114
平均根长 基本培养基 0. 429 2 0. 214 8. 514** 0. 002
IBA 1. 254 2 0. 627 24. 900** 0. 000
NAA 0. 263 2 0. 131 5. 214* 0. 015
误差 0. 504 20 0. 025
注:生根率 R2 = 0. 994(校正 R2 = 0. 992),平均根数 R2 = 0. 994(校正 R2 = 0. 992),平均根长 R2 = 0. 985(校正 R2 = 0. 979);* 、**分别表
示差异显著(P < 0. 05)、差异极显著(P < 0. 01)。
3 结论
蓝靛果忍冬分化的最适培养基为MS +2. 0 mg /L 6 - BA +
0. 3 mg /L NAA +30 g /L 蔗糖,分化率可达 98. 43%。由蓝靛
果忍冬的增殖情况可知,MS +25 g /L 蔗糖 +1. 5 mg /L 6 - BA +
0. 3 mg /L NAA 培养基的组培苗叶片多、植株高大健壮,增殖
系数高达 3. 81,最适宜增殖。以 1 /2 MS + 0. 5 mg /L IBA +
1. 0 mg /L NAA 为蓝靛果忍冬的生根培养基,不仅根数多、根
系粗壮,且很少产生愈伤组织,组培苗生长良好。
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指出,盐胁迫条件下脯氨酸在植物体内大量积累是其对盐渍
逆境的一种适应反应,脯氨酸可作为细胞渗透调节物质,缓解
渗透胁迫,保护膜结构,减轻盐害;在盐胁迫条件下,由于盐中
所含 Na +在细胞中过度积累,将对质膜起到稳定和保护作用
的 Ca2 +置换掉,进而破坏了膜的完整性及稳定性,使其选择
透性丧失,细胞物质交换平衡破坏,生理生化代谢发生
紊乱[18]。
3. 2 盐胁迫对幼苗生长的影响及生理机制
从本研究苗期测定的各项指标可以看出,盐胁迫导致小
麦幼苗期根干质量、株高、幼苗干质量显著下降,可能是在盐
胁迫条件下,小麦幼苗中的可溶性蛋白质含量下降、膜脂过氧
化酶含量降低,而 MDA含量增加。前人研究表明,植物在受
到逆境胁迫时,体内细胞代谢的动态平衡会被打破,引起代谢
紊乱,植物自身将启动一系列保护系统,其中大部分可溶性蛋
白会作为酶类参与植株代谢过程,通过调节细胞渗透势和维
持渗透压平衡来抵御逆境伤害以维持植株的正常生理功能。
3. 3 外源物质 H2O2、GA3 对盐胁迫下种子萌发及幼苗生长
的影响
除了筛选耐盐种质资源,利用化学调控物质提高作物的
抗逆性也是近年来研究的一个热点[1]。从本研究结果可以
看出,外源物质 H2O2、GA3 处理可以增加小麦种子中的
α -淀粉酶活性及胚根中的 Ca2 +含量,降低胚根的质膜透性,
增加了盐胁迫条件下幼苗中膜脂过氧化酶及可溶性蛋白质含
量,降低了叶片中的丙二醛含量,进而提高了盐胁迫条件下种
子的萌发率以及幼苗期根干质量、株高、苗干质量,缓解了盐
胁迫对种子萌发及幼苗生长的影响。此外,本研究结果还表
明,相对耐盐的小麦品种德抗 961 在盐浓度逐渐增大的条件
下,种子萌发及幼苗生长阶段测定的各指标比盐敏感品种济
南 17 的变化趋势较缓,这也许是其在种子萌发及幼苗生长受
盐胁迫影响较小的生理原因。
综上所述,胚根质膜透性及幼苗中抗氧化酶类等的变化
是盐胁迫影响小麦种子萌发及幼苗生长的重要生理原因,为
筛选小麦耐盐种质资源提供了重要的理论依据。此外,通过
外源化学调控可以有效缓解盐胁迫的危害,因此,加强外源调
控的研究并将其与优异种质资源的筛选相结合,应用于小麦
栽培育种研究工作中,必将大大提高耐盐小麦的育种效率。
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—511—江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 1 期