全 文 ：第 39卷 第 1 期
2014年 2 月
林 业 调 查 规 划
Forest Inventory and Planning
Vol． 39 No． 1
Feb． 2014
doi:10. 3969 / j. issn. 1671-3168. 2014. 02. 004
漾濞泡核桃 ISSＲ － PCＲ反应体系的建立和优化
周林涛1，陆 斌2，周 军1，苏为耿3，原晓龙1，孟富宣1
(1.西南林业大学，云南 昆明 650224;2.云南省林业有害生物防治检疫局，云南 昆明 650051;
3.云南省林业技术推广总站，云南 昆明 650224)
摘要:以漾濞泡核桃优株为研究对象，研究其 ISSＲ － PCＲ 反应体系中的 5 个影响因子( 模板 DNA
浓度、Taq DNA 聚合酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2 +浓度) 对 PCＲ 扩增效果的影响，从而建立
起漾濞泡核桃的最佳 ISSＲ － PCＲ反应体系。结果表明:模板 DNA最佳浓度为 50 ng / ( 25μL) ，Taq
聚合酶浓度为 0. 75U / ( 25μL) ，引物浓度为 0. 7mmol /L，dNTPs 浓度为 0. 20mmol /L，Mg2 +浓度为
2. 0mmol /L，利用该最佳体系对试验中所选取的样本进行扩增反应。建立了适宜于漾濞泡核桃的
ISSＲ － PCＲ扩增的最佳体系，该体系的建立为利用 ISSＲ分子标记技术对漾濞泡核桃进行种质资源
研究奠定了基础。
关键词:漾濞泡核桃; ISSＲ － PCＲ反应体系;正交优化; 扩增效果
中图分类号:S792. 13;S718. 43 文献标识码:A 文章编号:1671－3168(2014)02－0014－04
Establishment and Optimization of ISSＲ-PCＲ Ｒeaction System
on Juglans sigillata
ZHOU Lin-tao1，LU Bin2，ZHOU Jun1，SU Wei-geng3，YUAN Xiao-long1，MENG Fu-xuan1
(1. Southwest Forestry University，Kunming 650224，China;
2. Yunnan Forest Pest Control and Quarantine Bureau，Kunming 650051，China
3. Yunnan Provincial Forestry Technology Extension Station，Kunming 650224，China)
Abstract:The effects of template DNA concentrations，Taq DNA polymerase concentrations，primers
concentrations，dNTPs and Mg2 + concentrations in ISSＲ-PCＲ reaction system on PCＲ amplification have
been studied，and optimum ISSＲ-PCＲ reaction system was set up. Ｒesults showed that the most suitable
concentrations of template DNA， Taq DNA polymerase， primers， dNTPs and Mg2 + were 50ng /
(25μL)，0. 75U / (25μL)，0. 7mmol /L，0. 20mmol /L and 2. 0mmol /L respectively. The optimal IS-
SＲ-PCＲ reaction system for Juglans sigillata established in this research provides a basis for using ISSＲ
molecular marker technology to study the germplasm resources of Juglans sigillata.
Key words:Juglans sigillata;ISSＲ-PCＲ reaction system;orthogonal optimization;amplification effect
收稿日期:2013－11－07.
基金项目:国家“十二五”科技支撑项目“核桃和长山核桃高效生产关键技术研究与示范”(2013BAD14B01)。
作者简介:周林涛(1988－)男，安徽安庆人，硕士研究生。研究方向为经济林培育。Email:zhoulintaozlt@ 163． com
ISSＲ技术即简单序列重复问区扩增多态性技
术，于 1994 年由加拿大蒙特利尔大学的 Zietkiewicz
等［1］提出。该技术在 SSＲ 序列的 5，或 3，末端加上
2 ～ 4 个随机选择的核苷酸作为引物，以引起特定
周林涛，等:漾濞泡核桃 ISSＲ － PCＲ反应体系的建立和优化
序列位点的退火，降低其他可能靶标退火的数目。
该标记只有与锚定的核苷酸匹配的那些位点才能被
靶定，因而避免了引物在基因组上的滑动，可提高
PCＲ扩增反应的专一性［2 － 3］。ISSＲ 结合了 ＲAPD
和 SSＲ 的优点，具有成本较低、稳定可靠、操作简
单、重复性强等优点。目前已被广泛应用于基因定
位［4］、构建遗传连锁图谱［5］、种质资源鉴定［6］、植物
分类、进化和遗传多样性分析等方面［7 － 8］。
核桃是一种主要的木本油料和干果树种，位于
世界四大干果之首。云南是中国的核桃生产大省，
其面积达 246. 67 万 hm2，也是核桃原产地之一，泡
核桃资源丰富。漾濞泡核桃具有丰产、优质、果大、
壳薄、仁白、味香营养丰富等特点，是云南省泡核桃
的主栽品种。本项研究以漾濞泡核桃植株新叶为材
料，探索影响其 ISSＲ － PCＲ 反应的因子，并建立和
优化漾濞泡核桃 ISSＲ － PCＲ反应体系，旨在为进一
步开展漾濞泡核桃种质资源的研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料
云南漾濞泡核桃植株幼叶，于 2012 年 4 月采集
于云南省玉溪市新平县林业局马鹿塘漾濞泡核桃采
穗圃，从嫁接的漾濞核桃枝条上采集 2 ～ 3 片嫩叶。
采集后立即置于装有硅胶的自封袋中，带回实验室
放入 － 30℃冰箱备用。
1. 1. 2 主要试剂与仪器
Taq聚合酶、Mg2 +、dNTP、Marker(DL2000)等购
置于上海生工生物工程有限公司，引物购于北京华
大基因公司。
Eppendorf Centrifuge 220Ｒ 型离心机，Bio Pho-
tometer 核酸检测仪(Eppendorf 公司)，Gene Amp
PCＲ System D37079 型 PCＲ 扩增仪(德国 Biometra
公司)，北京六一仪器厂的 DYY － 8C 型琼脂糖凝胶
电泳仪，Bio Imaging System(GeneGenins公司)。
1. 2 方法
1. 2. 1 漾濞核桃植株基因组 DNA的提取及检测
参照杨恩［9］的改良 CTAB法进行漾濞核桃优株
新叶基因组 DNA 的提取和纯化，用 TE 溶解置于
4℃冰箱 24 h;再使用核酸分析仪检测所提取 DNA
的纯度和浓度，提取的基因组 DNA的相对分子质量
以及降解程度采用 0. 8% 琼脂糖凝胶进行电泳
检测。
1. 2. 2 PCＲ体系的正交设计
采用 5 因素 4 水平［10］L16(4
5)正交试验设计，对
ISSＲ － PCＲ反应中涉及的 5 个因素，分别在 4 个水
平上进行试验(表 1)，正交设计共 16 种反应体系
(表 2)，每个组合 3 个重复，如表 2 中进行加样。各
反应扩增体系为 25μL，最后用 ddH2O补足 25μL。
表 1 正交设计中各因素水平
Tab. 1 Factors and levels in orthogonal design
水平
Taq酶
/(U·25
μL －1)
Mg2 +
/(mmol·
L －1)
引物
/(mmol·
L －1)
dNTPs
/(mmol·
L －1)
DNA模板
/(ng·25
μL －1)
1 0. 50 0. 50 0. 4 0. 20 20
2 0. 75 1. 00 0. 5 0. 25 50
3 1. 00 2. 00 0. 6 0. 30 60
4 1. 50 3. 00 0. 7 0. 35 80
表 2 16 个处理中各因素及其水平组合
Tab. 2 Factors and levels in 16 treatments
水平
Taq酶
/(U·25
μL －1)
Mg2 +
/(mmol·
L －1)
引物
/(mmol·
L －1)
dNTPs
/(mmol·
L －1)
DNA模板
/(ng·25
μL －1)
1 0. 50 0. 5 0. 4 0. 20 20
2 0. 50 1. 0 0. 5 0. 25 50
3 0. 50 2. 0 0. 6 0. 30 60
4 0. 50 3. 0 0. 7 0. 35 80
5 0. 75 0. 5 0. 5 0. 30 80
6 0. 75 1. 0 0. 4 0. 35 60
7 0. 75 2. 0 0. 7 0. 20 50
8 0. 75 3. 0 0. 6 0. 25 20
9 1. 00 0. 5 0. 6 0. 35 50
10 1. 00 1. 0 0. 7 0. 30 20
11 1. 00 2. 0 0. 4 0. 25 80
12 1. 00 3. 0 0. 5 0. 20 60
13 1. 50 0. 5 0. 7 0. 25 60
14 1. 50 1. 0 0. 6 0. 20 80
15 1. 50 2. 0 0. 5 0. 35 20
16 1. 50 3. 0 0. 4 0. 30 50
反应的基本程序为:95℃预变性 5 min，94℃变
性 30 s，50℃退火 60 s，72℃延伸 120 s，35 个循环，
72℃延伸 420 s，4℃保存。
ISSＲ引物的序列选用加拿大哥伦比亚大学
·51·第 1 期
林 业 调 查 规 划
(UBC)所提供的 96 个引物，引物合成由北京华大基
因公司合成。
因为不同的引物要求的最佳退火温度不同，所
以根据每个引物自身的 Tm值进行退火温度的梯度
实验，以获得引物的最佳退火温度。用不同的引物
和同一模板 DNA 进行梯度 PCＲ 扩增，筛选出适合
的引物。再使用 3 个不同模板 DNA 对同一个引物
进行筛选，3 次重复，选出凝胶电泳结果中条带清
晰、多态性丰富、重复性好、结果稳定的引物用于下
一步的实验。
1. 2. 3 电泳分析
反应结束后，ISSＲ － PCＲ 产物在 1. 5%的琼脂
糖凝胶上进行电泳检测，内含 0. 1%(体积分数)的
4S核酸染料，缓冲液用 1 × TAE，电压为 5V /cm。电
泳结束后，在 GENESNAP 凝胶成像仪上观察并
分析。
2 结果与分析
2. 1 DNA的质量检测
用 0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的完整性
和降解程度(图 1)，结果显示，DNA的条带清晰，无
明显降解，说明 DNA完整性比较好，质量较高，再用
DNA核酸分析仪检测 DNA 的纯度和浓度，A260 /
A280 的值均在 1. 80 ～ 1. 95，纯度较好，虽有少量
ＲNA存在，但对 ISSＲ扩增结果没有影响，满足 ISSＲ
－ PCＲ反应的要求。
图 1 DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果
Fig. 1 Electrophoresis result of DNA products in Agarose gel
2. 2 ISSＲ － PCＲ反应结果的检测
ISSＲ － PCＲ反应结果的检测结果见图 2 所示。
从图 2 中可以看出，由于试验因素浓度不同，各
处理的扩增结果存在明显的差异。ISSＲ － PCＲ 琼
脂糖凝胶电泳的检测结果:第七组处理为其最佳的
反应体系，即 Taq 酶浓度为 0. 75 U /(25μL)，Mg2 +
的浓度为 2. 0 mmol /L，引物浓度为 0. 7 mmol /L，
dNTPs浓度为 0. 20 mmol /L，模板浓度为 50 ng /
(25μL)。
( M为 DL2000Marker，1 ～ 16 为处理编号)
图 2 ISSＲ － PCＲ反应的 1. 5%琼脂糖电泳检测结果
Fig. 2 Electrophoresis result of ISSＲ － PCＲ products in
1. 5%Agarose gel
2. 3 实验中各因素对实验结果的影响
2. 3. 1 Taq酶浓度对反应体系的影响
Taq酶浓度的大小直接影响 PCＲ 产物，Taq 酶
浓度过大会产生非特异性扩增产物，增加成本;过低
又会出现扩增产物太少，条带太少，难以统计的问
题。结合表 2 与图 2 分析，Taq酶用量为 0. 5、0. 75、
1. 0、1. 5U，4 个递增浓度梯度，第一和第四处理，虽
有条带，但是仅有 2 条条带，说明在其他因素不变的
情况下，使用的 Taq酶的适宜浓度为 0. 75 ～1. 0U，再
结合剩下的 12个组合中，只有浓度为 0. 75U时有清晰
的条带，所以 Taq酶的合理浓度是 0. 75 U/(25 μL)。
2. 3. 2 Mg2 +浓度对反应体系的影响
Mg2 +是 Taq酶的激活剂，Mg2 +与 Taq 酶结合可
改变 Taq酶的活性，影响 ISSＲ － PCＲ 反应的扩增。
其浓度不仅影响酶的活性和合成的可靠性，而且还
影响引物的退火、产物的特异性、引物二聚体的生成
等。所以选择一个合适的 Mg2 +浓度尤为重要。从
图 2 中可以看出，在不同因素的交互作用下，当
Mg2 +浓度为 2. 0 mmol /L 时，体系最稳定。所以选
择 Mg2 +浓度为 2. 0 mmol /L。
2. 3. 3 引物浓度对反应体系的影响
引物与模板的结合，是 PCＲ反应的起点。引物
浓度的变化会影响引物与模板 DNA 配对的机率。
引物浓度过低时，引物与模板结合的机会减少，其结
果就是扩增产物不足，反应在电泳图谱上就会是扩
增条带不明显，影响分析结果;浓度过高时，引物与
模板结合会引起非特异性扩增，产生引物二聚体。
本研究中，对引物做了 4 个浓度梯度(表 1，分别是:
·61· 第 39 卷
周林涛，等:漾濞泡核桃 ISSＲ － PCＲ反应体系的建立和优化
0. 4、0. 5、0. 6 和 0. 7 mmol /L)，与其它因素一起组成
了 16个组合，由图 2 可知当引物浓度为 0. 7 mmol /L
时效果最佳，条带清晰。
2. 3. 4 dNTPs浓度对反应体系的影响
在 PCＲ 反应中，dNTPs 是 PCＲ 扩增的基本原
料，扩增中的一系列反应都是由 dNTPs 作为原料来
推动的。在本实验中，由图 2 可知，虽然 dNTPs的浓
度在 0. 20 ～ 0. 35 mmol /L 的范围内均有扩增，但只
有在浓度为 0. 20 mmol /L 时最稳定，每个处理均可
扩增出比较清晰的条带。
2. 3. 5 模板浓度对反应体系的影响
由图 2 中可以看出，DNA 模板量的大小对反应
结果影响不大，浓度在 20 ～ 80 ng /(25μL)的范围内
均可扩增出条带，但在同一浓度下的扩增结果有所
不同，由于第七号条带最为清晰，所以选择此条带模
板的浓度为 50 ng /(25μL)。
3 讨论
植物的 ISSＲ体系的建立和优化，目前在很多植
物上均有研究。但由于物种的不同，所建立的最佳
反应体系也会有相应的不同，就算是相同的物种，不
同品种的最佳体系也会有所不同，陈霞［11］以云南三
台核桃为研究材料，建立了云南三台核桃的最佳体
系(20μL):Taq酶 0. 25U、Mg2 +为 2. 0 mmol /L、引物
浓度为 0. 8 μmol /L，dNTPs 浓度为 0. 4 mmol /L，模
板浓度为 10 ng。陈少瑜［12］等以漾濞核桃为研究材
料，建立了漾濞核桃的最佳体系(20μL):Taq 酶
0. 6U、Mg2 +为 0. 225 mmol /L、引物浓度为 0. 5 mmol /
L，dNTPs浓度为 0. 2 mmol /L，模板浓度为 40 ng。所
以，ISSＲ应用于不同物种时需先进行反应体系的建
立和优化。
ISSＲ是建立在 PCＲ 的基础上，所以受到模板
DNA、Taq DNA 聚合酶、引物、Mg2 +和 dNTPs 5 个因
素的影响。使这 5 个因素均在最佳水平上才能获得
最优的效果。本试验使用的是正交设计，按各因素
进行排列，组成了 16 个具有代表性的试验组合，在
最短时间内找到最优的试验组合，最后得出组合 7
为最优组合，即:模板 DNA 最佳浓度为 50 ng /
(25μL)，Taq聚合酶浓度为 0. 75U /(25μL)，引物浓
度为 0. 7 mmol /L，dNTPs浓度为 0. 20 mmol /L，Mg2 +
浓度为 2. 0 mmol /L。从而确定了漾濞泡核桃优株
ISSＲ － PCＲ反应体系，为漾濞泡核桃优株进一步的
试验和相关研究奠定基础。
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