全 文 ：·生物技术· 北方园艺２０１６（０１）：８０～８３
第一作者简介：王楠（１９８７－），女，硕士研究生，研究方向为园林植
物与观赏园艺。Ｅ－ｍａｉｌ：３７１６２２０７３＠ｑｑ．ｃｏｍ．
责任作者：王锦（１９６６－），女，博士，教授，现主要从事观赏园艺等教
学与科研工作。Ｅ－ｍａｉｌ：９０８５０５６８５＠ｑｑ．ｃｏｍ．
基金项目：云南省高校林下生物资源保护及利用科技创新团队资
助项目（５１４００６０５）；西南林业大学科学研究基金面上资助项目
（１１１１０５）。
收稿日期：２０１５－０９－２４
ＤＯＩ：１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１６０１０２１
铁线莲园艺品种ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应
体系优化与引物筛选
王 　 楠，王 　 锦，李 宗 艳，杨 坤 梅，何 　 辉，肖 振 东
（西南林业大学 园林学院，云南 昆明６５０２２４）
　　摘　要：以铁线莲的园艺品种Ｃｌｅｍａｔｉｓ‘Ｇｒａｖｅｔｙｅ　Ｂｅａｕｔｙ’为试材，采用改良ＣＴＡＢ法
提取其基因组ＤＮＡ为模板，采用单因子试验设计，研究模板ＤＮＡ含量、引物浓度、Ｍａｓｔｅｒ
Ｍｉｘ对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的影响，以期构建基于ＩＳＳＲ分子标记技术的铁线莲园艺品种遗传
图谱。结果表明：２５μＬ　Ｃ．‘Ｇｒａｖｅｔｙｅ　Ｂｅａｕｔｙ’ＩＳＳＲ－ＰＣＲ最佳反应体系的模板ＤＮＡ用量
５ｎｇ、引物浓度０．８μｍｏｌ／Ｌ、Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　１２μＬ；利用该体系从３８条ＩＳＳＲ引物中筛选出扩
增条带清晰、多态性好的１１条引物。
关键词：铁线莲园艺品种；ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系；引物筛选
中图分类号：Ｓ　６８２．２＋９　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１６）０１－００８０－０４
　　铁线莲属毛茛科铁线莲属（Ｃｌｅｍａｔｉｓ　Ｌ．）植物，多为
藤本，少数宿根草本，分布于热带、亚热带、温带和寒带
地区［１］。全世界共有３５５个种，我国１５５个种，全国各地
都有分布，尤以西南地区种类较多［２－５］。铁线莲园艺品
种花色丰富，花型多变，花期长，观赏价值很高，被誉为
“攀援植物皇后”，在世界园林中占有十分重要的地位［６］。
目前对铁线莲属植物的研究多集中在分类学、细胞学、系
统分类、引种栽培、病虫害防治和繁殖技术等方面［７］。现
采用ＩＳＳＲ分子标记技术，建立铁线莲园艺品种ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
最佳反应体系，以期为构建铁线莲园艺品种遗传图谱奠
定基础。
１　材料与方法
１．１　试验材料
供试材料为２０１０年２月从欧洲引进的铁线莲园艺
品种Ｃ．‘Ｇｒａｖｅｔｙｅ　Ｂｅａｕｔｙ’２年生种苗，栽植在西南林业
大学铁线莲种质资源圃。该试验所用Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ包含反
应缓冲液、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＣｌ２、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、ＰＣＲ反应优
化剂、增强剂和稳定剂，购于昆明硕阳科技有限公司。
１．２　试验方法
采集Ｃ．‘Ｇｒａｖｅｔｙｅ　Ｂｅａｕｔｙ’新鲜叶片，用７０％酒精擦
洗叶片表面，放于－７０℃冰箱保存。
１．２．１　基因组ＤＮＡ的提取　采用改良ＣＴＡＢ法［８］提
取Ｃ．‘Ｇｒａｖｅｔｙｅ　Ｂｅａｕｔｙ’基因组ＤＮＡ。
１．２．２　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应引物　试验所用的３８个ＩＳＳＲ引
物参考加拿大哥伦比亚大学（ＵＢＣ）公布引物。３８条引
物碱基序列见表１。
１．２．３　试验设计　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系中模板ＤＮＡ
含量、目标引物浓度、Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ因素采用单因子试
验设计。扩增反应程序为９５℃预变性３ｍｉｎ；９５℃变
性４５ｓ，５４℃退火４５ｓ，７２℃延伸９０ｓ，４０个循环；
７２℃延伸５ｍｉｎ；４℃保存。采用１．０％的琼脂糖凝胶
电泳检测扩增产物，最后在凝胶成像系统中进行拍照
分析。
２　结果与分析
２．１　基因组ＤＮＡ的提取结果
从图１电泳结果可以看出，１条整齐亮带，ＤＮＡ主
带清晰，无明显的ＲＮＡ带，无弥散现象。ＤＮＡ样品中
的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０均在１．８０～１．９０，提取的ＤＮＡ纯度较
高。把提取的 ＤＮＡ样品统一稀释到一定浓度后，
－２０℃保存。
０８
北方园艺２０１６（０１）：８０～８３ ·生物技术·
　　　　　　表１　 ３８条引物碱基序列
　　Ｔａｂｌｅ　１ Ｂａｓｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　３８ｐｒｉｍｅｒｓ
引物 引物序列（５′～３′） 引物 引物序列（５′～３′） 引物 引物序列（５′～３′）
Ｐｒｉｍｅｒ　 Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′－３′） Ｐｒｉｍｅｒ　 Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′－３′） Ｐｒｉｍｅｒ　 Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′－３′）
ＩＳＳＲ－８３３ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴ　 ＵＢＣ－８３４ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＹＴ　 ＵＢＣ－８６７ ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ
ＩＳＳＲ－８２７ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＧ　 ＵＢＣ－８３５ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＹＣ　 ＵＢＣ－８６８ ＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ
ＵＢＣ－８０１ ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴ　 ＵＢＣ－８３６ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＹＡ　 ＵＢＣ－８７２ ＧＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＡ
ＵＢＣ－８０４ ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡ　 ＵＢＣ－８４０ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＹＴ　 ＵＢＣ－８７３ ＧＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡ
ＵＢＣ－８０８ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣ　 ＵＢＣ－８４１ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＹＣ　 ＵＢＣ－８７６ ＧＡＴＡＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＣＡ
ＵＢＣ－８０９ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧ　 ＵＢＣ－８４２ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＹＧ　 ＵＢＣ－８８０ ＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡ
ＵＢＣ－８１１ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣ　 ＵＢＣ－８４６ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＲＴ　 ＵＢＣ－８８４ ＨＢＨＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧ
ＵＢＣ－８１２ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡ　 ＵＢＣ－８４７ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＲＣ　 ＵＢＣ－８８９ ＤＢＤＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ
ＵＢＣ－８１５ ＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧ　 ＵＢＣ－８４８ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＲＧ　 ＵＢＣ－８９５ ＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣ
ＵＢＣ－８１７ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡ　 ＵＢＣ－８５５ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＹＴ　 ＵＢＣ－８９８ ＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴＮＮＮＮＮＮＡＴＧＴＧＧ
ＵＢＣ－８１８ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＧ　 ＵＢＣ－８６０ ＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＲＡ　 ＵＢＣ－８９９ ＣＡＴＧＧＴＧＴＴＧＧＴＣＡＴＴＧＴＴＣＣＡ
ＵＢＣ－８２０ ＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＣ　 ＵＢＣ－８６２ ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ　 ＵＢＣ－９００ ＡＣＴＴＣＣ　ＣＣＡＣＡＧＧＴＴＡＡＣＡＣＡ
ＵＢＣ－８２５ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＴ　 ＵＢＣ－８６４ ＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧ
　　注：１～４　Ｃ．‘Ｇｒａｖｅｔｙｅ　Ｂｅａｕｔｙ’ＤＮＡ。Ｃ１＝５６８．５０，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝
１．８６；Ｃ２＝２９７．８０，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．８４；Ｃ３＝２３５．３８，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝
１．８０；Ｃ４＝６９２．２６，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．８７。
Ｎｏｔｅ：１－４　Ｃ．‘Ｇｒａｖｅｔｙｅ　Ｂｅａｕｔｙ’ＤＮＡ．Ｃ１＝５６８．５０，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝
１．８６；Ｃ２＝２９７．８０，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．８４；Ｃ３＝２３５．３８，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝
１．８０；Ｃ４＝６９２．２６，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．８７．
图１　Ｃ．‘Ｇｒａｖｅｔｙｅ　Ｂｅａｕｔｙ’基因组ＤＮＡ电泳
Ｆｉｇ．１　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｒｅｓｉｓ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ
Ｃ．‘Ｇｒａｖｅｔｙｅ　Ｂｅａｕｔｙ’
２．２　目标引物的确定
从３８个ＩＳＳＲ引物中随机选择８个引物８０８、８１１、
８１７、８４０、８４７、８６０、８７３、８８９进行目标引物初筛，ＩＳＳＲ引
　　　　
物由上海生物工程技术有限公司合成。ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应
体系确定为２５μＬ，模板ＤＮＡ　１０ｎｇ，Ｍｉｘ　１２．５μＬ，引
物１μｍｏｌ／Ｌ，双蒸水找平。扩增反应程序为９５℃预变
性３ｍｉｎ；９５℃变性４５ｓ，５４℃退火４５ｓ，７２℃延伸９０ｓ，４０
个循环；７２℃延伸５ｍｉｎ；４℃保存。采用１．０％的琼脂糖
凝胶电泳检测扩增产物，最后在凝胶成像系统中进行拍
照分析。８个引物的扩增结果见图２。比较扩增条带的清
晰度和多态性，引物ＵＢＣ－８４７效果最好，所以选择引物
ＵＢＣ－８４７为目标引物进行后续ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系建立。
２．３　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ最佳反应体系建立
ＩＳＳＲ扩增反应中，模板ＤＮＡ的用量对扩增结果有
较大影响，ＤＮＡ浓度过低会造成分子碰撞的几率降低，
导致偶然性增加，扩增产物具不稳定性；ＤＮＡ浓度过高
会加大非特异产物的扩增，且不同物种所需要的最佳模
板ＤＮＡ浓度范围不同。因此确定适合的模板ＤＮＡ用
量非常重要。不同模板ＤＮＡ的用量都能扩出清晰的条
带，当模板ＤＮＡ浓度在５．０ｎｇ／２５μＬ时扩增条带最亮；
当浓度超过１０．０ｎｇ／２５μＬ时，扩增条带的亮度逐渐降
低。模板ＤＮＡ浓度在５．０～１５．０ｎｇ／２５μＬ范围变化时，
　　
　　注：１～２引物８０８，３～４引物８１１，５～６引物８１７，７～８引物８４０，９～１０引物８４７，１１～１２引物８６０，１３～１４引物８７３，１５～１６引物８８９。
Ｎｏｔｅ：１－２ｐｒｉｍｅｒ　８０８，３－４ｐｒｉｍｅｒ　８１１，５－６ｐｒｉｍｅｒ　８１７，７－８ｐｒｉｍｅｒ　８４０，９－１０ｐｒｉｍｅｒ　８４７，１１－１２ｐｒｉｍｅｒ　８６０，１３－１４ｐｒｉｍｅｒ　８７３，１５－１６ｐｒｉｍｅｒ　８８９．
图２　８条引物的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增
Ｆｉｇ．２　Ｅｉｇｈｔ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ
１８
·生物技术· 北方园艺２０１６（０１）：８０～８３
扩增出来的条带数基本一致，当浓度超过１５．０ｎｇ／２５μＬ
时，扩增条带数减少。由此可知，在２５μＬ的反应体系
中，５ｎｇ为最佳模板用量（图３）。
注：Ｍ１－５ｎｇ，Ｍ２－１０ｎｇ，Ｍ３－１５ｎｇ，Ｍ４－３０ｎｇ，Ｍ５－５０ｎｇ，Ｍ６－７０ｎｇ。
Ｎｏｔｅ：Ｍ１－５ｎｇ，Ｍ２－１０ｎｇ，Ｍ３－１５ｎｇ，Ｍ４－３０ｎｇ，Ｍ５－５０ｎｇ，Ｍ６－７０ｎｇ．
图３　模板ＤＮＡ用量对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的影响
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　ｏｎ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ
从图４可以看出，在６个不同引物浓度梯度中，浓
度为０．４μｍｏｌ／Ｌ时，扩增出来的条带较少，当增至０．８～
１．２μｍｏｌ／Ｌ时扩增出来的条带数量多、清晰且较亮。浓
度升高到１．６～３．２μｍｏｌ／Ｌ时，扩增条带逐渐变少且模
糊。考虑节约成本，ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的适宜引物浓度为
０．８μｍｏｌ／Ｌ。
Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ具有稳定性好、灵敏度高、快速简便、特
异性强等优点。由图５可知，随 Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ加入量增
加，扩增条带变亮。当 Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ加入量小于１１μＬ
时，扩增条带模糊且数量较少。当加入量在１２～１５μＬ
时扩增条带稳定清晰。考虑节约成本，１２μＬ为 Ｍａｓｔｅｒ
Ｍｉｘ最佳用量。
单因子试验结果得出２５μＬ　Ｃ．‘Ｇｒａｖｅｔｙｅ　Ｂｅａｕｔｙ’
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ最佳反应扩增体系ＤＮＡ用量为５ｎｇ，引物浓
度为０．８μｍｏｌ／Ｌ，Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ用量为１２μＬ。
　　注：Ｍ１－０．４μｍｏｌ／Ｌ，Ｍ２－０．８μｍｏｌ／Ｌ，Ｍ３－１．２μｍｏｌ／Ｌ，Ｍ４－１．６μｍｏｌ／Ｌ，
Ｍ５－２．４μｍｏｌ／Ｌ，Ｍ６－３．２μｍｏｌ／Ｌ。
Ｎｏｔｅ：Ｍ１－０．４μｍｏｌ／Ｌ，Ｍ２－０．８μｍｏｌ／Ｌ，Ｍ３－１．２μｍｏｌ／Ｌ，Ｍ４－１．６μｍｏｌ／Ｌ，
Ｍ５－２．４μｍｏｌ／Ｌ，Ｍ６－３．２μｍｏｌ／Ｌ．
图４　引物浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的影响
Ｆｉｇ．４　Ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ＩＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒ　ｏｎ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ
注：Ｍ１－９μＬ，Ｍ２－１０μＬ，Ｍ３－１１μＬ，Ｍ４－１２μＬ，Ｍ５－１３μＬ，Ｍ６－１５μＬ。
Ｎｏｔｅ：Ｍ１－９μＬ，Ｍ２－１０μＬ，Ｍ３－１１μＬ，Ｍ４－１２μＬ，Ｍ５－１３μＬ，Ｍ６－１５μＬ．
图５　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ用量对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的影响
Ｆｉｇ．５　Ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ｏｎ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ
　　严格来说，退火温度并不一定等于其Ｔｍ 值，而在
Ｔｍ 值附近波动，参考不同引物的Ｔｍ 值，利用梯度ＰＣＲ
确定该引物的最佳退火温度。以引物８２５（Ｔｍ＝５２．２℃）
为例，设定退火温度梯度分别为４６．７、４６．９、４７．７、４８．９、
　　　　
注：Ｍ１－４６．７℃，Ｍ２－４６．９℃，Ｍ３－４７．７℃，Ｍ４－４８．９℃，Ｍ５－５０．２℃，Ｍ６－５１．５℃，Ｍ７－５２．８℃，Ｍ８－５４．２℃，Ｍ９－５５．５℃，Ｍ１０－５６．７℃，Ｍ１１－５７．４℃，Ｍ１２－５７．７℃。
Ｎｏｔｅ：Ｍ１－４６．７℃，Ｍ２－４６．９℃，Ｍ３－４７．７℃，Ｍ４－４８．９℃，Ｍ５－５０．２℃，Ｍ６－５１．５℃，Ｍ７－５２．８℃，Ｍ８－５４．２℃，Ｍ９－５５．５℃，Ｍ１０－５６．７℃，Ｍ１１－５７．４℃，Ｍ１２－５７．７℃．
图６　退火温度对引物８２５ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的影响
Ｆｉｇ．６　Ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｎ　８２５ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ
２８
北方园艺２０１６（０１）：８０～８３ ·生物技术·
５０．２、５１．５、５２．８、５４．２、５５．５、５６．７、５７．４、５７．７℃。从图６
可以看出，退火温度小于５６．７℃时扩增的条带较少、大
片段带较多且背景模糊。退火温度在５７．４℃时扩增的
条带数最多，效果最好。当退火温度高于５７．４℃时，扩
增条带开始减少。
通过退火温度梯度设置，采用所得ＩＳＳＲ－ＰＣＲ最佳
反应扩增体系对３８个引物进行初筛和复筛，选择出条
带比较清晰且多态性好的１１条引物及其最佳退火温度
（表２）。
　　表２ 引物筛选及最佳退火温度
　　Ｔａｂｌｅ　２ Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ℃
引物 Ｔｍ 值 退火温度 引物 Ｔｍ 值 退火温度 引物 Ｔｍ 值 退火温度
Ｐｒｉｍｅｒ　 Ｔｍｖａｌｕｅ　 Ａｎｎｃｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　 Ｐｒｉｍｅｒ　 Ｔｍｖａｌｕｅ　 Ａｎｎｃｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　 Ｐｒｉｍｅｒ　 Ｔｍｖａｌｕｅ　 Ａｎｎｃｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ＵＢＣ－８１２　 ５２．２　 ５２．８ ＵＢＣ－８３４　 ５３．９　 ５３．２ ＵＢＣ－８４８　 ５６．２　 ５４．２
ＵＢＣ－８１７　 ５２．２　 ５２．８ ＵＢＣ－８３６　 ５３．９　 ５０．６ ＵＢＣ－８７３　 ５１．６　 ５３．６
ＵＢＣ－８１８　 ５４．６　 ５３．９ ＵＢＣ－８４１　 ５６．２　 ５８．２ ＵＢＣ－８８０　 ５３．６　 ５１．９
ＵＢＣ－８２５　 ５２．２　 ５７．４ ＵＢＣ－８４７　 ５６．２　 ５６．８
３　结论与讨论
该试验结果表明，２５μＬＣ．‘Ｇｒａｖｅｔｙｅ　Ｂｅａｕｔｙ’ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
最佳反应扩增体系的模板ＤＮＡ用量为５ｎｇ，引物浓度
为０．８μｍｏｌ／Ｌ，Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ用量为１２μＬ。利用该体系
从３８条ＩＳＳＲ引物中筛选出扩增条带清晰、多态性好的
１１条引物。
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ是基于ＰＣＲ的分子标记技术，与其它
基于ＰＣＲ的反应技术一样，其扩增会受到诸多因素的
影响。因此为获得可靠性和重复性较高的ＩＳＳＲ带谱，
十分有必要对它的反应体系进行优化。引物浓度是影
响ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增的一个重要因素。引物浓度过低，
会使扩增产量下降，可能会出现Ｓｍｅａｒ现象，而引物浓
度过高，易引起碱基错配和产生非特异性扩增。在
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应中使用 Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ能够很好的解决反
应体系中ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、Ｍｇ２＋浓度的配比
问题。不仅缩短了试验时间还可有效地避免人为操作
污染。关于引物的退火温度，从理论上讲，退火温度
高，特异性强，但温度过高，不利于引物和模板结合。
温度太低，会造成引物与模板配错，从而使特异性大大
降低。
参考文献
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Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ
Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｃｌｅｍａｔｉｓ
ＷＡＮＧ　Ｎａｎ，ＷＡＮＧ　Ｊｉｎ，ＬＩ　Ｚｏｎｇｙａｎ，ＹＡＮＧ　Ｋｕｎｍｅｉ，ＨＥ　Ｈｕｉ，ＸＩＡＯ　Ｚｈｅｎｄｏｎｇ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌａｎｄｓｃａｐｅ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ　６５０２２４）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡＣｌｅｍａｔｉｓ　ｇａｒｄｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ（Ｃｌｅｍａｔｉｓ‘Ｇｒａｖｅｔｙｐｅ　Ｂｅａｕｔｙ’）ｗａｓ　ｃｈｏｓｅｎ　ａｓ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｔｏ　ｂｕｉｌｔ　ｔｈｅ
ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｐ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＩＳＳＲ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｍａｒｋｅｒ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ‘Ｇｒａｖｅｔｙｅ　Ｂｅａｕｔｙ’ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ＤＮＡ
ｍｏｄｅｌ，ａｎｄ　ｓｉｍｐｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｉｍｐａｃｔｓ　ｏｆ　ｍｏｄｅｌ　ＮＤＡ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｐｒｉｍｅｒ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ｏｎ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗａｓ　ＤＮＡ　ｍｏｄｅｌ　５ｎｇ，
ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　０．８μｍｏｌ／Ｌ，Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　１２μＬ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｗｈｏｌｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗａｓ　２５μＬ．Ｕｓｉｎｇ　ｔｈｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ，１１
ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｉｔｈ　ｃｌｅａｒ　ｓｔｒｉｐｅ　ａｎｄ　ｇｏｏｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　３８ＩＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｌｅｍａｔｉｓ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ；ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ；ｐｒｉｍｅｒ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
３８