全 文 ：书虉草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系优化与引物筛选
张永亮，刘　鹏，骆秀梅，刘　杨
（内蒙古民族大学，内蒙古 通辽　０２８０４２）
　　摘要：２２个虉草基因组ＤＮＡ为ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增模板，采用单因素试验方法，对影响ＰＣＲ扩增体系
中ｄＮＴＰ、引物浓度、Ｔａｑ酶和模板ＤＮＡ用量４个因素及引物退火温度进行梯度试验，优化得到最佳的
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系，即２０μＬ反应体系中分别加入０．３μＬ　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ），２μＬ　１０×ＰＣＲ
Ｂｕｆｆｅｒ（ｍｇ２＋ｐｌｕｓ），１．５μＬ　ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），１．５μＬ引物（１０ｐｍｏｌ／μＬ），５０ｎｇ模板ＤＮＡ，ｄｄＨ２Ｏ
补足体积。以此体系对２４条引物进行筛选，最终获得了多态性高，重复性好的引物１２条。引物
ＵＢＣ８０８、８０９、８１１、８１５、８１８、８２０、８２６的适宜退火温度为５５℃，引物８３５，８４１和８４２的适宜退火温度为
５６℃，而引物８１０和８３４的适且退火温度分别为５２℃和５４℃。１２条引物共扩增总条带数１９２条，其中，
多态性条带数１７３条，多态位点百分率８９．８１％。
　　关键词：虉草；ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系；引物筛选
　　中图分类号：Ｓ　５４３；Ｑ　７８６　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９－５５００（２０１６）０３－０００１－０７
　　收稿日期：２０１５－１２－１６；修回日期：２０１６－０１－０３
　　基金项目：内蒙古自然科学基金（２０１５ＭＳ０３３７）；内蒙古民
族大学市校合作项目（ＳＸＹＢ２０１２０７７）资助
　　作者简介：张永亮（１９５９－），男，内蒙古包头人，教授，博士，
主要从事牧草栽培与种质资源评价研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｙｌ８８０２＠１６３．ｃｏｍ
　　虉草（Ｐｈａｌａｒｉｓ　ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ），属于禾本科（Ｇｒａ－
ｍｉｎｅａｅ）、虉草属植物，别名草芦、园草芦。主要分布于
欧洲、北美和亚洲，在我国主要分布于东北、华北、华
中、华东等地区。虉草耐盐碱、耐湿涝，又耐旱，生长
快，营养繁殖能力强，产草量高、叶量丰富，蛋白质含量
高，被广泛用于饲草、人工湿地植物、生物能源材料或
造纸原料等［１－２］。国内有关虉草的耐盐性和生产性能
已有较多报道［３－７］，而有关虉草分子标记研究甚少［８］。
因此，试验旨在通过研究ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应中各项参数
变化对试验结果的影响，并对反应体系进行优化，建立
适用于虉草的ＩＳＳＲ反应体系，并进行ＩＳＳＲ引物筛
选，为进一步研究虉草种群遗传多样性奠定基础。
ＩＳＳＲ是一种建立在ＰＣＲ反应基础上的ＤＮＡ分
子标记技术，由加拿大蒙特利尔大学的Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ
等［９］于１９９４年创建。ＩＳＳＲ技术可重复性强，多态性
更好，而且不需知道被检测物种任何基因组的信息，因
此，ＩＳＳＲ 标记被广泛应用于植物遗传多样性研
究［１０－１２］。ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应结果主要受到Ｔａｑ　ＤＮＡ聚
合酶、引物、模板、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ等 ５ 种 因 素 的 影
响［１３－１７］。试验以２２个虉草基因组ＤＮＡ 为模板，采
用单因素试验设计方法，通过研究ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应中
各项参数变化对试验结果的影响，优化ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反
应体系，筛选出适合虉草ＩＳＳＲ 研究的引物，旨在建
立适合虉草的ＩＳＳＲ反应体系，为虉草遗传多样性、
种质资源筛选和分子标记辅助育种等方面的研究奠
定基础。
１　材料和方法
１．１　供试材料
供试２２份虉草材料及其来源见表１。在实验室
内用花盆培养，待幼苗生长至４～５片叶时摘取植株顶
部以下第２片嫩叶用于基因组ＤＮＡ的提取。
１．２　虉草基因组ＤＮＡ的提取及检测
试验采用新型快速植物基因组ＤＮＡ 提取试剂盒
（北京天根生化科技有限公司，离心柱型），提取虉草基
因组ＤＮＡ，方法按照说明书进行。
用１．０％琼脂糖凝胶电泳检测ＤＮＡ质量，取５μＬ
模板ＤＮＡ，混合１μＬ　６×Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ，设标准分子
量为ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ，缓冲电压设为１００Ｖ稳定电压
（５ｖ／ｃｍ２），１×ＴＡＥ缓冲液电泳９０ｍｉｎ分离，ＥＢ（溴
１第３６卷　第３期　　　　　　　　　　　草 原 与 草 坪２０１６年
DOI:10.13817/j.cnki.cyycp.2016.03.001
表１　２２分不同产地的虉草
Ｔａｂｌｅ　１　Ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　２２ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｐｈａｌａｒｉｓ　ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ
代码 种质材料名称 材料来源
１ 虉草 甘肃兰州
２ 虉草 美国
３ 虉草 江西庐山
４ 虉草 湖北武汉
５ 虉草 新疆富蕴县
６ 虉草 加拿大
７ 虉草 俄罗斯阿尔汉格尔斯克
８ 虉草 俄罗斯加里宁格勒
９ 虉草 俄罗斯卡累利亚
１０ 虉草 俄罗斯新西伯利亚
１１ 虉草 俄罗斯．梁赞地区
１２ 虉草 俄罗斯萨马拉地区
１３ 虉草 俄罗斯塔波夫地区
１４ 虉草 俄罗斯鄂木斯克地区
１５ 虉草 俄罗斯滨海边疆区
１６ 虉草 俄罗斯库页岛地区
１７ 川引３号虉草 四川红原
１８ 野生虉草 江苏镇江
１９ 通草１号虉草 内蒙古通辽
２０ 野生虉草 黑龙江哈尔滨
２１ 野生虉草 内蒙通辽
２２ 美国虉草 美国
　　注：供试材料１～１６号来源于国家草种质资源中期库
化乙锭）染色。电泳结果采用凝胶成像系统检测并记
录。根据电泳检测结果，将符合要求的ＤＮＡ 溶液分
装于１．５ｍＬ的离心管中，在－２０℃保存备用。
１．３　虉草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立及优化
根据有关禾本科牧草ＩＳＳＲ 分子标记相关文
献［１８－２２］，从１００条ＩＳＳＲ引物中挑选出２４条引物（表
２）。引物序列由上海生物工程技术服务有限公司合
成，ｄＮＴＰ和Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶购于ＴａＫａＲａ公司。
针对模板 ＤＮＡ 浓度、ｄＮＴＰ 浓度、引物浓度、
ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度 （１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ，含 ２μＬ
ｍｇ２＋）等影响因素，利用单因素水平梯度试验对ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ反应体系中的各个因素的适宜浓度进行单因素
梯度试验逐一优化。在确定最佳反应条件时，参照文
献［１３－１７］中的ＩＳＳＲ扩增程序和反应体系进行，对
反应体系各因素设置不同梯度水平（表３），２μＬ　１０×
ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ），以ＤＬ２０００作为对照。当试
验中对某一因素进行梯度设置时，其余因素均保持不
变。在最佳反应体系确定的基础上，再进一步筛选每
一个引物的最佳退火温度。
表２　ＩＳＳＲ标记的引物
Ｔａｂｌｅ　２　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｏｆ　ＩＳＳＲ
引物编号 序列 引物编号 序列 引物编号 序列
ＵＢＣ　８０７ （ＡＧ）８Ｔ ＵＢＣ　８１６ （ＣＡ）８Ｔ ＵＢＣ　８２５ （ＡＣ）８Ｔ
ＵＢＣ　８０８ （ＡＧ）８Ｃ ＵＢＣ　８１７ （ＣＡ）８Ａ ＵＢＣ　８２６ （ＡＣ）８Ｃ
ＵＢＣ　８０９ （ＡＧ）８Ｇ ＵＢＣ　８１８ （ＣＡ）８Ｇ ＵＢＣ　８３０ （ＴＧ）８Ｇ
ＵＢＣ　８１０ （ＧＡ）８Ｔ ＵＢＣ　８１９ （ＧＴ）８Ａ ＵＢＣ　８３４ （ＡＧ）８ＹＴ
ＵＢＣ　８１１ （ＧＡ）８Ｃ ＵＢＣ　８２０ （ＧＴ）８Ｃ ＵＢＣ　８３５ （ＡＧ）８ＹＣ
ＵＢＣ　８１２ （ＧＡ）８Ａ ＵＢＣ　８２１ （ＧＴ）８Ｔ ＵＢＣ　８４０ （ＧＡ）８ＹＴ
ＵＢＣ　８１３ （ＣＴ）８Ｔ ＵＢＣ　８２２ （ＴＣ）８Ａ ＵＢＣ　８４１ （ＧＡ）８ＹＣ
ＵＢＣ　８１５ （ＣＴ）８Ｇ ＵＢＣ　８２３ （ＴＣ）８Ｃ ＵＢＣ　８４２ （ＧＡ）８ＹＧ
　　注：＊ Ｙ＝（Ｃ，Ｔ）
表３　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的因素和水平
Ｔａｂｌｅ　３　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ
因素
水平
１　 ２　 ３　 ４
Ｔａｑ酶／μＬ　 ０．１　 ０．２　 ０．３　 ０．４
引物／μＬ　 ０．５　 １．０　 １．５　 ２．０
ｄＮＴＰ／μＬ　 ０．５　 １．０　 １．５　 ２．０
模板ＤＮＡ／ｎｇ　 ３０．０　４０．０　５０．０　６０．０
１．４　引物的筛选
根据确定的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系及反应程序，选
取２个虉草ＤＮＡ模板对２４条ＩＳＳＲ引物进行初步筛
选。选取扩增稳定、条带多、信号强、背景清晰的引物
用于后续的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应。
１．５　ＰＣＲ扩增及扩增产物的检测和分析
ＰＣＲ扩增反应完成后，用预先制好的浓度为
２．０％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。缓冲电压设为
９０Ｕ，１×ＴＡＥ缓冲液电泳分离，待溴酚蓝迁移至凝胶
的２／３处，停止电泳，取出凝胶置于紫外凝胶自动成像
仪拍照并保存。根据ＩＳＳＲ－ＰＣＲ分子标记的原理及方
法对扩增产物进行比较分析，确定最佳虉草ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ反应体系及扩增程序。
２ 　　　　　　ＧＲＡＳＳＬＡＮＤ　ＡＮＤ　ＴＵＲＦ（２０１６）　　　　　　　　　　　　Ｖｏｌ．３６Ｎｏ．３
２　结果与分析
２．１　ＤＮＡ检测
通过琼脂糖电泳检测ＤＮＡ质量，图１中ＤＮＡ电
泳带没有拖尾现象且图像较为清楚，可知所提 ＤＮＡ
纯度较高，ＲＮＡ和蛋白质含量较少，符合ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
分析要求。
２．２　ＰＣＲ反应体系对虉草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增的影响
２．２．１　ｄＮＴＰ浓度对虉草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增的影响　
ｄＮＴＰ是ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的原料底物，对扩增条带有
很大的影响。浓度过高会出现非特异性扩增，浓度太
低则扩增产物不完全，导致产率下降。试验表明，
ｄＮＴＰ添加量为０．５μＬ和１．０μＬ时扩增条带较弱；
添加量为１．５μＬ时扩增出的条带最清晰，并且多态性
好（图２）。但当添加量为２．０μＬ时，扩增条带的亮度
较１．５μＬ时的扩增条带暗，综合考虑，选择１．５μＬ作
为ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系中ｄＮＴＰ的最佳添加量。
２．２．２　模板ＤＮＡ浓度对虉草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增的影
响　试验结果表明ＤＮＡ 浓度在３０和４０ｎｇ时，扩增
条带弱，５０和６０ｎｇ时条带比较完整，其中５０ｎｇ时条
带最为清晰（图３）。综合考虑，选择５０ｎｇ作为ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ反应体系中模板ＤＮＡ的最佳浓度。
图１　２２份虉草基因组ＤＮＡ电泳图
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｎ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｏｆ　２２　Ｐｈａｌａｒｉｓ　ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ
注：从左到右依次为ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ、品种代号１～２２号
图２　不同ｄＮＴＰ浓度下ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增
Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄＮＴＰｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
注：从左到右依次为ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ、０．５、１．０、１．５、２．０μＬ
２．２．３　引物浓度对虉草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增的影响　在不
同引物浓度下所扩增出的条带，当添加量为０．５μＬ时，
扩增产物不完全，且条带清晰度不高。当添加量为１．０
和１．５μＬ时，反应稳定，条带清晰，从扩增效果图中可
以看出添加量为１．５μ条带更容易辨别（图４）。当添加
量为２．０μＬ时，产生非特异性扩增。综合分析，选择
１．５μＬ作为ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系中引物的最佳添加量。
２．２．４　Ｔａｑ酶浓度对虉草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增的影响　
当Ｔａｑ酶用量为０．１μＬ和０．２μＬ时合成效率低；用
量为０．３μＬ和０．４μＬ时，扩增条带多态性好并且条
带清晰易分辨（图５）。结合整个试验成本等因素综合
考虑，选用０．３μＬ的Ｔａｑ酶用量作为ＩＳＳＲ－ＰＣＲ 反
应体系中引物的最佳浓度。
图３　不同ＤＮＡ浓度下ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
注：从左至右依次为ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ、３０、４０、５０、６０ｎｇ
图４　不同引物浓度下ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增
Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
注：从左至右依次为ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ、０．５、１．０、１．５、２．０μＬ
３第３６卷　第３期　　　　　　　　　　　草 原 与 草 坪２０１６年
图５　不同Ｔａｑ酶下的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增
Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
注：从左至右依次为ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ、０．１、０．２、０．３、
０．４μＬ
２．３　虉草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ最佳反应体系的确定
通过诸多因素的优化试验分析，筛选出了虉草的
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ最佳反应体系和最适扩增程序。反应体系
为２０μＬ，其中，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶０．３μＬ、１０×ＰＣＲ
Ｂｕｆｆｅｒ　２μＬ、ｄＮＴＰ　１．５μＬ、模板ＤＮＡ５０ｎｇ、引物１．５
μＬ、ｄｄＨ２Ｏ　１３．７μＬ。
２．４　最适退火温度和ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增程序的确定
根据上海生物工程技术服务有限公司推荐的引物
退火温度范围，对２２份不同产地虉草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ退火
温度、时间与循环次数进行单因素试验表明，引物
ＵＢＣ８０８、８０９、８１１、８１５、８１８、８２０、８２６适宜退火温度为
５５℃，引物８３５，８４１和８４２适宜退火温度为５６℃，而
引物８１０和８３４退火温度分别为５２℃和５４℃时才能
得到稳定、清晰的特异性谱带。ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增的程
序第１阶段，９４℃预变性５ｍｉｎ；第２阶段，９４℃变性
４５ｓ、退火６０ｓ（退火温度参照所用引物的最适温度）、
７２℃延伸１２０ｓ，共进行３５个循环；第三阶段，７２℃延
伸１０ｍｉｎ。
２．５　最佳反应体系的验证
运用单因素试验所获得的最佳反应体系和最适退
火温度，通过多次验证得出的最适扩增程序，随机选用
引物ＵＢＣ８１０、８１８、８２６和８４２对２２份不同产地的虉
草材料进行ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增（图６～９）。结果表明，４
个供试引物的扩增条带都比较清晰，多态性较丰富，稳
定性和重复性好。表明运用单因素试验所获得的最佳
反应体系和最适退火温度可以作为虉草基因组ＤＮＡ
的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的最佳优化体系。
２．６　引物筛选
根据ＰＣＲ产物电泳图，以扩增条带数及多态性条
带数为筛选条件，从２４条ＩＳＳＲ引物中共筛选出１２
条较适宜虉草分子标记的引物（表４）。这１２条引物
平均扩增总条带数１６条，平均多态性条带数１４．４条，
平均多态百分率８９．８１％。
图６　引物ＵＢＣ８１０对２２个不同产地虉草材料的扩增
Ｆｉｇ．６　ＵＢＣ８１０ｐｒｉｍｅｒ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　２２　Ｐｈａｌａｒｉｓ　ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ
图７　引物ＵＢＣ８１８对２２个不同产地虉草材料的扩增
Ｆｉｇ．７　ＵＢＣ８１８ｐｒｉｍｅｒ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　２２　Ｐｈａｌａｒｉｓ　ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ
４ 　　　　　　ＧＲＡＳＳＬＡＮＤ　ＡＮＤ　ＴＵＲＦ（２０１６）　　　　　　　　　　　　Ｖｏｌ．３６Ｎｏ．３
图８　引物ＵＢＣ８２６对２２个不同产地虉草材料的扩增结果
Ｆｉｇ．８　ＵＢＣ８２６ｐｒｉｍｅｒ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　２２　Ｐｈａｌａｒｉｓ　ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ
图９　引物ＵＢＣ８４２对２２个不同产地虉草材料的扩增结果
Ｆｉｇ．９　ＵＢＣ８４２ｐｒｉｍｅｒ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　２２　Ｐｈａｌａｒｉｓ　ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ
表４　２２份不同产地虉草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ引物序列
及扩增结果统计
Ｔａｂｌｅ　４　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎｄ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　２２　Ｐｈａｌａｒｉｓ
ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ
引物编号
扩增总
条带数
多态性
条带数
多态百
分率／％
ＵＢＣ８０８　 １８　 １８　 １００．００
ＵＢＣ８０９　 １７　 １５　 ８８．２４
ＵＢＣ８１０　 １６　 １５　 ９３．７５
ＵＢＣ８１１　 １５　 １５　 １００．００
ＵＢＣ８１５　 １５　 １２　 ８０．００
ＵＢＣ８１８　 １８　 １５　 ８３．３３
ＵＢＣ８２０　 １７　 １６　 ９４．１２
ＵＢＣ８２６　 １４　 １４　 １００．００
ＵＢＣ８３４　 １４　 １２　 ８５．７１
ＵＢＣ８３５　 １３　 ９　 ６９．２３
ＵＢＣ８４１　 １７　 １７　 １００．００
ＵＢＣ８４２　 １８　 １５　 ８３．３３
Ｔｏｔａｌ　 １９２　 １７３ －
Ａｖｅｒａｇｅ　 １６　 １４．４　 ８９．８１
３　讨论与结论
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系主要受 Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ、模板
ＤＮＡ、引物和 Ｔａｑ 酶５个因素浓度的影响［１３－１７］。
ｄＮＴＰ是 ＰＣＲ 扩增的原料，对条带的扩增有很大影
响。试验表明，ｄＮＴＰ浓度过低而过早消耗完会导致
产物单链化，进而在电泳检测时出现杂带，产率下降，
扩增产物不完全；其浓度过高会导致ＰＣＲ产生错误掺
入，出现非特异性扩增。试验表明，在２０μＬ的反应体
系中，１．５μＬ　ｄＮＴＰ时扩增效果最好。
ＴａｑＤＮＡ聚合酶的种类以及用量直接影响扩增
反应成功与否。ＴａｑＤＮＡ聚合酶受酶活性、耐热性及
反应体积等因素的限制，使用量大容易产生非特异性
扩增产物的积累，杂带过多，还会造成经济上的浪费。
酶含量过低，易造成产物条带模糊不清晰难以读带；扩
增的带数随聚合酶浓度的增加可而增加。但酶量过
高，反而引起ＰＣＲ扩增效果的降低。结果表明，２０μＬ
的反应体系中，ＴａｑＤＮＡ 聚合酶为０．３μＬ时扩增效
果最好。
引物浓度影响ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增产物的质量和带型
的产生。引物浓度过高会引起错配和非特异性产物扩
增，增加引物二聚体的形成几率［１３］。引物浓度过低则
扩增出的条带不完全，不能进行有效扩增。结果表明，
在２０μＬ的反应体系中，引物为１．５μＬ时扩增效果
最好。
适宜的模板量是确保获得特异性扩增的要素之
一［１４］。模板浓度过低，扩增条带将很弱甚至没有；浓
度过高，会增加非专一扩增产物或造成弥散型产物，影
响扩增重复性。试验优化模板ＤＮＡ浓度为５０ｎｇ。
５第３６卷　第３期　　　　　　　　　　　草 原 与 草 坪２０１６年
在ＩＳＳＲ扩增中，退火温度和循环次数对扩增结
果好坏具有明显影响。退火温度过低，容易出现背景
重，弥散的条带且扩增产物少；退火温度过高，则引物
与模板结合差，容易造成非特异性扩增，产物的丰富度
降低［１６，２３］。试验所选１２条引物的退火温度在５２～
５６℃，不同的引物有其适宜的退火温度，只有在适宜温
度下才能达到良好的扩增效果。
对ＩＳＳＲ反应影响较大的４个因素进行了优化，建
立了虉草基因组ＤＮＡ的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增最佳反应体
系。在２０μＬ反应体系中，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶０．３μＬ，
１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）２μＬ，ｄＮＴＰ　１．５μＬ，引
物１．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ　１３．７μＬ，模板 ＤＮＡ５０ｎｇ。虉草
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增的程序如下：第１阶段，９４℃预变性
５ｍｉｎ；第２阶段，９４℃变性４５ｓ、退火６０ｓ（退火温度采
用所用引物的最适温度）、７２℃延伸１２０ｓ，共进行３５
个循环；第３阶段，７２℃延伸１０ｍｉｎ。然后在４℃保
存。１２条引物共扩增总条带数１９２条，其中，多态性
条带数１７３条，多态位点百分率８９．８１％。该反应体
系的建立可为虉草遗传多样性分析奠定技术基础。
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ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９４，２０：１７６
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多样性分析［Ｊ］．中国草地学报，２０１４，３６（３）：２８－３４．
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ｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｂｅ－
ｔｗｅｅｎ　ｎａｒｒｏｗ　ｌｅａｖｅｄ　ｂｌｕｅｇｒａｓｓ（Ｐｏａ　ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）ａｎｄ
ｒｏｕｇｈ　ｂｌｕｅｇｒａｓｓ（Ｐｏａ　ｔｒｉｖｉａｌｉｓ）ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｔｕｒｋ　Ｊ
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（下转１１页）
６ 　　　　　　ＧＲＡＳＳＬＡＮＤ　ＡＮＤ　ＴＵＲＦ（２０１６）　　　　　　　　　　　　Ｖｏｌ．３６Ｎｏ．３
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＩＴ　ｍａｒｋｅｒ　ｉｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
ａｎｄ　ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ　ｒｏｄｅｎｔｓ
ＣＨＵ　Ｂｉｎ，ＨＵＡ　Ｌｉ－ｍｉｎ，ＺＨＯＵ　Ｙａｎ－ｓｈａｎ，ＪＩ　Ｃｈｅｎｇ－ｐｅｎｇ，ＺＨＯＵ　Ｊｉａｎ－ｗｅｉ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇａｎｓｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｇｒａｓｓｌａｎｄ　Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ，
Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｇａｎｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ／Ｓｉｎｏ－Ｕ．Ｓ．Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ
Ｇｒａｚｉｎｇｌａｎｄ　Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ　Ｓｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ　ｒｏｄｅｎｔｓ　ｕｓｕａｌｙ　ｎｅｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｍａｒｋｅｄ　ｉｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｅｃｏｌｏｇｙ，ｂｕｔ　ｔｈｅ　ｔｒａｄｉ－
ｔｉｏｎａｌ　ｍａｒｋｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｈａｖｅ　ｓｏｍｅ　ｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓ（ｉｔ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ　ｔｈｅ　ａｎｉｍａｌ　ｂｅｈａｖｉｏｒ　ａｎｄ　ｉｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｗｉｔｈ　ａｎｉｍａｌ
ｗｅｌｆａｒｅ）．Ａ　ｐａｓｓｉｖｅ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｐｏｎｄｅｒ（ＰＩＴ）ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｍａｒｋ　３０ｐｌａｔｅａｕ　ｚｏｋｏｒｓ　ｉｎ　２０１４ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ
ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｄｅｎｓｉｔｙ，ａｎｄ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｗｅｉｇｈｔ，ｈｅｉｇｈｔ，ｔａｉｌ　ｌｅｎｇｔｈ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐｏｐｕｌａ－
ｔｉｏｎ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｗａｓ　４４ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ／ｈａ，ｔｈｅ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　ｐｌａｔｅａｕ　ｚｏｋｏｒ（２２２．０７ｇ）ｉｎ　２０１５ｗａｓ　ｇｒｅａｔｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　２０１４
（１９３．７４ｇ）ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ，ｔｈｅ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｉｇｈｔ　ｗａｓ　ｓａｍｅ　ｗｉｔｈ　ｗｅｉｇｈｔ．Ｔｈｅ　ｗｅｉｇｈｔ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ｍａｌｅｓ　ａｎｄ
ｆｅｍａｌｅｓ　ｈａｄ　ｎｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅ　ｐａｓｓｉｖｅ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｐｏｎｄｅｒ　ｉｓ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｐｏｐｕｌａ－
ｔｉｏｎ　ｅｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ　ｒｏｄｅｎｔｓ．
　　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＰＩＴ；ｐｌａｔｅａｕ　ｚｏｋｏｒｓ；ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｅｃｏｌｏｇｙ；
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
ｍａｒｋ
（上接６页）
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｐｒｉｍｅｒ
ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｐｈａｌａｒｉｓ　ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ
ＺＨＡＮＧ　Ｙｏｎｇ－ｌｉａｎｇ，ＬＩＵ　Ｐｅｎｇ，ＬＵＯ　Ｘｉｕ－ｍｅｉ，ＬＩＵ　Ｙａｎｇ
（Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｆｏｒ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｔｏｎｇｌｉａｏ　０２８０４２，Ｃｈｉｎａ）
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　２２　Ｐｈａｌａｒｉｓ　ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｆｏｒ　ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｉｍｐａｃｔ　ｏｆ　ｄＮＴＰｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ，ｐｒｉｍｅｒ　ａｎｄ　Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｉｎ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ｂｙ
ｕｓｉｎｇ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅ　ｒｅ－
ｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗａｓ　２μＬ　１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（ｍｇ
２＋ｐｌｕｓ），１．５μＬ　ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），
１．５μＬ　ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌ／μＬ），０．３μＬ　Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ），５０ｎｇ　ｔｅｍｐｌａｔｅ，ａｎｄ　ｄｄＨ２Ｏ　ｔｏ　２０μＬ　ａｔ　ｌａｓｔ．
Ｂａｓｅ　ｏｎ　ｔｈｉｓ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ，２４ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ，ｉｎ　ｗｈｉｃｈ，１２ｐｒｉｍｅｒｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｈｉｇｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎｄ　ｒｅｐｅａｔ－
ａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ　８０８，８０９，８１１，８１５，８１８，８２０，８２６ｗａｓ　５５℃，ａｎｄ　ｉｔ　ｗａｓ　５６℃
ｆｏｒ　ｐｒｉｍｅｒ　８３５，８４１ａｎｄ　８４２，５２℃ａｎｄ　５４℃ｆｏｒ　ｐｒｉｍｅｒ　８１０ａｎｄ　８３４ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　１９２ｂａｎｄｓ　ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉ－
ｆｉｅｄ　ｆｒｏｍ　１２ＩＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ，ｉｎ　ｗｈｉｃｈ，１７３ｗｅｒｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｌｏｃｉ，ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｂａｎｄ　ｗａｓ
９０．６２％．Ｔｈｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗｏｕｌｄ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｈａｌａｒｉｓ　ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ　ｗｉｔｈ
ＩＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ．
　　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｈａｌａｒｉｓ　ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ；ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ；ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ
１１第３６卷　第３期　　　　　　　　　　　草 原 与 草 坪２０１６年