全 文 ：林业科学研究摇 圆园员员袁圆源渊圆冤院员怨源 员怨怨云燥则藻泽贼 砸藻泽藻葬则糟澡
摇 摇 文章编号院员园园员鄄员源怨愿渊圆园员员冤园圆鄄园员怨源鄄园远
红楠 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应体系的建立和优化
姜荣波员袁 姜景民员袁 刘摇 军员鄢袁 陈益泰员袁 栾启福员袁 岳华峰圆
渊员援中国林业科学研究院亚热带林业研究所袁浙江 富阳摇 猿员员源园园曰 圆援国家林业局泡桐研究开发中心袁河南 郑州摇 源缘园园园猿冤
摘要院为建立稳定的红楠 陨杂杂砸鄄孕悦砸最佳反应体系袁在探索红楠基因组 阅晕粤提取的基础上袁利用单因子试验和正交
试验设计对反应体系进行优化遥 首先采用单因子试验对 酝早圆 垣 尧引物尧模板 阅晕粤尧凿晕栽孕泽 的不同浓度水平进行优化袁
找出 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应各因素的最佳浓度曰同时为进一步增加结果的可靠性袁采用正交试验设计方法咱蕴怨 渊猿源 冤暂对
酝早圆 垣 尧引物尧模板 阅晕粤尧凿晕栽孕泽 源 个因素 猿 个浓度水平进行优化和筛选遥 综合两种试验方法结果袁最终获得了红楠
陨杂杂砸鄄孕悦砸最佳反应体系院反应体系为 圆园 滋蕴袁栽葬择 酶 园郾 园缘 哉窑滋蕴 原员袁酝早圆 垣 圆郾 园 皂皂燥造窑蕴 原员袁模板 阅晕粤 员 灶早窑蕴 原员袁
凿晕栽孕泽 园郾 猿 皂皂燥造窑蕴 原员袁引物渊愿猿缘冤 园郾 缘 滋皂燥造窑蕴 原员袁员 伊 孕悦砸缓冲液遥 建立重复性好尧稳定性优良的 陨杂杂砸 原 孕悦砸反应
体系袁为下一步红楠群体遗传结构和遗传变异研究提供了技术支持遥
关键词院红楠曰陨杂杂砸鄄孕悦砸反应体系曰单因子试验曰正交设计
中图分类号院杂苑员愿郾 源远 文献标识码院
收稿日期院 圆园员园鄄园缘鄄员怨
基金项目院 中国林业科学研究院所基金野亚热带珍贵阔叶用材树种收集尧评价和选育技术研究冶渊砸陨杂云远愿园愿冤曰浙江省科技计划面上项目
野樟楠类优质用材树种优良品种选育和无性繁殖技术研究冶渊圆园园怨悦猿圆园远愿冤
作者简介院 姜荣波渊员怨愿员要冤袁男袁山东青岛人袁硕士研究生袁主要从事林木遗传育种尧种质资源研究援
鄢通讯作者院刘摇 军渊员怨苑苑要冤袁男袁山东泰安人袁助理研究员袁博士袁主要从事珍贵用材树种研究援 耘鄄皂葬蚤造院造蚤怎躁怎灶赠葬造蚤灶岳 泽燥澡怎援 糟燥皂
耘泽贼葬遭造蚤泽澡皂藻灶贼 葬灶凿 韵责贼蚤皂蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 陨杂杂砸鄄孕悦砸 砸藻葬糟贼蚤燥灶 杂赠泽贼藻皂
燥枣 酝葬糟澡蚤造怎泽 贼澡怎灶遭藻则早蚤蚤
允陨粤晕郧 砸燥灶早鄄遭燥员袁 允陨粤晕郧 允蚤灶早鄄皂蚤灶员袁 蕴陨哉 允怎灶员袁 悦匀耘晕 再蚤鄄贼葬蚤员袁 蕴哉粤晕 匝蚤鄄枣怎员袁 再哉耘 匀怎葬鄄枣藻灶早圆
渊员援 砸藻泽藻葬则糟澡 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 杂怎遭贼则燥责蚤糟葬造 云燥则藻泽贼则赠袁 悦澡蚤灶藻泽藻 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 云燥则藻泽贼则赠袁 云怎赠葬灶早摇 猿员员源园园袁 在澡藻躁蚤葬灶早袁 悦澡蚤灶葬曰
圆援 孕葬怎造燥憎灶蚤葬 砸藻泽藻葬则糟澡 葬灶凿 阅藻增藻造燥责皂藻灶贼 悦藻灶贼藻则袁 杂贼葬贼藻 云燥则藻泽贼则赠 粤凿皂蚤灶蚤泽贼则葬贼蚤燥灶袁 在澡藻灶早扎澡燥怎摇 源缘园园园猿袁 匀藻爷灶葬灶袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 陨灶 燥则凿藻则 贼燥 藻泽贼葬遭造蚤泽澡 泽贼葬遭造藻 陨杂杂砸鄄孕悦砸 则藻葬糟贼蚤燥灶 泽赠泽贼藻皂 燥枣 酝葬糟澡蚤造怎泽 贼澡怎灶遭藻则早蚤蚤袁 泽蚤灶早造藻 枣葬糟贼燥则 葬灶凿 燥则贼澡燥早燥灶葬造
藻曾责藻则蚤皂藻灶贼 凿藻泽蚤早灶 憎藻则藻 怎泽藻凿 贼燥 燥责贼蚤皂蚤扎藻 贼澡藻 则藻葬糟贼蚤燥灶 泽赠泽贼藻皂 葬枣贼藻则 藻曾责造燥则蚤灶早 酝援 贼澡怎灶遭藻则早蚤蚤 阅晕粤 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶援 云燥则 枣蚤灶凿蚤灶早
燥责贼蚤皂葬造 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥枣 枣葬糟贼燥则泽 燥枣 陨杂杂砸鄄孕悦砸袁 贼澡藻 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 造藻增藻造泽 燥枣 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥枣 酝早圆 垣 袁 责则蚤皂藻则袁 贼藻皂责造葬贼藻 阅晕粤袁
凿晕栽孕泽 憎藻则藻 贼则葬蚤造藻凿 遭赠 泽蚤灶早造藻 枣葬糟贼燥则 藻曾责藻则蚤皂藻灶贼援 酝藻葬灶憎澡蚤造藻袁 蚤灶 燥则凿藻则 贼燥 蚤皂责则燥增藻 贼澡藻 则藻造蚤葬遭蚤造蚤贼赠 燥枣 贼澡藻 则藻泽怎造贼泽 燥枣 贼澡藻 泽蚤灶鄄
早造藻鄄枣葬糟贼燥则 贼藻泽贼袁 贼澡藻 葬怎贼澡燥则泽 葬造泽燥 葬凿燥责贼藻凿 燥则贼澡燥早燥灶葬造 凿藻泽蚤早灶 咱蕴怨渊猿源冤暂 遭赠 枣燥怎则 枣葬糟贼燥则泽袁 贼澡则藻藻 造藻增藻造泽 枣燥则 枣怎则贼澡藻则 燥责贼蚤皂蚤扎蚤灶早
葬灶凿 泽糟则藻藻灶蚤灶早 贼澡藻 遭藻泽贼 糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶泽 燥枣 酝早圆 垣 袁 责则蚤皂藻则袁 贼藻皂责造葬贼藻 阅晕粤袁 葬灶凿 凿晕栽孕泽援 栽澡藻 遭藻泽贼 陨杂杂砸鄄孕悦砸 则藻葬糟贼蚤燥灶 泽赠泽贼藻皂
燥枣 酝援 贼澡怎灶遭藻则早蚤蚤 憎葬泽 藻增藻灶贼怎葬造造赠 藻泽贼葬遭造蚤泽澡藻凿 遭赠 糟燥皂责葬则蚤灶早 贼澡藻 贼憎燥 皂藻贼澡燥凿爷泽 则藻泽怎造贼泽袁 憎澡蚤糟澡 蚤灶糟造怎凿藻凿 圆园 滋蕴 则藻葬糟贼蚤燥灶
泽赠泽贼藻皂袁 栽葬择 藻灶扎赠皂藻袁 园郾 园缘 哉窑滋蕴 原员袁酝早圆 垣 圆郾 园 皂皂燥造窑蕴 原员 贼藻皂责造葬贼藻 阅晕粤 员 灶早窑蕴 原员袁凿晕栽孕泽 园郾 猿 皂皂燥造窑蕴 原员袁责则蚤皂鄄
藻则泽渊愿猿缘冤 园郾 缘 滋皂燥造窑蕴 原员袁 葬灶凿 员 伊 孕悦砸 遭怎枣枣藻则援 栽澡藻 藻泽贼葬遭造蚤泽澡皂藻灶贼 燥枣 贼澡藻 遭藻贼贼藻则 则藻责藻葬贼葬遭蚤造蚤贼赠 葬灶凿 泽贼葬遭蚤造蚤贼赠 陨杂杂砸鄄孕悦砸
则藻葬糟贼蚤燥灶 泽赠泽贼藻皂 糟燥怎造凿 责则燥增蚤凿藻 贼藻糟澡灶蚤糟葬造 泽怎责责燥则贼 枣燥则 枣怎则贼澡藻则 则藻泽藻葬则糟澡 燥枣 早藻灶藻贼蚤糟 泽贼则怎糟贼怎则藻 葬灶凿 早藻灶藻贼蚤糟 增葬则蚤藻贼赠 燥枣 酝援 贼澡怎灶鄄
遭藻则早蚤蚤 早则燥怎责援
运藻赠 憎燥则凿泽院 酝葬糟澡蚤造怎泽 贼澡怎灶遭藻则早蚤蚤曰 陨杂杂砸鄄孕悦砸 则藻葬糟贼蚤燥灶 责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂曰 泽蚤灶早造藻 枣葬糟贼燥则 藻曾责藻则蚤皂藻灶贼泽曰 燥则贼澡燥早燥灶葬造 凿藻泽蚤早灶
红楠渊酝葬糟澡蚤造怎泽 贼澡怎灶遭藻则早蚤蚤 杂蚤藻遭援 藻贼 在怎糟糟援 冤为樟科 渊蕴葬怎则葬糟藻葬藻冤润楠属渊酝葬糟澡蚤造怎泽 晕藻藻泽冤的常绿阔叶乔
第 圆 期 姜荣波等院红楠 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应体系的建立和优化
木袁是国家三级保护优良珍稀树种袁有野红木王冶美
称咱员暂 袁综合利用价值高曰但人为干扰渊如种子采摘尧
林下幼苗移植冤尧火灾等致使其生境破坏袁生境片段
化严重袁自然种群日趋萎缩袁被列为渐危种咱圆暂 遥 国外
对红楠研究较多的是日本和韩国袁研究领域主要包
括活性物质提取利用尧群落结构咱猿暂 尧遗传变异规
律咱源暂等方面遥 目前国内对红楠的研究主要集中在育
苗试验咱缘暂 尧群落特性咱远暂 尧种群种子形态变异咱苑暂等方
面遥 为了更好地保护红楠种质资源袁应该加强红楠
遗传多样性方面的研究遥
分子标记技术是遗传多样性研究的一种重要手
段袁包括 杂杂砸尧 陨杂杂砸尧粤蕴云孕 及 砸粤孕阅 等方法遥 陨杂杂砸
渊陨灶贼藻则鄄泽蚤皂责造藻 杂藻择怎藻灶糟藻 砸藻责藻葬贼泽冤是 在蚤藻贼噪蚤藻憎蚤糟扎 等创
建的一种新型的微卫星类分子标记技术袁现已在遗
传图谱构建咱愿 原 怨暂 尧基因定位咱 员园暂 尧遗传多样性分
析咱 员员 暂 尧种质资源鉴定咱 员圆 暂等方面广泛应用遥 聚合酶
链反应渊孕燥造赠皂藻则葬泽藻 悦澡葬蚤灶 砸藻葬糟贼蚤燥灶 袁 孕悦砸冤是 圆园 世
纪 愿园 年代中期发展起来的体外核酸扩增技术袁具有
特异尧快速尧简便尧重复性好等优点曰但其扩增反应易
受到 栽葬择 阅晕粤 酶尧退火温度尧酝早圆 垣 尧引物模板 阅晕粤尧
凿晕栽孕泽等组分浓度的影响袁因此需要探索各组分的
最佳浓度水平遥 本研究采用单因素试验初步得出红
楠 陨杂杂砸鄄孕悦砸最佳反应体系袁然后采用正交设计试验
进行验证遥 正交试验设计具有均衡分散尧综合可比
及效应明确等特性袁可了解各因素之间的内在规律袁
能较快地找到最优的水平组合咱员猿暂 袁同时也可以减少
工作量遥 最后综合两种试验方法结果袁获得红楠 陨杂鄄
杂砸鄄孕悦砸最佳反应体系袁可为红楠遗传多样性及相关
研究提供技术支持遥
员摇 材料与方法
员援 员摇 试验材料
红楠幼叶于 圆园员园 年 员 月采自浙江富阳中国林
科院亚热带林业研究所珍贵树种育种基地渊圆园园怨 年
苑 月播种冤袁随用随采遥
员援 圆摇 主要试剂和仪器
用于 陨杂杂砸鄄孕悦砸 反应的 栽葬择 阅晕粤 聚合酶尧
凿晕栽孕泽尧酝早圆 垣购自北京鼎国生物技术有限公司袁引物
序列由加拿大哥伦比亚大学提供袁北京奥科生物技
术有限责任公司合成遥 阅晕粤 浓度和纯度检测使用
晕葬灶燥阅则燥责 圆园园园 紫外分光光度计渊栽澡藻则皂燥 云蚤泽澡藻则 公司
生产冤遥 孕悦砸 反应在 栽葬运葬孕葬 孕悦砸 栽澡藻则皂葬造 悦赠糟造藻则
阅蚤糟藻 孕悦砸仪渊栽孕远园园冤上进行遥
员援 猿摇 试验方法
员援 猿援 员摇 红楠基因组 阅晕粤提取摇 以 悦栽粤月 法咱员源 暂为基
础袁结合多种方法咱员缘 原 员远暂进行改进袁提取基因组 阅晕粤遥
主要从操作过程尧试剂配制方法和材料选择方面进行
改进袁设置多个比较试验袁优化最佳提取方法遥 然后
利用紫外分光光度计检测 阅晕粤 浓度及纯度袁耘月 染
色袁用 圆豫的琼脂糖凝胶电泳检测 阅晕粤质量遥
员援 猿援 圆摇 利用单因素试验优化反应体系摇 通过参考
相关文献及反复试验摸索袁以 愿猿缘 引物渊 粤郧粤 郧粤郧
粤郧粤 郧粤郧 粤郧粤 郧再悦冤为例开展单因素试验袁反应体
系为 圆园 滋蕴袁退火温度 缘缘 益遥 酝早圆 垣 尧引物尧模板 阅晕粤
及 凿晕栽孕泽各设置 猿 个浓度水平袁分别为 酝早圆 垣 院员郾 缘尧
圆郾 园尧圆郾 缘 皂皂燥造窑蕴 原员曰引物 孕渊愿猿缘冤院园郾 圆缘尧园郾 缘园尧园郾 苑缘
滋皂燥造窑蕴 原员曰凿晕栽孕泽院园郾 员尧园郾 圆尧园郾 猿 皂皂燥造窑蕴 原员曰模板
阅晕粤院员尧圆尧猿 灶早窑蕴 原员袁分别重复 猿 次遥 孕悦砸 反应程
序为院怨源 益预变性 缘 皂蚤灶袁怨源 益变性 猿园 泽袁缘缘 益退火
猿缘 泽袁苑圆 益延伸 猿缘 泽袁源园 个循环袁苑圆 益再延伸 苑 皂蚤灶袁
源 益保温遥
员援 猿援 猿摇 利用正交设计试验优化反应体系摇 采用 蕴怨
渊猿源冤正交表袁对 酝早圆 垣 尧引物尧模板 阅晕粤尧凿晕栽孕泽 源 个
因素 猿 个水平进行正交设计渊表 员冤袁重复 圆 次袁进行
孕悦砸扩增遥 为了增加试验的可比性袁其它条件渊引
物尧模板 阅晕粤尧孕悦砸 反应程序尧检测手段冤和单因素
试验均保持一致遥 最后综合两种试验方法结果袁获
得较可靠尧重复性好的 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应体系遥
表 员摇 陨杂杂砸鄄孕悦砸正交设计
处理号
影响因素
模板 阅晕粤 辕
渊灶早窑蕴 原员 冤
凿晕栽孕泽 辕
渊皂皂燥造窑蕴 原员 冤
引物渊愿猿缘冤 辕
渊滋皂燥造窑蕴 原员 冤
酝早圆 垣 辕
渊皂皂燥造窑蕴 原员 冤
员 员郾 园 园郾 员 园郾 圆缘 员郾 缘
圆 员郾 园 园郾 圆 园郾 缘园 圆郾 园
猿 员郾 园 园郾 猿 园郾 苑缘 圆郾 缘
源 员郾 缘 园郾 员 园郾 缘园 圆郾 缘
缘 员郾 缘 园郾 圆 园郾 苑缘 员郾 缘
远 员郾 缘 园郾 猿 园郾 圆缘 圆郾 园
苑 圆郾 园 园郾 员 园郾 苑缘 圆郾 园
愿 圆郾 园 园郾 圆 园郾 圆缘 圆郾 缘
怨 圆郾 园 园郾 猿 园郾 缘园 员郾 缘
摇 摇 注院正交设计实验中模板 阅晕粤浓度与单因子实试验设计的略有
差别渊为了更精确找出最佳模板 阅晕粤浓度冤遥
圆摇 结果与分析
圆援 员摇 红楠基因组 阅晕粤提取结果
圆援 员援 员摇 操作过程对红楠 阅晕粤提取结果的影响摇 试
验表明院酚颐氯仿颐异戊醇渊圆缘颐 圆源颐 员冤与氯仿颐异戊醇
缘怨员
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆源 卷
渊圆源颐 员冤配合使用比单独使用效果好遥 图 员 粤为混合
使用以上两种试剂提取红楠基因组总 阅晕粤 的凝胶
电泳结果袁月为单独使用酚颐 氯仿颐 异戊醇的提取结
果遥 可以看出袁混合使用的电泳条带明显比单独使
用的清晰尧明亮遥
酝院圆 园园园 遭责标准分子量 阅晕粤曰员 圆院阅晕粤样品号
图 员摇 不同的操作对 阅晕粤提取结果的影响
圆援 员援 圆摇 试剂配制方法对红楠 阅晕粤 提取结果的影响
摇 在高大伟咱员远暂樟科渊蕴葬怎则葬糟藻葬藻冤植物 阅晕粤 提取方法
的基础上袁经过多次试验发现袁茁鄄巯基乙醇和 孕灾孕
现用现配比配好后储存的效果好遥 图 圆 中袁粤是用
储存渊源 益冤圆园 凿的缓冲液提取 阅晕粤的情况袁月 是用
现配的缓冲液提取 阅晕粤的情况遥 可以看出袁与 月 相
比袁粤的条带模糊袁亮度低袁存在降解情况袁而 月 的条
带整齐袁明亮清晰袁达到 孕悦砸扩增要求遥
酝院圆 园园园 遭责标准分子量 阅晕粤曰员 缘院阅晕粤样品号
图 圆摇 不同试剂配制方法对 阅晕粤提取结果的影响
圆援 员援 猿摇 所选材料对红楠 阅晕粤提取质量的影响摇 如
图 猿 的 粤尧月尧悦分别用了 猿 种提取材料袁即采用硅胶
干燥叶片尧老叶片尧幼叶片进行 阅晕粤 提取遥 由图 猿
可以看出院用硅胶干燥叶片难提取出 阅晕粤袁叶片越
嫩袁提取 阅晕粤 的质量越高遥 所选材料对红楠 阅晕粤
提取质量影响较大遥
酝院圆 园园园 遭责标准分子量 阅晕粤曰员 员园院阅晕粤样品号
图 猿摇 不同材料对 阅晕粤提取结果的影响
圆援 圆摇 陨杂杂砸鄄孕悦砸最优退火温度的筛选
退火温度是影响 孕悦砸特异性的较重要因素遥 退
火温度取决于引物的长度尧碱基组成及其浓度尧靶基
序列的长度袁以及所选引物中 郧悦碱基对的含量袁通常
温度范围为 源缘 远缘 益咱员怨 暂 遥 本次试验以 愿猿缘渊粤郧粤
郧粤郧 粤郧粤 郧粤郧 粤郧粤 郧再悦冤为引物袁从 源愿 益到 缘远 益
酝院圆 园园园 遭责标准分子量 阅晕粤曰员 愿院温度分别为 源愿尧源怨尧缘园尧缘圆尧缘猿尧缘源尧缘缘尧缘远 益袁右侧 员 愿 号为重复 员 次
图 源摇 不同温度对 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应的影响
远怨员
第 圆 期 姜荣波等院红楠 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应体系的建立和优化
设置了 愿 个退火温度袁其它条件保持一致袁通过琼脂
糖凝胶电泳得到如图 源 所示条带袁可以看出院苑 号泳
道的电泳条带最多袁清晰度高袁拖带现象不严重袁因
此选择 缘缘 益作为引物 愿猿缘 的最佳退火温度遥
圆援 猿摇 单因子试验结果
圆援 猿援 员摇 酝早圆 垣浓度对 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应的影响摇 引物与
模板的双链杂交体的解链与退火温度受二价阳离子
的影响袁特别是其中的 酝早圆 垣浓度影响遥 如果 酝早圆 垣浓
度过高袁反应特异性降低袁易出现非特异扩增曰浓度过
低则会降低 栽葬择 阅晕粤 聚合酶的活性袁使反应产物减
少遥 从图 缘可以看出院当 酝早圆 垣浓度为 圆郾 园 皂皂燥造窑蕴 原员
时袁扩增的条带较清晰袁而且点样孔较干净袁因此选择
圆郾 园 皂皂燥造窑蕴 原员为 酝早圆 垣的最佳反应浓度遥
酝院圆 园园园 遭责标准分子量 阅晕粤曰员 原 员 猿袁圆 原 员 猿袁猿 原 员 猿院
酝早圆 垣浓度分别为 员援 缘尧圆援 园尧圆援 缘 皂皂燥造窑蕴 原员
图 缘摇 不同 酝早圆 垣浓度对 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应的影响
圆援 猿援 圆摇 引物浓度对 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应的影响摇 引物是
孕悦砸特异性反应的关键袁孕悦砸 产物的特异性取决于
引物与模板 阅晕粤 互补的程度遥 以最低引物量产生
所需要的结果为好袁引物浓度偏高会引起错配和非
特异性扩增袁且可增加引物之间形成二聚体的机会遥
从图 远 可以看出院当引物 愿猿缘 浓度为 园郾 缘园 滋皂燥造窑
蕴 原员时袁扩增出较清晰尧稳定的条带袁过高或过低均达
不到这种水平袁因此选择 园郾 缘园 滋皂燥造窑蕴 原员为引物的
最佳浓度遥
酝院圆 园园园 遭责标准分子量 阅晕粤 曰员 原 员 猿袁圆 原 员 猿袁猿 原 员 猿院
引物渊愿猿缘冤浓度分别为 园援 圆缘尧园援 缘园尧园援 苑缘滋皂燥造窑蕴 原员
图 远摇 不同浓度的引物对 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应的影响
圆援 猿援 猿 摇 凿晕栽孕泽 浓度对 陨杂杂砸鄄孕悦砸 反应的影响 摇
凿晕栽孕泽的质量与浓度和 孕悦砸 扩增效率有密切关系袁
凿晕栽孕泽粉呈颗粒状袁如保存不当易变性失去生物学
活性遥 浓度过低会降低 孕悦砸 产物的产量袁过高能与
酝早圆 垣结合袁使游离的 酝早圆 垣降低遥 从图 苑 可以看出袁
当 凿晕栽孕泽浓度为 园郾 猿 皂皂燥造窑蕴 原员时袁条带清晰袁而且
多态性好袁因此选择 园郾 猿 皂皂燥造窑蕴 原员为 凿晕栽孕泽 的最
佳反应浓度遥
酝院圆 园园园 遭责标准分子量 阅晕粤 曰员 原 员 猿袁圆 原 员 猿袁猿 原 员 猿院
凿晕栽孕泽浓度分别为 园援 员尧园援 圆尧园援 猿 皂皂燥造窑蕴 原员
图 苑摇 不同的 凿晕栽孕泽浓度对 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应的影响
圆援 猿援 源摇 模板 阅晕粤 浓度对 陨杂杂砸鄄孕悦砸 反应的影响摇
模板 阅晕粤 浓度是影响 陨杂杂砸鄄孕悦砸 的重要因子袁模板
质量浓度过低袁 扩增不稳定或无法扩增曰模板浓度
过高袁又会相应增加非特异性扩增的出现咱圆愿暂 遥 此次
试验对模板 阅晕粤设置了 猿 个浓度水平渊员尧圆尧猿 灶早窑
蕴 原员冤袁分别重复 猿 次遥 从图 愿 可以看出院浓度为 圆 灶早
窑蕴 原员时袁条带的清晰度和 猿 灶早窑蕴 原员时相差不大袁但
从节约资源尧减少非特异性条带出现几率的角度考
虑袁初步选择 圆 灶早窑蕴 原员作为模板 阅晕粤的最佳浓度遥
酝院圆 园园园 遭责标准分子量 阅晕粤曰员 原 员 猿袁圆 原 员 猿袁猿 原 员 猿院
模板 阅晕粤浓度分别为 员尧圆尧猿 灶早窑蕴 原员
图 愿摇 不同模板 阅晕粤浓度对 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应的影响
圆援 源摇 正交设计试验结果
根据 孕悦砸 产物条带的数量尧明暗及杂带的数量
和背景状况对正交设计试验结果进行分析打分袁最
苑怨员
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆源 卷
好的记为 怨 分袁最差的记为 员遥 根据图 怨 得出 怨 个组
合的分数依次是院缘袁愿袁怨袁苑袁源袁远袁猿袁员袁圆遥 由表 圆 得出
同一因素不同水平的极差渊砸冤袁而极差反映的是各
个因素对 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应体系的影响情况袁砸 越大说
明该因素对反应结果影响越显著遥 可以得出各个因
素对结果影响程度从大到小依次是院模板 阅晕粤 尧
酝早圆 垣 尧引物渊愿猿缘冤尧凿晕栽孕泽遥 每个因素水平下的 月员
月猿 平均值反映的是各个因素水平对反应结果的影
响情况袁平均值越大说明该因素水平的效果越好遥
因此通过正交设计试验得出 陨杂杂砸鄄孕悦砸 最佳反应体
系院模板 阅晕粤 员 灶早窑 蕴 原员袁 酝早圆 垣 圆郾 园 皂皂燥造窑 蕴 原员袁
凿晕栽孕泽 园郾 猿 皂皂燥造窑蕴 原员袁引物渊愿猿缘冤 园郾 缘园 滋皂燥造窑蕴 原员遥
该结果与单因子试验结果基本吻合袁综合两种试验
方法结果袁最终获得红楠 陨杂杂砸鄄孕悦砸 最佳反应体系院
反应体系为 圆园 滋蕴袁栽葬择酶 园郾 园缘 哉窑滋蕴 原员袁模板 阅晕粤
员 灶早窑蕴 原员袁酝早圆 垣 圆郾 园 皂皂燥造窑蕴 原员袁凿晕栽孕泽 园郾 猿 皂皂燥造窑
蕴 原员袁引物
渊愿猿缘冤 园郾 缘园 滋皂燥造窑蕴 原员遥 员 伊 孕悦砸 缓冲液袁缘缘 益遥
孕悦砸反应程序为院怨源 益预变性 缘 皂蚤灶袁怨源 益变性 猿园
泽袁缘缘 益退火 猿缘 泽袁 苑圆 益延伸 猿缘 泽袁 源园 个循环袁苑圆 益
再延伸 苑 皂蚤灶袁员园 益保温遥 最后用这一优化体系对
员苑 个红楠天然群体样品 阅晕粤 进行检测渊图 员园冤袁能
够得出多态性好尧清晰度高尧主次分明的电泳条带袁
达到了 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应的要求遥
表 圆摇 正交设计直观分析
结果 影响因素模板 阅晕粤 凿晕栽孕泽 引物渊愿猿缘冤 酝早圆 垣
粤员 圆圆 员缘 员圆 员员
粤圆 员苑 员猿 员苑 员苑
粤猿 远 员苑 员远 员苑
月员 圆圆 辕 猿 员缘 辕 猿 员圆 辕 猿 员员 辕 猿
月圆 员苑 辕 猿 员猿 辕 猿 员苑 辕 猿 员苑 辕 猿
月猿 远 辕 猿 员苑 辕 猿 员远 辕 猿 员苑 辕 猿
砸 员远 辕 猿 源 辕 猿 缘 辕 猿 远 辕 猿
摇 摇 注院粤员 粤猿 为每个因素同一水平的实验值之和曰月员 月猿 为每
一因素水平下的平均值曰砸为同一因素不同水平间的极差遥
酝院圆 园园园 遭责标准分子量 阅晕粤曰员 怨院处理号渊同表 圆冤袁重复 员 次
图 怨摇 正交设计试验结果
酝院圆 园园园 遭责标准分子量 阅晕粤曰员 员苑院员苑 个不同红楠天然群体混合 阅晕粤样本的电泳条带
图 员园摇 员苑 个红楠天然群体的 陨杂杂砸鄄孕悦砸最佳反应体系扩增结果
愿怨员
第 圆 期 姜荣波等院红楠 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应体系的建立和优化
猿摇 小结与讨论
由于红楠细胞内含有大量的多糖尧多酚尧蹂质以
及桂皮醛尧桂皮酸等次生代谢物袁不仅能干扰 阅晕粤
提取过程袁而且使提取的 阅晕粤 溶液粘稠袁样品呈棕
褐色袁不能用作分子生物分析和研究的 孕悦砸 模
板咱员苑暂 袁分子生物学家称其为野顽拗植物冶曰然而采用
陨杂杂砸 分子标记技术对红楠进行遗传多样性研究必
须以较高质量的 阅晕粤 为材料基础袁因此袁红楠 阅晕粤
的提取显得尤为重要遥 本研究以 悦栽粤月 法为基础袁
结合多种提取方法袁通过大量实验发现袁所提取的
阅晕粤质量主要与材料选择尧试剂配制方法和操作过
程有关遥 针对这 猿 个方面因素设置了多个对比试
验袁得出用新鲜嫩叶尧现配试剂尧酚颐 氯仿颐 异戊醇与
氯仿颐异戊醇配合使用的提取效果最佳袁能够达到进
一步研究的要求袁为红楠 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应体系的建立
打下了基础遥
正交试验设计是一种高效尧经济的试验设计方
法袁具有布点均衡尧试验次数少尧结果直观等优点遥
本试验在获得稳定的红楠 阅晕粤 提取方法的基础上袁
首先采用单因素试验袁对影响 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应体系的
几个主要因素进行优化遥 然后再采用正交设计试验
进一步优化红楠的 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应体系袁最后综合两
种试验方法结果袁获得了红楠 陨杂杂砸鄄孕悦砸最佳反应体
系遥 因为正交试验设计法存在精确度较低等弊端袁
所以结合单因素试验能够弥补其不足遥 采用该反应
体系对 员苑 个红楠天然群体的 阅晕粤 进行扩增袁能够
得到清晰尧亮暗分明的条带袁达到了进行下一步分子
生物学分析的要求袁有利于今后开展红楠遗传多样
性分析尧遗传图谱构建及种质资源鉴定等研究遥
参考文献院
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咱员缘暂 刘摇 军援 毛红椿天然居群遗传结构的研究咱阅暂援 北京院 中国林
业科学研究院袁圆园园苑
咱员远暂 高大伟援 樟科植物 阅晕粤 月葬则糟燥凿藻及香樟系统地理学的初步研究
咱阅暂援 上海院 华东师范大学袁圆园园愿
咱员苑暂 徐摇 虹袁郑摇 敏袁章摇 军袁等援 猿 种樟科植物的细胞总 阅晕粤提取
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咱员愿暂 叶摇 倩援 夏腊梅尧红楠的种质特异性分子标记的研究咱阅暂援 杭
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反应条件优化与筛选 咱 允暂 援 热带亚热带植物学报袁圆园园猿袁员员
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咱圆源暂 杨摇 华袁 宋绪忠袁 尹光天袁等援 黄藤 陨杂杂砸反应体系的条件优化
咱允暂 援 福建林学院学报袁圆园园远袁 圆远 渊圆冤 院 员缘圆 原 员缘缘
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