全 文 ：珍稀濒危植物大果木莲 ISSR-PCR反应体系的建立
毛云玲 1 ,陈少瑜1＊ , 韩 燕 2 , 吴涛 1 , 司马永康 1 , 郝佳波 1 , 付玉嫔 1　(1.云南省林业科学院 , 国家林业局云南珍稀濒
特森林植物保护和繁育重点实验室 ,云南省森林植物培育与开发利用重点实验室 ,云南昆明 650204;2.西南林学院资源学院 ,云南昆明 650224)
摘要　[目的 ] 建立高效稳定的大果木莲ISSR-PCR反应体系。 [方法] 以珍稀濒危植物大果木莲新鲜嫩叶为材料 ,在高盐沉淀法提取
高质量基因组DNA的基础上 ,通过ISSR-PCR反应体系中 5个主要因素的单因子梯度试验 ,优化并最终建立了大果木莲稳定而高效的
ISSR-PCR反应体系和反应程序。 [结果] 试验建立的大果木莲的ISSR-PCR反应体系为:20.0μl反应体系中含 10×bufer2.0μl、Mg2+
2.0mmol/L、Taq酶 0.5U、DNA模板 40ng、引物 0.8μmol/L、dNTPs0.2mmol/L和ddH2O13.3μl,其反应程序为:94℃预变性 5min;94
℃变性 1min, 50～ 60℃退火 45s, 72℃延伸 2min, 40个循环;72℃完全延伸 7min。 [结论 ] 该研究为进一步揭示大果木莲群体的遗传
多样性和遗传结构状况以及制定科学的保护措施提供了理论依据。
关键词　珍稀濒危植物;大果木莲;基因组DNA;ISSR-PCR反应体系
中图分类号　S188　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)31-15163-04
EstablishmentofISSR-PCRReactionSystemfortheRareandEndangeredPlantManglietiagrandisHuetCheng
MAOYun-lingetal　(YunnanAcademyofForestry, YunnanKeyLaboratoryfortheProtectionandPropagationofRareandEndangeredForest
PlantsofStateForestryBureau, KeyLaboratoryfortheCultivationandExploitationofForestPlantsinYunnanProvince, Kunming, Yunnan
650204)
Abstract　 [ Objective] ThestudyaimedtoestablishtheefectiveandstableISSR-PCRreactionsystemforManglietiagrandisHuetCheng.
[ Method] WiththeleavesofrareandendangeredplantM.grandisastestedmaterial, basedonhighqualityDNAextractedbyhighsaltprecipita-
tionmethod, thesinglefactorgradeexperimentwith5factorsinISSR-PCRreactionsystemwastakentooptimizeandfinalyestablishtheefective
andstableISSR-PCRreactionsystemthroughsingle-factorgradienttest.[Result] TheefectiveandstableISSR-PCRreactionsystemforM.gran-
diswasestablished, whichcontained10×bufer2.0μl, Mg2+ 2.0mmol/L, Taqenzyme0.5U, DNAtemplate40ng, primer0.8μmol/L, dNTPs
0.2mmol/L, ddH2O13.3μlintotal20.0μlsystem.ThePCRamplificationprogramwasthattheinitialdenaturationwasfor5minat94℃, fol-lowedby40cyclesofdenaturingat94℃for1min, annealingat50-60℃for45s, extensionat72℃for2min, andafinalextensionwasat
72℃for7min.[Conclusion] Thestudyprovidedthetheoreticalbasisforfurtheropeningoutthegeneticdiversityandstructureandmakingout
thescientificprotectionmeasures.
Keywords　 Rareandendangeredplants;ManglietiagrandisHuetCheng;GenomicDNA;ISSR-PCRreactionsystem
基金项目　云南省自然科学基金项目(2006C0066M)。
作者简介　毛云玲(1965-),女 ,河南南乐人 ,工程师 ,从事林木种质资
源与植物生理和生化研究。 ＊通讯作者 ,副研究员 , E-mail:
sherry9872@yahoo.com.cn。
收稿日期　 2009-06-29
　　大果木莲 (ManglietiagrandisHuetCheng)为木兰科
(Magnoliaceae)木莲属(Manglietia)常绿乔木 ,是我国 2级重
点保护野生植物和国家 3级濒危保护物种 。大果木莲分布
范围极窄 ,据报道 ,仅零星分布于云南东南部麻栗坡 、马关 、
西畴及广西西南部靖西 、那坡等县的局部地区 [ 1] ,生长于海
拔 800 ～ 1 500 m的山地峡谷 [ 2] 。作为木莲属中较为原始的
种类 ,又是我国特有的珍稀树种 ,大果木莲对植物区系及木
莲属分类研究有一定的科研价值。其木材细致 ,具有耐腐 、
耐水湿 、虫不蛀等特点 ,是优良的用材树种;其叶大亮绿 ,花
大色艳 ,芳香怡人 ,树形优美 ,又是非常珍贵的庭园观赏树
种 [ 3-4] 。由于大果木莲现存种群数量少 ,种群规模小 ,天然
更新困难 ,且生境受到严重破坏 ,按 IUCN地方濒危等级标准
评价属于 “极危种(CR)”[ 1] ,因此 ,很有必要探索其濒危的原
因并采取相应的保护措施 。
ISSR(inter-simplesequencerepeat)又称简单重复序列
间扩增 ,是 Zietkiewicz等于 1994年创建的一种新的分子标记
技术 [ 5] 。它结合了 RAPD和 SSR的优点 ,具有操作简便快
速 、开发成本低 、试验重复性好 、多态性丰富 、稳定性较高等
优点 [ 6] ,已被广泛应用于植物种质资源遗传多样性研究 、品
种鉴别及遗传图谱构建等 [ 7-9] 。笔者旨在建立高效稳定的
大果木莲 ISSR-PCR反应体系 ,为进一步揭示其群体的遗传
多样性和遗传结构状况以及制定科学的保护措施提供理论
依据。
1　材料与方法
1.1　供试材料　在大果木莲自然分布区的云南省文山州麻
栗坡县分单株采集其天然种群植株的嫩叶 ,标记后放入装有
硅胶的封口塑料袋 ,带回实验室置于 -30 ℃冰箱中保存
备用。
1.2　试剂及仪器　2×CTAB提取缓冲液(pH值 8.0,内含
1%PVP和 1%β-巯基乙醇);TE缓冲液(pH值 8.0);DNA聚
合酶 、dNTP和 Marker等购自上海申能博彩生物科技有限公
司;DL2 000 bpDNAMarker购自大连宝生物有限公司;ISSR
引物由上海生工合成。
电子天平;BECKMAN台式超速冷冻离心机;奥立龙 pH
计;SZ-97自动三重纯水蒸馏器;SANYO超低温冰箱(-40、
-80 ℃);PE9700 PCR扩增仪;Bio-RadpowerPac电泳系统及
GeneGeniusBio凝胶成像系统。
1.3　试验方法
1.3.1　基因组 DNA的提取。采用高盐沉淀法 [ 10-11] :①称取
1.0g幼嫩叶片 ,放入研钵 ,同时倒入 5 ml预热的 2×CTAB
提取液 ,迅速研磨后 ,转入 10ml的离心管中 ,于 65℃水浴保
温 30min。②12 000r/min离心 10 min,取上清 ,加入等体积
的氯仿∶异戊醇(24∶1), 12 000r/min离心 10 min。 ③取上清 ,
加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1), 12 000r/min离心 10min。
④取上清 ,加入 2.5倍上清体积的 -20 ℃无水乙醇 , -20 ℃
静置 1h。⑤挑出 DNA沉淀 ,溶于 100 μlTE中 。⑥加入 4
mmol/LNaCl,使溶液中 NaCl的终浓度为 2.0 mmol/L。 ⑦
-20 ℃无水乙醇沉淀 DNA, 70%酒精溶液漂洗 2次 ,风干 ,
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(31):15163-15166 责任编辑　金琼琼　责任校对　卢瑶
100 μlTE充分溶解 , -20 ℃冰箱中保存备用。
1.3.2　DNA质量与浓度的检测。采用琼脂糖凝胶电泳对
DNA的质量与浓度进行检测。取一定量(1或 2 μl)提取的
DNA样品及不同浓度的 λ-DNA,加入溴酚兰(LoadingBuf-
er),于 0.8%琼脂糖凝胶中电泳 ,电泳缓冲液为 0.5×TBE,
80～ 100V恒压电泳 30 ～ 40 min。通过紫外凝胶成像系统观
察提取的 DNA质量 ,同 λ-DNA进行对比 ,粗略估计提取的
DNA浓度。
1.3.3　ISSR-PCR反应体系的优化及建立。参照同属其他
种相关试验结果 [ 12] , ISSR-PCR原初反应体系为 20.00 μl:10
×Taq酶配套 bufer2.00μl;25.0 mmol/LMgCl2 1.20μl,终
浓度 1.5 mmol/L;5 U/μlTaq酶 0.16 μl,终用量 0.8 U;60
ng/μlDNA模板 1.00 μl,终用量 60 ng;10.0 μmol/L引物
1.60 μl,终浓度 0.8 μmol/L;10.00 mmol/LdNTPs0.50 μl,
终浓度 0.25mmol/L;无菌 ddH2O13.54μl。反应程序:94℃
预变性 5 min;94℃变性 1min, 50～ 60 ℃退火 45s, 72 ℃延
伸 2min, 40个循环;72℃完全延伸 7 min。
退火温度由引物碱基序列计算出的 Tm值初步确定 ,或
以 Tm值为基础的梯度试验 ,大多在 50 ～ 60 ℃进行 。
以上述反应体系和扩增程序为基础 ,进行 Mg2+浓度 、
dNTPs浓度 、Taq酶用量 、引物浓度和模板 DNA用量 5个因
素的单因素梯度试验 ,以优化和确定大果木莲 ISSR-PCR最
终的反应体系 。各因素及梯度见表 1。
表 1　大果木莲 ISSR-PCR反应体系各因素及梯度试验
Table1　ExperimentonthefactorsandgradientsofISSR-PCRreac-
tionsystemofManglietiagrandis
梯度Gradients
因素 Factors
Mg2+浓度mmol/LMg2+content
引物浓度μmol/LPrimerconcentration
Taq酶量∥UTaqenzymeamount
dNTP浓度mmol/LdNTPconcentration
模板DNA用量∥ngTemplateDNAamount
1 0.50 0.20 0 0.05 20
2 1.00 0.40 0.25 0.10 40
3 1.50 0.60 0.50 0.15 60
4 2.00 0.80 0.75 0.20 80
5 2.50 1.00 1.00 0.25 100
6 3.00 1.20 1.25 0.30
　　扩增产物于 1.0%琼脂糖凝胶电泳 ,以 DL2 000bpDNA
Marker为标记 ,结果用凝胶成像系统进行拍照和分析。
2　结果与分析
2.1　DNA提取效果的电泳检测　0.8%琼脂糖凝胶电泳检
测高盐沉淀法提取的大果木莲 DNA,结果见图 1。由图 1可
见 ,该方法提取大果木莲基因组 DNA结果较为理想。
图 1　大果木莲总 DNA电泳检测
Fig.1　ElectrophoresisfortotalDNAofManglietiagrandis
　　用不同浓度的 λ-DNA为对照 ,与提取样品同时进行凝
胶电泳 ,粗略估计样品 DNA浓度 ,结果如图 2所示 。对于浓
度为 20或 30ng/μl的 DNA(图中 2、4、7、8号样品),需进一
步浓缩 ,方法为:预冷的无水乙醇沉淀 15 min,风干 ,用少量
的 TE溶液(50μl)充分溶解 ,重新测定其浓度;对浓度高于
50 ng/μl的 DNA(图中 3、5、6号),或 100ng/μl及以上的(图
中 1号),则取出一定量的 DNA,加入适量 TE进行稀释 ,直
至其浓度检测结果达到 40ng/μl。
图 2　大果木莲 DNA浓度电泳检测
Fig.2　ElectrophoresisforDNAconcentrationofManglietia
grandis
2.2　反应体系的优化
2.2.1　Mg2+浓度对扩增结果的影响。 Mg2+浓度是影响
ISSR-PCR反应结果的重要因素之一。 TaqDNA聚合酶是对
Mg2+依赖性酶 ,对 Mg2+浓度非常敏感 ,不仅如此 , Mg2+还能
与反应中的 dNTP、模板 DNA及引物结合 ,影响引物与模板
的结合效率 、模板与产物的解链温度以及产物的特异性和引
物二聚体的形成 [ 13-14] 。该试验 6个不同浓度的 Mg2+扩增结
果(图 3)表明:不同浓度 Mg2+的扩增结果差异很大:0.5
mmol/L无扩增产物;1.0 ～ 3.0 mmol/L范围内均有扩增产
物 ,但 1.0mmol/L时 ,谱带缺失现象严重 , 1.5 mmol/L偶有
谱带缺失。因此 ,选用 2.0 mmol/L的 Mg2+浓度进行大果木
莲的 ISSR-PCR扩增。
图 3　不同浓度 Mg2+对 ISSR扩增结果的影响
Fig.3　TheefectofMg2+ atdifferentconcentrationonISSR
amplification
2.2.2　引物浓度对扩增结果的影响。引物浓度对 ISSR反
应有一定的影响 ,浓度过低可能无扩增带 ,而过高则产生非
特异性扩增。由图 4可以看出 ,引物浓度低于 0.8 μmol/L
时 ,扩增条带数量少;浓度为 1.0 ～ 1.2 μmol/L时 ,结果不稳
定 ,产生非特异性条带。因此 ,引物浓度确定为 0.8 μmol/L。
2.2.3　Taq酶用量对扩增结果的影响。在 ISSR-PCR反应体
系中 , Taq酶的种类以及用量直接影响扩增反应的成功与否。
使用高浓度的 Taq酶不仅提高了成本 ,而且容易产生非特异
性扩增产物;而当 Taq酶浓度过低时 ,则会导致产物的合成
效率下降。由图 5可以看出 , Taq酶用量为 0.50 ～ 1.25 U
时 , 4个泳道均有扩增产物;用量为 0.25 U时 ,谱带不清晰;
用量为 1.25 U时 ,扩增产物明显变少;用量为 0.50 ～ 1.00 U
时 ,扩增效果大致相同 。考虑到成本 , Taq酶用量以 0.50 U
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为宜。
图 4　不同浓度引物对 ISSR-PCR扩增结果的影响
Fig.4　TheefectofprimeratdiferentconcentrationonISSR-
PCRamplificationresults
图 5　不同用量 Taq酶对 ISSR-PCR扩增结果的影响
Fig.5　TheeffectofdifferentTaqpolymeraseamountonISSR-
PCRamplificationresults
2.2.4　dNTP浓度对扩增结果的影响。dNTP是 PCR扩增
的原料 ,其浓度过高会导致 PCR错配 ,从而出现非特异性扩
增并竞争 Mg2+,影响 Taq酶的作用效率;浓度过低又会影响
合成效率 ,甚至会因过早的消耗而使产物单链化 ,影响扩增
效果 [ 15] 。由图 6可以看出 , dNTP浓度小于 0.15 mmol/L或
浓度为 0.30 mmol/L时 ,皆出现条带缺失;浓度为 0.20和
0.25 mmol/L时 ,谱带清晰稳定 ,扩增效果均较理想。因此 ,
可将 dNTP浓度定为 0.20或 0.25mmol/L。
2.2.5　模板 DNA用量对 ISSR扩增结果的影响。适宜的模
板量是保证特异性扩增的前提 ,最佳的模板浓度取决于研究
物种和模板纯度。模板量过多会降低特异性扩增效率 ,增加
非特异性产物 [ 2] 。不同用量 DNA模板的扩增结果(图 7)表
明 ,用量在 20 ～ 80 ng范围内均有条带扩增 ,但用量高于
60ng时扩增谱带出现缺失现象。因此 , DNA模板的用量以
40 ng较为适宜 。
图 6　dNTP浓度对 ISSR扩增结果的影响
Fig.6　EffectsofdNTPconcentrationonISSRamplificationre-
sults
图 7　不同用量模板 DNA的ISSR-PCR扩增结果
Fig.7　TheresultsofISSR-PCRamplificationwithdiferenta-
mountoftemplateDNA
2.3　大果木莲 ISSR-PCR反应体系的建立及稳定性检测
2.3.1　大果木莲 ISSR-PCR反应体系。通过以上反应因素
及水平梯度试验 ,最终确定大果木莲 20.0 μlISSR-PCR反应
体系中:10×Taq酶配套 bufer2.0μl;25.0mmol/LMgCl21.6
μl,终浓度 2.0mmol/L;5 U/μlTaq酶 0.1 μl,终用量 0.5U;
40 ng/μlDNA模板 1.0μl,终用量 40 ng;10.0 μmol/L引物
1.6μl,终浓度 0.8 μmol/L;10.0 mmol/LdNTPs0.4μl,终浓
度 0.2 mmol/L;无菌 ddH2O13.3μl。反应程序同 “1.3.3”。
2.3.2　反应体系稳定性的 ISSR-PCR检测 。随机选择若干
大果木莲 DNA样本 ,分别用引物 864和 825对优化的 ISSR-
PCR体系进行检测 ,结果如图 8、9所示。由图 8、9可见 , 2种
引物均能对大果木莲 DNA扩增出清晰 、重复性好的谱带 ,表
明这一体系是稳定 、可靠的。
图 8　优化的ISSR体系对 20个样品的扩增结果(引物 864)
Fig.8　TheISSRamplificationresultsof20samplesbytheoptimumISSRsystem(primer864)
15165　37卷 31期　　　　　　　　　　　　　　　　　　毛云玲等　珍稀濒危植物大果木莲ISSR-PCR反应体系的建立
图 9　优化的ISSR体系对 22个样品的扩增结果(引物 825)
Fig.9　TheISSRamplificationresultsof22samplesbytheoptimumreactionsystem(primer825)
3　小结与讨论
对于要求检测大量样本的遗传多样性和种群遗传结构
研究来说 ,检测手段的稳定性至关重要。由于 ISSR引物序
列较长(10 ～ 24 bp),反应退火温度较高(50 ～ 60 ℃),引
物 -模板复合物比较稳定 ,减少了由于靶定的位点太多而产
生的弥散 ,因而使扩增结果具有较高的稳定性和可重复
性 [ 16] 。尽管 ISSR显性遗传标记的特点妨碍了该技术在种群
遗传学中的广泛应用 ,但对基于基因型鉴定的种群遗传学和
分子生态学研究 ,标记体系的显性遗传方式并无太大的影
响 。笔者在参考同属其他种相关试验的基础上 ,针对大果木
莲进行了 ISSR-PCR反应体系的优化 ,最终建立了稳定 、高效
的反应体系和反应程序 ,为进一步开展大果木莲的相关研
究 、开发和利用奠定了基础。
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