全 文 ：昆明蜘蛛兰和喜林芋上发现番茄斑萎病毒属病毒
TospovirusesfoundonspiderlilyandphilodendroninKunming
刘雅婷 1　郑元仙1　李永忠2＊　徐小刚 1　李正跃 3
(1.云南农业大学农学与生物技术学院 , 昆明 650201;2.云南农业大学烟草学院 ,
昆明 650201;3.云南农业大学植物保护学院 , 昆明 650201)
LiuYating1　ZhengYuanxian1　LiYongzhong2＊　XuXiaogang1　LiZhengyue3
(1.FacultyofAgricultureandBiotechnology, YunnanAgriculturalUniversity, Kunming 650201, Yunnan
Province, China;2.FacultyofTobaccoScience, YunnanAgriculturalUniversity, Kunming
650201, YunnanProvince, China;3.FacultyofPlantProtection, Yunnan
AgriculturalUniversity, Kunming 650201, YunnanProvince, China)
　　番茄斑萎病毒属 Tospovirus病毒可引起烟草 、蔬
菜和花卉等多种作物发生严重病害 ,导致世界范围
内重大农业经济损失[ 1] 。近年来 ,云南省昆明市园
林花卉发生一种新的病毒病 ,症状表现为系统坏死 、
褪绿 、黄斑和叶片畸形 ,与 Tospovirus属病毒引起的
症状非常类似。本研究针对该病害进行了调查和
鉴定。
1 材料与方法
1.1 病毒样本收集
2004— 2007年 ,在云南省昆明市进行调查 ,获
得具有较为典型的 Tospovirus症状的 8份样品 ,其
中 ,蜘蛛兰 HymenocalislitoralisSalisb.植株上获得
3份样品 ,分别是 HSS-1、 HSS-4和 HSS-5,症状表现
为沿叶脉出现系统性黄斑和坏死 、同心环纹;喜林芋
Philodendronbipinnatifidum植株上获得 1份样品
Ph1 ,症状表现为叶片沿叶脉出现系统性褪绿 、坏死
和皱缩;日本鸢尾 Irisjaponica上获得 1份样品 Iris-
1,症状表现为坏死斑和黄斑;剑叶龙血树 Dracaena
cochinchinensis上获得 2份样品 ,分别是 Dr-1和 Dr-
2,症状表现为系统性坏死斑;鸭跖草 Commelina
communis上获得 1份样品 Dayf-1,症状表现为褪绿
和同心环纹 。采用 Ndunguru等 [ 2]的方法将具有典
型症状的叶片转移到 FTA卡(Whatman公司提供)
上 ,备用。
1.2 免疫试纸条检测
根据 AGDIA公司使用说明 (AGDIA, 编号:
STX39300),用 TSWV和 INSV免疫试纸条对病毒样
品进行检测。
1.3 鉴别寄主检测
种植鉴别寄主黄花烟 Nicotianalrustica、心叶烟
Nicotianaglutinosa、辣椒 Capsicumfrutescans、旱金莲
Tropaelummajus、凤仙花 Impatiensbalsamica和一点
红 Emiliasonchifolia。将样品的幼嫩组织通过摩擦
接种方法 [ 3]接种到鉴别寄主上 ,置于隔虫网箱中培
养 ,记录发病情况。
1.4 RT-PCR检测
RNA提取:应用 PureLinkTotalRNA纯化试剂
盒从 FTA卡上提取 RNA,操作步骤根据 Invitrogen
公司使用说明(Invitrogen, Carlsbad, CA),略有改
动 ,在 RNA溶解溶液中加入 2%聚乙烯吡咯烷酮
(PVP, w/v)和 1% β -巯基乙醇 ,每 5 mm2 FTA卡
需 500μLRNA裂解溶液。
RT-PCR:用随机引物 (N6)(Invitrogen, Carls-
bad, CA)合成 cDNA。使用 AGDIA公司设计的产
品编号为 PCR98100 /0025的 Tospovirus通用引物
(AGDIA, Elkhart, IN)进行 LRNA片段 PCR扩增。
基金项目:国家自然科学基金(300960224), 云南省自然科学基金(2005C0036M, 2007C0036M),云南省教育厅自然科学基金项目
　　　　　(5Y0171B),国家 “973”项目(2006CB100204)
作者简介:刘雅婷 , 女 , 1971年生 , 副教授 ,研究方向为植物病原微生物与寄主互作 , email:liuyating999@yahoo.com.cn, Tel:0871-
　　　　　5227732
＊通讯作者(Authorforcorespondence), email:liyongzhong168@163.com, Tel:0871-5221966
收稿日期:2009-05-11
第 36卷　第 6期
2009年　12 月
植　物　保　护　学　报
ACTA PHYTOPHYLACICA SINICA
Vol.36　 No.6
Dec. 　2009
PCR反应程序如下:94℃预变性 10min;94℃ 1min,
45℃ 2min, 72℃ 3min, 5个循环;然后 94℃ 1min,
52℃ 2 min, 72 ℃ 3 min, 30个循环;72 ℃延伸 10
min。尔后 1%琼脂糖电泳 ,紫外成像系统拍照。
基因克隆和测序:用 Qiagen公司的 QIAquick
PCR纯化试剂盒纯化 PCR扩增产物。 Promega公司
提供的 pGEM-T载体连接 , 并通过 Escherichiacoli
(JM-109)转化 ,用标准生物学操作程序 [ 4] ,在美国
北卡罗来那州立大学基因组研究所完成重组体克隆
的测序 。
序列分析:采用 Invitrogen公司的 VectorNTI
Version9.0软件创建序列数据库 , Bioedit(htp://
www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)进行序
列整理 ,通过 Ncbiblast(htp://www.ncbi.nlm.nih.
gov/BLAST/)比对 ,应用 DNAMAN软件将获得的序
列与 GenBank中发布的其它 Tospovirus属病毒序列
进行比对分析 ,获得系统进化树。用于比对的病毒
及序列号分别是:花生芽坏死病毒(Groundnutbud
necrosisvirus, GBNV,序列号:AF025538)、西瓜银斑
病毒(Watermelonsilvermotlevirus, WSMoV,序列号:
NC 003832)、凤仙花坏死斑病毒(Impatiensnecrotic
spotvirus, INSV,序列号:NC 003625)、番茄斑萎病
毒 (Tomatospotedwiltvirus, TSWV, 序列号:NC
002052)、辣椒褪绿病毒 (Capsicumchlorosisvirus,
CaCV,序列号:NC 008302)、鸢尾黄斑病毒 (Iris
yelowspotvirus, IYSV, Moyeretal.,未发表序列)、番
茄环斑病毒(Tomatozonatespotvirus, TZSV,序列号:
EF552435)和瓜类黄斑病毒(Melonyelowspotvirus,
MYSV, 序列号:NC 008306)。
2 结果与分析
2.1 免疫试纸条检测
用 TSWV和 INSV免疫试纸条检测 8份样品 ,
结果均显示为阴性 ,说明这些样品都未感染 TSWV
和 INSV。
2.2 寄主范围检测
接种 3天后 ,在心叶烟上出现局部坏死斑 ,大约
30天后植株坏死;接种 7天后 ,黄花烟上出现褪绿 、
皱缩和坏死的系统症状;其余鉴别寄主未表现症状 。
2.3 LRNA核酸序列片段比对和系统进化关系分析
进一步通过 Tospoprimers引物进行 LRNA序
列 RT-PCR扩增 ,确定采自云南的 8份样本中 4份
属于 Tospovirus,分别是 HSS-1、HSS-4、HSS-5和 Ph1。
这 4份样品来源于云南省昆明市 ,其自然寄主包括
蜘蛛兰和喜林芋。
从 4份样品中均获得约 500bpLRNA片段 ,序
列比对后得到系统进化树 ,发现这 4份 Tospovirus样
品明显分为 2簇 ,即 YN-1和 YN-2。 YN-1簇包括
HSS-4和 Ph1,与血清组Ⅳ的成员 GBNV、WSMoV和
CaCV相似值达到 79%;YN-2簇包括 HSS-1和 HSS-
5,与血清组Ⅵ 的成员 IYSV相似值达到 83%。 YN-1
和 YN-2相似组群与 TSWV和 INSV组群的相似值
仅为 66%。
3 讨论
Tospovirus属病毒是一类非常重要的农业植物
病毒 ,了解其发生 、流行与分布有利于该类病害的防
控。本研究通过 RT-PCR,确定 Tospovirus属病毒在
云南省喜林芋和蜘蛛兰上发生。云南省存在多种生
态类型 , 且气候类型复杂 , 植物物种非常丰富 , 为
Tospovirus属病毒侵染提供了得天独厚的条件。
2008年 Dong等 [ 5]报道云南番茄上普遍发生 TZSV,
通过序列比对 ,发现 HSS-4、Ph1与 TZSV相似值达
到 83%, HSS-1、HSS-5与 IYSV相似值达到 83%,说
明云南省 Tospovirus属病毒具有多样性 ,该地区除存
在 TZSV,至少还有其它两种 Tospovirus属病毒。本
研究中 Tospovirus属病毒的 4份样品 ,即 HSS-1、HSS-
4、HSS-5和 Ph1,经免疫试纸条检测非 TSWV和 INSV
引起 ,再经 RT-PCR,均获得约 500 bpLRNA片段 ,
通过序列比对确定是由 Tospovirus属病毒引起 ,但其
病毒种类尚未确定 ,还有待进一步研究 。
致谢:美国北卡罗来那州立大学 JamesW.Moyer教授为本
研究分子鉴定部分提供帮助 , 特此致谢。
参 考 文 献(References)
[ 1] LoebensteinG, ThottappilyG.Virusandvirus-likediseasesof
majorcropsindevelopingcountries.Dordrecht, TheNether-
lands:KluwerAcademicPublishers, 2003
[ 2] NdunguruJ, TaylorNJ, YadavJ, etal.ApplicationofFTA
technologyforsampling, recoveryandmolecularcharacteriza-
tionofviralpathogensandvirus-derivedtransgenesfromplant
tissues.VirologyJournal, 2005, 2:45
[ 3] 方中达.植病研究方法(3版).北京:中国农业出版
社 , 1998
[ 4] SambrookJ, RusselDW.Molecularcloning:Alaboratory
manual(3rded).ColdSpringHarborLaboratoryPress, New
York, 2001
[ 5] DongJH, ChengXF, YinYY, etal.Characterizationofto-
matozonatespotvirus, anewtospovirusinChina.Archivesof
Virology, 2008, 153(5):855-864
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