全 文 ：短芒大麦 DREB1基因的克隆与特性分析
王呈玉1 , 2 , 张明哲1 , 万　生生1 , 吕世友1 , 马兰青1 , 李彦舫1
(1.吉林大学农学部植物科学学院 ,长春 130062;2.吉林农业大学资源与环境学院 ,长春 130118)
摘　要:在已知短芒大麦 DREB1 基因 3′端序列的前提下 , 根据其他植物中 DREB1 转录因子基因序列 ,首次克
隆了短芒大麦全长 DREB1基因(899 bp ,具有 1 个编码 220个氨基酸的完整阅读框)。序列分析和生物信息学
分析表明 ,该基因具有转录因子的典型特征及 AP2/ EREBP 结构域 , 并且具有 6 个丝氨酸 、2 个苏氨酸 、2 个酪
氨酸磷酸化位点 ,这可能与翻译后在冷胁迫抗性中发挥作用有关。
关键词:短芒大麦;冷胁迫;转录因子;结构域
中图分类号:Q785　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2006)05-0516-05
Cloning and Characterization of HbDREB1 Gene Encoding a Putative
DRE-Binging Transcription Factor in Hordeum brevisubulatum
WANG Cheng-yu1, 2 , ZHANGMing-zhe1 , WAN Shen1 , L Shi-you1 , MA Lan-qing1 , et al.
(1.College of Botanical Science , Agricultural Department of Jilin University , Changchun 130062 , Chi-
na;2.College of Resources and Environment , J ilin Agaricultural University , Changchun 130118 , Chi-
na)
Abstract:DREB1 transcription activators are critical regulators of gene expression in the signal transduc-
tion of cold-stress , and can regulate a series of expression of low-tolerance genes.We successfully cloned
a cDNA of DREB1 from Hordeum brevisubulatum (Trin.)Link.Sequence and biological information
analysis revealed that HbDREB1 contained 899 nucleotides , and its encoding protein consisted of 220
amino acid residues , including a AP2/EREBP domain region and six serines , two threonines and tyrosine
phosphorylation sites , and this is possibly associated with posttranslational anti-cold-stress effect.
Key words:Hordeum brevisubulatum;cold-stress;transcription factor;domain
　　低温限制了植物的地域分布及生长 ,是造成
经济作物品质和产量降低的主要环境胁迫因子之
一。低温胁迫对植物的影响是一个复杂的生物学
过程 ,在适应低温的过程中 ,植物体内会发生许多
生理 、生化和结构变化 ,许多基因也可以得到诱导
表达[ 1-4] 。由于植物的抗寒性是由复杂的多基因
控制的数量性状 ,通过导入单一功能基因虽然在
一定程度上可以得到提高 ,但总的来说效果不是
很明显[ 4-5] ,用干旱 、高盐及低温诱导的 rd29A基
因进行转化 ,虽然也能使转基因植株的相应抗性
得到增强[ 6] ,但不如利用 DREB 转录因子基因所
获得的效果明显[ 7] 。
众多对植物冷胁迫分子机理的研究表明 ,
CBF/DREB1转录因子在植物感受冷胁迫过程中
发挥了重要的作用 。Yamaguchi-Shinozaki 等在对
COR78/RD29A抗性基因的启动子区域研究中发
现了脱水反应元件 DRE ,其核心序列是 A/GCC-
GAC[ 6] 。相同的序列也在低温诱导表达基因的启
动子区域被发现 , 称为 CRT(C-repeat-binding fac-
tor)[ 8-9] 。

通讯作者
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30471229)
作者简介:王呈玉(1975-),女 ,在读博士 ,讲师 ,研究方向:植物分子生物学。
收稿日期:2005-10-31　　修回日期:2006-05-09
　第 28卷第 5 期 吉　林　农　业　大　学　学　报 Vol.28 No.5　
　2006 年 10月 Journal　of　Jilin　Agricultural　University October 2006　
DOI :10.13327/j.j jlau.2006.05.011
有人从模式植物拟南芥中先后鉴定出了转录
因子CBF1 、CBF2 、CBF3和CBF4[ 9-13]或脱水反应元
件结 合 蛋 白 DREB1B , DREB1C , DREB1A 和
DREB2A , DREB2B[ 14] 。这些转录因子是 AP2/
EREBP 转录因子家族的 1个亚族 ,可以与启动子
区域含有低温和脱水反应 DNA 调控元件(CRT/
DRE)的抗逆基因结合 ,调控多个耐逆功能基因的
表达 , 从而激活或抑制植物体内的多种耐逆机
制[ 14-16] 。
许多重要的农作物为禾本科植物 ,如水稻 、小
麦 、大麦 、玉米等 ,若从双子叶植物中分离基因用
于单子叶植物的品质改良 ,极有可能由于基因的
异源表达而导致许多问题的产生。本研究根据其
他植物中 DREB1转录因子基因序列 ,在已知短芒
大麦 DREB1(HbDREB1)基因 3′端序列的前提下
进行了 HbDREB1转录因子基因的全长克隆与特
性分析。HbDREB1 来源于同禾本科农作物亲缘
关系最近的禾本科植物短芒大麦 ,利用该基因对
禾本科作物的抗寒性进行改良可能更具有优越
性。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　植物材料　取短芒大麦种子 ,用 1.0 g/L
的HgCl2 进行表面消毒 ,用蒸馏水冲洗 ,于 37℃浸
种24 h 。27℃,自来水暗培养至根长约 2 cm ,转移
至光下(每天光照 12 h)在含Hoagland营养液中进
行培养。苗龄2周后 ,置 4℃下冷胁迫处理3 h ,剪
取叶片于-80℃贮存备用。
1.1.2　菌株和载体　大肠杆菌 E.coli DH5α由
吉林大学农学部基础生物实验室保存 , pMD18-T
载体为TaKaRa 公司产品。
1.1.3　主要试剂　反转录试剂盒为 Promega 公
司产品 , Ex Taq酶为TaKaRa公司产品 , DNA回收
试剂盒购自杭州维特洁生物公司 , Trizol总 RNA
提取试剂盒为GIBCO BRL 公司产品 。琼脂糖 、焦
碳酸二乙酯(DEPC)为 Promega 产品 ,5-溴-4-氯-3-
吲哚半乳糖苷(X-gal)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
(IPTG)、氨苄青霉素等购自北京鼎国生物公司 ,分
子量标准 DL-2000购自 TaKaRa公司。
1.1.4　引物设计与合成　根据真核生物 mRNA
3′末端具有 polyA尾结构的特性 ,设计了锚定反转
录引物QT及 PCR扩增下游引物Q1;根据Genbank
中大麦 DREB1基因(基因注册号:AF442489)5′端
序列设计 PCR扩增上游引物 CBF。引物由上海
生工生物公司合成 。引物序列 QT:5′-GAG-
GACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′;
CBF:5′-TAGCTGCGAGCCATGGACAC-3′;Q1:5′-
GAGGACTCGAGCTCAAGC-3′。
1.2　方法
1.2.1　短芒大麦总 RNA 的提取　按 Trizol试剂
盒使用说明提取冷胁迫 3 h的短芒大麦总 RNA。
1.2.2　cDNA的合成　HbDREB1基因的反转录
反应体系:总 RNA 2.0 mL , QT(10 pmol/μL)
5.0 μL , 5 ×RT 缓冲 液 4 μL , dNTP 混 合物
(10 mmol/μL)2.0μL ,RNA酶抑制剂 40 U ,反转录
酶10 U ,加 DEPC 水至 20 μL。反应条件:70℃温
育5 min ,立即置于冰上 10 min , 25℃5 min ,42℃
1 h ,70℃15 min灭活反转录酶 , -20℃冰箱保存
反转录产物。
1.2.3　HbCBF/DREB1基因的PCR扩增　以 RT
反应产物为模板 ,以 CBF 和Q1为引物进行 PCR。
反应体系:Ex Taq酶(5 U/μL)1.0μL ,反应缓冲液
GC Buffer Ⅰ 25.0 μL , dNTP 混合物(10 mmol/L)
2.0μL , RT产物 2.0 μL ,引物 CBF(10 pmol/μL)和
Q1(10 pmol/μL)各 1.0μL ,加灭菌水至 50μL。反
应条件:94℃ 预变性 4 min , 94℃ 30 s ※57℃
30 s※72℃45 s ,35个循环 ,72℃延伸10 min。反
应结束后用 10 g/L 的琼脂糖凝胶电泳对 PCR产
物进行鉴定。
PCR产物的回收 、连接 、转化 、PCR及酶切鉴
定和测序均按常规方法[ 17]操作 。
2　结果与分析
2.1　总 RNA的提取
以Trizol法提取的短芒大麦幼苗的 RNA琼脂
糖凝胶电泳结果见图 1。由图1可见 3条电泳带 ,
从上到下分别为28 ,18 ,5 S 。
图 1　总 RNA的电泳结果
Fig.1.Agarose gel electrophoresis of total RNA
517　第 28卷　第 5 期 王呈玉等:短芒大麦 DREB1 基因的克隆与特性分析
2.2　HbDREB1基因 RT-PCR扩增结果
以提取总 RNA为模板进行 RT-PCR ,反应结
束后进行琼脂糖凝胶电泳。结果获得 1条899 bp
的片段 。测序结果在 NCBI 中进行检索 ,与其他
同类基因的同源性达到 41.86%～ 91.40%,因此 ,
命名为 HbCBF/DREB1(图 2)。
M.DL-2000 Marker;1.HbDREB1
图 2　RT-PCR扩增结果
Fig.2.Result of RT-PCR amplification
2.3　HbDREB1重组质粒酶切鉴定结果
用限制性内切酶 BamH Ⅰ和 HindⅢ对 pMD-
HbDREB1质粒双酶切 ,得到 942 bp的片段 ,其片
段长度与预期大小相符(图 3)。
M.DL2000Marker;1.HbDREB1
图 3　HbDREB1重组质粒双酶切鉴定结果
Fig.3.Identification of recombination Hb DREB1 plas-
mid digestion by double enzyme
2.4　HbDREB1基因的生物信息学分析
2.4.1　HbDREB1的序列分析　利用 DNAman软
件对获得的 HbDREB1基因全长进行分析(图 4)。
图 4　HbDREB1基因的全长 cDNA序列及其编码的氨基酸序列
Fig.4.HbDREB1cDNA sequence and its deduced amino acid sequence
　　所获得的 HbDREB1 长 899 bp , 其中包括
663 bp完整的开放阅读框 ,推测编码 220 个氨基
酸的多肽 ,分子量为 24.394 kD ,等电点(PI)值为
5.27;同时含有 12 bp 的 5′非转译区(5′UTR)和
224 bp的 3′非转译区(3′UTR)以及多聚腺苷酸尾。
5′UTR区起始密码子前有 1个终止密码子 ,说明
所获得的 cDNA为全长。3′UTR存在 poly(A)加尾
信号(TGTAAA)。另外 ,该蛋白的 N-端含有 1个
“PKRRAGRIKLQETRHP”基序 ,可能作为核定位信
号(nuclear localization signal , NLS)引导该蛋白定
位于细胞核上。C-端存在 1个典型的酸性活化
区域(acidic activation region ,AAR),该区域可能有
518 　吉　林　农　业　大　学　学　报 2006 年
利于该基因转录 。这些结果表明 HbDREB1是一
种典型的转录因子 ,属于AP2/EREBP 蛋白家族的
DREB亚家族 。图 4中方框区表示 poly(A)加尾信
号 ,下划双线表示该类基因的标签序列“PKRRA-
GRIKLQETRHP” 、“DSAWR” 、“LWSY” ,下划单线区
表示AP2/EREBP 保守区。
2.4.2　HbDREB1基因的结构功能域分析　利用
Blast 服 务 器 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
BLAST/)对推测的氨基酸序列进行结构域分析。
结果表明 , HbDREB1氨基酸序列(49 ～ 109)含有
1个典型的AP2结构域 ,该结构域由 61个氨基酸
组 成。 利 用 NetPhos 服 务 器 (http://
www.cbs.dtu.dk/ services/)对 HbDREB1 氨基酸序
列进行磷酸化位点的分析 ,结果表明氨基酸序列
中有 6个丝氨酸 、2个苏氨酸 、2个酪氨酸磷酸化
位点 ,这些磷酸化位点可能为该转录因子翻译后
的修饰和在抗逆反应中发挥作用所必须[ 14 , 17] 。
2.5　HbDREB1与其他植物 DREB1转录因子氨
基酸序列的多序列比较
利用 DNAman软件对 HbDREB1与植物中已
克隆的 DREB1转录因子蛋白的编码氨基酸序列
进行同源性分析(图 5)。结果表明 HbDREB1与
其他植物 DREB1转录因子蛋白的同源性比较高 ,
大约为 41.86%～ 91.40%。但 HbDREB1的编码
氨基酸在N-端及 C-端处同双子叶植物 DREB1
转录因子蛋白之间的差异很大 ,与单子叶植物的
差异较小 ,但在 AP2/EREBP 结构域处的保守性比
较高。图中深色部分为 AP2/EREBP 结构域保守
序列 。
Hb.短芒大麦 Hordeum brevisubulatum;Hv.大麦 Hordeum vulgur , AF442489;Zm.玉米 Zea mays , AF450481;Bo.甘蓝 Brassica oleracea ,
AF370732;Cd.棉花 Cynodon dactylon , AY462117;Pa.樱桃 Prunus avium , AB121674
图 5　Hb DREB1同其他植物 DREB1类蛋白编码氨基酸的序列比较
Fig.5.Multiple alignments of the amino-acid sequences of DREB1 type protein isolated from plants
3　讨　论
对未知基因 cDNA末端进行快速扩增时通常
采用 RACE 的方法(cDNA 末端快速扩增方
法)[ 18] 。由于 5′RACE 方法对未知基因 5′末端进
行克隆具有一定的难度 ,因此本研究在吉林大学
农学部基础生物实验室万生生博士扩增出的 Hb-
DREB1 cDNA3′末端的基础上 ,通过已知的 3′末端
与已在 Genbank中注册的 Hordeum vulgare subsp.
Vulgare (AF442489)的 DREB1基因编码的氨基酸
序列进行比对 ,结果发现 ,HbDREB1 cDNA的 3′末
端编码的氨基酸序列与 HvDREB1编码的氨基酸
序列同源性达到 89.66%,据此推测 HbDREB1与
HvDREB1 编码的全部氨基酸序列也将具有较高
的同源性 ,因此我们依据 HvDREB1基因的5′端碱
基序列设计出引物 CBF ,对短芒大麦 DREB1基因
进行了克隆。
对短芒大麦中克隆的 HbDREB1基因所编码
的氨基酸序列进行分析 ,发现其类似于其他的
DREB1类转录因子 ,具有转录因子的典型特征:
N-端具有核定位信号 、C-端具有一段酸性活化
区域 , 并且含有与 DNA 结合的区域(AP2/
EREBP)[ 15] 。Riechmann 等分析了拟南芥中大约
140种含有 AP2/EREBP 结构域的蛋白 ,结果只有
CBF1 、CBF2和CBF3蛋白氨基酸AP2/EREBP 结构
域 两 侧 含 有 “ PKK/RPAGRxKFxETRHP ” 和
“DSAWR”基因序列[ 18] ,而这 3种蛋白都与低温胁
迫相关 ,因此称为DREB1类基因的标签序列。Ja-
glo等对多个 CRT/CBF(DREB1同类基因)的分析
结果与 Riechmann 等的结论一致[ 19] 。 HbDREB1
519　第 28卷　第 5 期 王呈玉等:短芒大麦 DREB1 基因的克隆与特性分析
转录因子编码的氨基酸序列中具有 DREB1类转
录因子的标签序列 ,这充分说明该转录因子属于
DREB1类蛋白。
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