全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2016 年
第 55 卷第 8 期
2016年 4 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 55 No.7
Apr.，2016
2
1
1
Jan
16期
8
Vol． 5 No.16
ug
收稿日期：2015－08－28
基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金项目（LGZD201505）
作者简介：陈云霞（1982－），女，江苏南京人，博士，主要从事分子植物学研究，（电话）18652063506（电子信箱）105144878＠qq．com。
宝华玉兰 （Magnolia zenii Cheng）是木兰科
（Magnoliaceae）珍贵园林观赏植物，在每年的 3～4 月
开花，其芳香艳丽、姿态优美，有极高的观赏价值。
但其仅产自江苏省句容县宝华山，数量较少，已被
列为国家二级重点保护植物。 由于宝华玉兰产地单
一，对于环境的要求特别严格，所以人工栽培并成
功的事例很少， 同时由于林下灌木层不断被破坏，
没有更新苗木，现已处于濒危状态［1］。面对如此严峻
的形势， 开展对宝华玉兰的遗传多样性分析研究、
制定具有针对性的种质资源保护策略刻不容缓。 简
单序列重复区间扩增多态性（Inter－simple sequence
repeats，ISSR）是由加拿大蒙特利尔大学 Zietkiewicz
等于 1994 年创建的一种分子标记技术 ［2］，ISSR 分
子标记技术兼具 SSR、RAPD、RFLP、AFLP 等分子标
记的优点， 与其他技术相比，ISSR 不需要预先获知
序列信息而使成本降低，且多态性更丰富；并且重
复性高、稳定性好，同时具备简便、易操作等特点；
相比之下，ISSR 更快捷、成本较低、DNA 用量小、安
全性较高 ［3］。 由于上述优点，ISSR 在植物种质资源
研究尤其是种质资源的收集和鉴定、遗传多样性分
珍稀濒危植物宝华玉兰 ISSR－PCR
反应体系建立及优化
陈云霞，葛乐乐，王雪薇
（南京森林警察学院，南京 210023）
摘要：为建立和优化宝华玉兰（Magnolia zenii Cheng）ISSR－PCR 反应体系，采用正交试验和单因子试验
方法对影响 PCR 扩增体系中的 Mg2＋、dNTPs、DNA 模板、 引物和 Taq 聚合酶一定浓度的用量 5 个因子
进行分析比较。 结果显示，宝华玉兰 ISSR－PCR 25 μL 反应体系中的 5 个因子最佳水平分别为 DNA 模
板（20 ng ／μL） 3．5 μL，引物（10 μmol ／ L） 1．25 μL，Taq 聚合酶（5 U ／μL） 0．2 μL，Mg2＋（25 mmol ／ L） 2．0 μL，
dNTPs（2．5 mmol ／ L） 0．8 μL。 宝华玉兰 ISSR－PCR 反应的最优体系建立，为进一步利用 ISSR 对其进行分
子标记辅助育种、分子身份证构建和遗传多样性分析等后续研究奠定了基础。
关键词：宝华玉兰（Magnolia zenii Cheng）；ISSR－PCR 反应体系；种质资源保护
中图分类号：Q949．747．1＋2 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2016）16－4206-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.034
Establishment and Optimization of ISSR-PCR Reaction System for Rare and
Endangered Plant Magnolia zenii
CHEN Yun－xia， GE Le－le， WANG Xue－wei
（Nanjing Forest Police College, Nanjing 210023, China）
Abstract： To establish and optimize the ISSR－PCR reaction system for Magnolia zenii Cheng， orthogonal experiment and sin-
gle factor design were conducted to analyze the effect of 5 factors inluding DNA template， dose of Taq DNA polymerase，
primers， Mg2＋ and dNTPs in amplification system． The results showed that the optimal ISSR－PCR reaction system （25 μL）
mixture contains 3．5 μL DNA template（20 ng ／μL），1．25 μL primers（10 μmol ／ L each）， 0．2 μL Taq DNA polymerase（5 U ／μL），
2．0 μL Mg2＋（25 mmol ／ L）， 0．8 μL dNTPs （2．5 mmol ／ L）． The establishment of ISSR－PCR reaction system for M． zenii laid the
foundation for further use of ISSR in molecular marker－assisted breeding， molecular identification and genetic diversity study．
Key words： Magnolia zenii Cheng； ISSR-PCR reaction system； germplasm resources protection
第 16 期
析和亲缘关系鉴别及基因定位等方面得到了广泛
的应用［4－9］。
目前对宝华玉兰的研究，仅在形态学、生物生
态学特性、生存现状、文献考证、群落学分析等方面
有过初步研究和探索，对该物种在分子水平上的遗
传多样性分析至今尚未见报道。 试验通过正交试验
和单因子试验，分析 DNA 模板、Taq 聚合酶、引物、
Mg2＋和 dNTPs 5 个因子用量对宝华玉兰 ISSR－PCR
反应的影响， 建立宝华玉兰最优 ISSR－PCR 反应体
系， 以期为利用 ISSR 标记对其进行分子标记辅助
育种、分子身份证构建和遗传多样性分析等后续研
究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
试验所需的宝华玉兰活体材料采自江苏省句
容县宝华山。 采取植物叶片后用硅胶快速干燥，妥
善保存后送回南京森林警察学院实验室。
1．2 方法
1．2．1 宝华玉兰 DNA 提取 取硅胶干燥的植物叶
片 0．1 g，用研钵研磨粉碎，采用改良的十六烷基三
乙基溴化铵（CTAB）法抽提基因组 DNA［10］。 DNA 的
浓度和质量采用紫外分光光度法和 1％琼脂糖凝胶
电泳法检测。
1．2．2 宝华玉兰 ISSR－PCR 反应引物筛选 引物参
照加拿大哥伦比亚大学（UBC）网站公布的第九套
ISSR 引物序列进行合成。 从 100 个 ISSR 引物中随
机选择 12 条引物 803、816、826、834、842、848、857、
863、875、886、890、897 进行目标引物的筛选。 初反
应体系为 25 μL，其中 Taq 聚合酶（5 U ／μL） 0．2 μL，
Mg2＋（25 mmol ／ L） 2 μL，DNA 模板（20 ng ／μL） 2 μL，
dNTPs（2．5 mmol ／ L） 2 μL，引物（10 μmol ／ L） 1 μL，
MilliQ水 15．3 μL。扩增程序为：95 ℃预变性 10 min；
94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，共
36个循环；72 ℃延伸 10 min。采用 1％琼脂糖凝胶电
泳进行扩增产物检测。
1．2．3 宝华玉兰 ISSR－PCR 反应体系建立 对宝华
玉兰 ISSR－PCR反应的 5因素（Taq酶、Mg2＋、DNA模
板、dNTPs、引物）4水平（浓度）设置正交试验 L16（45），
共 16 个处理， 每处理重复 2 次， 建立宝华玉兰
ISSR－PCR反应体系，具体信息见表 1和表 2。
1．2．4 宝华玉兰 ISSR－PCR 反应单因子试验设计
对正交试验建立的 ISSR－PCR 反应体系进行单因子
试验（Mg2＋、DNA 模板、dNTPs、引物及 Taq 酶用量），
分析不同因素对宝华玉兰 ISSR－PCR 反应的影响；
各单因子处理设置具体信息见表 3。
表 1 宝华玉兰 ISSR-PCR 反应体系正交试验 L16（45）设计
水
平
1
2
3
4
20 ng/μL
DNA 模板（A）
0.50
2.00
3.50
5.00
10 μmol/L
引物/（B）
0.25
0.50
0.75
1.00
2.5 mmol/L
dNTPs（C）
0.60
1.40
2.20
3.00
因素（用量//μL）
25 mmol/L
Mg2+（D）
1.20
1.80
2.40
3.00
5 U/μL
Taq 酶（E）
0.05
0.10
0.15
0.20
表 2 宝华玉兰 ISSR-PCR 反应体系正交试验 L16（45）因素
水平组合的各个处理
试验
号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
20 ng/μL
DNA 模板（A）
0.50
0.50
0.50
0.50
2.00
2.00
2.00
2.00
3.50
3.50
3.50
3.50
5.00
5.00
5.00
5.00
10 μmol/L
引物/（B）
0.25
0.50
0.75
1.00
0.25
0.50
0.75
1.00
0.25
0.50
0.75
1.00
0.25
0.50
0.75
1.00
2.5 mmol/L
dNTPs（C）
0.60
1.40
2.20
3.00
3.00
2.20
1.40
0.60
1.40
0.60
3.00
2.20
2.20
3.00
0.60
1.40
因素（用量//μL）
25 mmol/L
Mg2+（D）
1.80
1.20
3.00
2.40
2.40
3.00
1.20
1.80
3.00
2.40
1.80
1.20
1.20
1.80
2.40
3.00
5 U/μL
Taq 酶（E）
0.05
0.10
0.15
0.20
0.10
0.05
0.20
0.15
0.20
0.15
0.10
0.05
0.05
0.15
0.10
0.20
表 3 宝华玉兰 ISSR-PCR 反应体系单因子试验设计
单因子
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
20 ng/μL
DNA 模板
0.5
2.0
3.5
5.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
10 μmol/L
引物
0.75
0.75
0.75
0.75
0.25
0.75
1.25
1.75
0.75
0.75
0.75
0.75
0.75
0.75
0.75
0.75
0.75
0.75
0.75
0.75
2.5 mmol/L
dNTPs
1.4
1.4
1.4
1.4
1.4
1.4
1.4
1.4
0.8
1.4
2.0
2.6
1.4
1.4
1.4
1.4
1.4
1.4
1.4
1.4
用量//μL
25 mmol/L
Mg2+
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
0.4
1.2
2.0
2.8
1.2
1.2
1.2
1.2
5 U/μL
Taq 酶
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.05
0.20
0.35
0.50
陈云霞等：珍稀濒危植物宝华玉兰 ISSR-PCR 反应体系建立及优化 4207
湖 北 农 业 科 学 2016 年
2 结果与分析
2．1 目标引物确定
综合比较电泳条带的多态性、 稳定性以及亮
度，12 条随机引物 2 次重复的 ISSR－PCR 扩增电泳
结果见图 1。 从图 1 可见，在 12 条引物中，以引物
834 的效果最好。 故引物 834 被选定为目标引物进
行正交试验并建立宝华玉兰 ISSR－PCR反应体系。
2．2 宝华玉兰 ISSR－PCR 正交试验
基于引物 834 的宝华玉兰 ISSR－PCR 5 因素 4
水平正交试验结果见图 2。 从图 2 可见，16 个处理
中除 12、13 号处理无法扩增出条带外，其他处理均
能扩增出条带，且每个处理重复效果基本一致。 对
有扩增结果的 14 个处理进行进一步比较， 发现处
理 7 的条带最清晰， 并且处理 7 的条带多态性较
好， 故选取处理 7 对宝华玉兰进行 ISSR－PCR 反应
体系单因子试验， 分析不同因素对宝华玉兰 ISSR－
PCR 反应的影响， 处理 7 的 25 μL 反应体系中：
DNA 模板 （20 ng ／μL）2．0 μL，Taq 聚合酶（5U ／μL）
0．2 μL，引物（10 μmol ／ L）0．75 μL，dNTPs（2．5 mmol ／ L）
1．4 μL，Mg2＋（25 mmol ／ L）1．2 μL。 据此，对该体系进
行单因子试验浓度梯度设计（表 2），并进行相应的
ISSR－PCR反应。
2．3 宝华玉兰 ISSR－PCR 单因子试验
图 3为不同 DNA 模板、 引物、dNTPs、Mg2＋浓度
及 Taq 聚合酶用量单因子试验对宝华玉兰 ISSR－
PCR反应结果的影响。
2．3．1 DNA 模板用量对宝华玉兰 ISSR－PCR 反应
体系的影响 最佳 DNA 模板用量取决于物种基因
组大小及 DNA模板的纯度。试验比较了 25 μL反应
体系中 DNA 模板（20 ng ／μL）4 个用量 0．5、2．0、3．5、
5．0μL的效果，发现在正常情况下，随着用量的增加，
条带亮度增加，扩增条带多态性增强。 因此宝华玉
兰 ISSR－PCR反应体系中 DNA模板（20 ng ／μL）的用
量在 0．5～5．0 μL范围时，以 3．5 μL用量效果最佳。
2．3．2 引物用量对宝华玉兰 ISSR－PCR 反应的影响
引物用量会直接影响 PCR结果的可靠性。用量偏大
会引起错配和非特异性扩增，且会增加引物二聚体
的形成概率； 用量过小则无法检测出所有的 ISSR
位点。 试验引物用量（10 μmol ／ L）设置了 0．25、0．75、
1．25、1．75 μL 4 个水平，结果表明（图 3），引物用量
在 1．25μL时条带最多且清晰，所以引物用量 1．25μL
（10 μmol/L） 是宝华玉兰 ISSR－PCR 反应体系的最
适用量。
2．3．3 dNTPs 用量对宝华玉兰 ISSR－PCR 反应的影
响 dNTPs 是 ISSR－PCR 反应的原料，用量过高，会
导致 PCR 错配，出现非特异性扩增条带；反之则影
响合成效率， 甚至会因过早消耗而使产物单链化，
影响扩增效果。 试验 dNTPs 用量（2．5 mmol ／ L）设置
了 0．8、1．4、2．0、2．6 μL 4 个水平，结果（图 3）表明，
在 dNTPs用量为 0．8 μL 时，扩增条带亮度和多态性
最好，故宝华玉兰 ISSR－PCR 反应体系中 dNTPs 最
佳用量为 0．8 μL（2．5 mmol ／ L）。
2．3．4 Mg2＋用量对宝华玉兰 ISSR－PCR 反应的影响
Mg2＋用量对 PCR 扩增特异性和产物有显著的影响。
比较宝华玉兰 ISSR－PCR 反应体系中 0．4、1．2、2．0、
2．8 μL（25 mmol ／ L） 4 个 Mg2＋用量的电泳结果，当
Mg2＋用量为 2．0 μL 时，条带多态性较丰富。 因此宝
华玉兰 ISSR－PCR反应体系中最适合的 Mg2＋用量应
为 2．0 μL（25 mmol ／ L）。
2．3．5 Taq 聚合酶用量对宝华玉兰 ISSR－PCR 反应
图 1 12 条引物 2 次重复的 ISSR－PCR 扩增电泳结果
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M803803816816826826834834842842848848857857863863875875886886890890897897
图 2 引物 834 对宝华玉兰 ISSR－PCR 正交试验 L16（45）的
电泳结果
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M991010111112121313141415151616
图 3 宝华玉兰 ISSR－PCR 单因子试验电泳结果
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11121314151617181920
4208
第 16 期
［7］ CHIENTHAVORN O， POONSUKCHAROEN T， PATHRAKO-
RN T． Pressurized liquid and superheated water extraction of
active constituents from Zingiber cassumunar Roxb． ［J］． Rhi-
zome． Separation Science and Technology，2011，46：616－624．
［8］ 邹元锋，曹朝生，刘 江，等 ． 党参质量评价研究进展［J］． 中草
药，2010，41（3）：附 3－附 6．
［9］ 宋 丹． 川党参活性成分与品质评价研究［D］． 上海：上海中医
药大学，2008．
［10］ 陈 璐，王天志，杨 兵，等．比较和优化党参炔苷的提取工艺［J］．
华西药学杂志，2008，23（4）：454－455．
［11］ 冯佩佩，李忠祥，原 忠 ． 党参属药用植物化学成分和药理研
究进展［J］． 沈阳药科大学学报，2012，29（4）：307－311．
［12］ 贺 庆，朱恩圆，王峥涛，等． 党参化学成分的研究［J］． 中国药
学杂志，2006，41（1）：10－12．
［13］ 王 萌，陈建伟，李 祥，等． 明党参根皮超临界萃取部位化学
成分研究［J］． 天然产物研究与开发，2012，24（6）：764－767．
［14］ 石任兵，周海涛，魏宁漪，等． GC ／ MS 法分析党参有效部位中挥
发性和脂溶性化学成分［A］．中国药学会．2004 年中国药学会学
术年会论文集［C］． 昆明，2004．190－197．
［15］ 刘同举，闵 江，李淑芬，等． 超临界 CO2萃取党参中脂溶性成
分的工艺研究［J］． 食品科学，2010，31（14）：145－147．
［16］ 宋艺君，郭 涛． 党参多糖提取纯化工艺的研究［J］． 现代中医
药，2010，30（3）：77－78．
［17］ 孙婉娟，徐斯凡，胡华刚，等．现代提取工艺在党参中的应用［J］．
中央民族大学学报（自然科学版），2013，22（1）：65－68．
［18］ 孟冬玲，刘绍华 ． 中草药添加剂在中国卷烟中的应用研究进
展［J］． 中国烟草科学，2006，27（3）：19－21．
［19］ 马方励，杨宜婷．提取新技术在中草药保健食品中的应用［J］．中
国食品工业，2006（12）：47－49．
［20］ 杨 靖，李瑞丽，陈芝飞，等． 八角茴香油的超临界 CO2萃取及
分析［J］． 中国调味品，2010，35（12）：96－98．
（上接第 4202页）
的影响 Taq 聚合酶用量直接影响扩增反应的成功
与否，但 Taq 酶用量多不仅成本高，而且易产生非
特异扩增产物；但如若 Taq 酶用量过低，则会导致
产物合成效率下降 。 由图 3 可见 ，Taq 酶用量在
0．05～0．50 μL（5 U ／μL）范围时，以 0．20 μL 用量效果
最好，条带最亮、多态性最丰富。
3 讨论
ISSR 是一种基于 PCR 的分子标记技术， 而影
响 PCR 反应的因素有多种，其中 DNA 是 PCR 反应
的模板，dNTPs 是 PCR 反应的原材料， 引物与 DNA
靶序列结合引导 PCR 反应，Mg2＋是 Taq 聚合酶的激
活剂 。 因此 ，ISSR－PCR 反应体系受 DNA 模板 、
dNTPs、 引物、Mg2＋和 Taq 聚合酶等因素及因素间相
互作用的影响；不同反应体系中各因素水平的组合
不同，也就产生了不同的 ISSR－PCR 反应结果 ［11－13］。
为此，试验采用正交试验 L16（45）及单因子试验找出
了各因素水平间的最优组合，并确定其为最佳反应
体系。结果表明，DNA 模板、Mg2＋、dNTPs 及引物的用
量对宝华玉兰 ISSR－PCR 扩增的影响较大， 浓度过
高或过低时常导致背景弥散或条带缺失；而 Taq 聚
合酶用量对扩增的影响较小，在设置的浓度范围内
条带变化不大。
宝华玉兰 ISSR－PCR 最佳反应体系的建立为利
用 ISSR 标记对其实施进一步的分子标记辅助育
种、DNA 指纹图谱构建和遗传多样性分析等后续研
究奠定了基础。
参考文献：
［1］ 薛晓明，阚芯蕊，张 晶． 江苏省特有植物宝华玉兰的濒危状态
及其保护对策研究 ［J］． 科技情报开发与经济 ，2010，20（35）：
137－139．
［2］ ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D． Genome finger-
printing by simple sequence repeat （SSR） anchored polymerase
chain reaction amplifi cation［J］．Genomics，1994，20：176－183．
［3］ 朴红梅，李万良，穆 楠，等． ISSR 标记的研究与应用［J］． 吉林
农业科学，2007，32（5）：28－30．
［4］ CAI Y，SUN D K，WU G J，et al． ISSR－based genetic diversity
of Jatropha curcas germplasm in China［J］． Biomass and Bioen-
ergy，2010，34：1739－1750．
［5］ ARIF M，ZAIDI N W，SINGH Y P，et al． A comparative analy-
sis of ISSR and RAPD markers for study of genetic diversity
in shisham （Dalbergia sissoo） ［J］．Plant Molecular Biology Re-
porter，2009，27：488－495．
［6］ PARSAEIAN M，MIRLOHI A，SAEIDI G． Study of genetic vari-
ation in sesame（Sesamum indicum L.） using agro－morphological
traits and ISSR markers［J］． Genetika，2011，47：359－367．
［7］ XIE Y，LI J Y，FAN Z Q，et al． DNA extraction and ISSR
primer screening of Camellia chekiangoleosa ［J ］ ． Agricultural
Science ＆ Technology，2011，12：825－828．
［8］ YE Y M，ZHANG J W，NING G G，et al． A comparative analy-
sis of the genetic diversity between inbred lines of Zinnia elegant
using morphological traits and RAPD and ISSR markers ［J］．
Sciatica Horticulture，2008，118：1－7．
［9］ LU J J，ZHAO H Y，SUO N N，et al． Genetic linkage maps of
Dendrobium moniliforme and D． officinale based on EST－SSR，
SRAP，ISSR and RAPD markers［J］．Scientia Horticulturae，2012，
137：1－10．
［10］ 李金璐，王 硕，于 婧，等．一种改良的植物 DNA提取方法［J］．
植物学报，2013，48（1）：72－78．
［11］ 王弦云，朱晓敏，王 勤，等．杜仲 ISSR－PCR反应体系的建立与
引物筛选及其在遗传多样性研究中的应用［J］． 经济林研究，
2013，31（1）：30－34．
［12］ 田 斌，辛培尧，孙正海，等． 三七 ISSR－PCR 反应体系建立及
优化［J］．云南农业大学学报，2013，28（1）：96－101．
［13］ 胡凤荣，王 斐，王志强，等． 风信子 ISSR－PCR 体系的优化及
引物筛选［J］．分子植物育种，2013，11（1）：139－144．
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陈云霞等：珍稀濒危植物宝华玉兰 ISSR-PCR 反应体系建立及优化 4209