全 文 ：[ 基金项目] 湖北省科委重点攻关计划项目资助(编号:2002P1105)　[作者简介] 于丽秀 ,女 ,硕士 , 药师 ,电话:027-85726073 , E-mail:yu lixiu
@yahoo.com.cn　[ 通讯作者] 陈东生 ,男 ,主任药师 ,电话:027-85726077 , E-mai l:yjkchen@yahoo.com.cn
微波辅助提取菝葜有效成分及其对钙调神经磷酸酶活性的作用
于丽秀1 ,华小黎1 ,陈东生1 ,胡丽玲2 ,廖婧2 　(1.华中科技大学同济医学院附属协和医院药剂科 ,湖北 武汉 430022;2.
华中科技大学同济医学院 ,湖北 武汉 430032)
[ 摘要] 　目的:研究微波辅助提取菝葜中有效成分对钙调神经磷酸酶(calcineurin , CaN)活性作用的影响。方法:采用微波辅
助提取的方法提取菝葜中的有效成分 ,收集菝葜提取物 ,按照一定的梯度配置成不同浓度 , 作用于 CaN 。以 p-NPP为底物采
用分光光度法测定 CaN 的活性 ,考察菝葜提取物对 CaN活性的影响。结果:菝葜提取物对 CaN 有不同程度地抑制作用。结
论:随着菝葜提取物浓度的升高 , 其抑制作用有逐渐增强的趋势。
[ 关键词] 　菝葜;微波辅助提取;钙调神经磷酸酶;抑制作用
[中图分类号] R96　　[ 文献标识码] A　　[ 文章编号] 1001-5213(2010)09-0738-03
Microwave-assisted extraction of Smilax china and the influence of active ingredients of Smilax
china on the activity of calcineurin enzyme(CaN)
YU Li-xiu1 ,HUA Xiao-li1 ,CHEN Dong-sheng1 , HU Li-ling2 , LIAO Jing2(1.Union H ospital of Huazhong Uni-
versity of Science and Techno lo gy Hubei Wuhan 430022 , China;2.Huazhong Univer sity of Science and Techno log y , H ubei Wu-
han 430032 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To investig ate the microw ave-assisted ex traction of Smila x china and the influence o f activ e ing redi-
ents of S mila x china on the activity of calcineurin enzyme(CaN).METHODS　The effectiv e materials of S milax china were
ext racted by using microwave-a ssisted extr action;Co llected the ex tractiv es , then added diffe rent concentrations of S mila x china
ext ractives to the experiment o f CaN.Observ ed the changes of activity of CaN by spectr opho tomet ric me thod , p-NPP was used
as a substr ate.RESULTS　The ex tractive of S mi la x china has some inhibitory effec ts on CaN.CONCLUSION　Along w ith the
ext ractives concentra tion of S milax china increasing , its inhibito ry ac tion on CaN str eng thens g radually.
KEY WORDS:Smila x China;microwave-assisted ex traction;calcineurin enzyme(CaN);inhibition
　　菝葜为百合科植物菝葜 Smila x china L.的干
燥根茎 ,具有多种药理活性 ,如抗炎抑菌作用 、抗肿
瘤作用 、抗诱变作用 、免疫调节作用等[ 1-3] 。目前研
究表明钙调神经磷酸酶(CaN)在体内广泛分布 ,参
与多种细胞功能调节 ,是一种多功能信号酶 。在细
胞因子介导的 T 细胞活化中起到调节枢纽的作用;
在神经递质的释放 、突触可塑性方面亦具有重要的
调节作用;新近研究表明 ,CaN 介导的信号通路在
心肌肥大的发生发展中也起到至关重要的作用 ,使
CaN 的研究受到基础及临床科学家的广泛关注[ 4] 。
在免疫系统方面 , CaN 参与 T 细胞的活化 ,是 CsA
和 FK506发挥免疫抑制作用的靶酶。根据 CaN 的
特点 、生物活性以及菝葜的药理活性 ,本实验选用提
取效率较高的微波辅助提取方法提取菝葜中的有效
成分 ,考察菝葜提取物对 CaN活性的影响大小 ,为以
后深入研究菝葜的作用机制提供一定的实验基础 。
1　材料
UV -2450 型紫外分光光度计(Shimadzu 公
司);MDS-6型温压双控微波消解/萃取仪(上海新
仪微波化学科技有限公司);循环水式多用真空泵
(SHB-Ⅲ ,郑州长城科工贸有限公司);菝葜药材(采
自湖北省大悟县 ,经武汉协和医院中药鉴定室鉴
定);对硝基磷酸酚(p-NPP , sigma公司);钙调磷酸
酶测试盒(biomol Research Labo rato ries);薯蓣皂
苷(中国药品生物检定所 ,批号 1539-200001);试剂
均为分析纯;水为注射用水 。
2　方法与结果
2.1　微波辅助提取　称取菝葜粗粉 100 g ,浸泡 2
h后 ,微波提取温度100 ℃ ,溶剂浓度约为0.1 mol·
L
-1的氢氧化钠水溶液 ,液固比为 5∶1 ,待温度达到
100 ℃后 ,提取 9 min。提取完毕后趁热滤过 ,合并
滤液 ,旋转蒸发 ,浓缩至膏状。浓缩物置60 ℃真空
干燥器中干燥至干 ,备用。
2.2　菝葜提取物中皂苷的含量测定
2.2.1　标准曲线的制备　精密称取薯蓣皂苷对照
品 ,用甲醇溶解 ,配成 273 mg·L-1的对照品溶液。
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分别精密吸取 0 .1 , 0.15 , 0.20 , 0.25 , 0.30 , 0.35 ,
0.40 mL 对照品溶液及0.40 mL 甲醇于 8支 10 mL
试管中 ,于70 ℃恒温水浴锅上蒸干 ,各试管再分别
加入 5%香草醛冰醋酸溶液0.20 mL 及高氯酸0.80
mL ,摇匀后置于 70 ℃恒温水浴锅中保温 15 min ,
取出迅速加入 4 mL冰醋酸摇匀 ,于 462 nm 处测定
吸光度(A)。以加甲醇为空白对照 ,以浓度(C)对吸
光度作回归 ,得方程:A=0.016 9C+0.069 7(r =
0.998),表明薯蓣皂苷在 5 ～ 20 mg·L -1范围内与吸
光度线性良好。
2.2.2　提取物中皂苷的含量测定　称取菝葜微波
辅助提取所得干燥物0.1 g , 3 份 ,加入到 25 mL 水
中超声溶解。再以 45 mL 的正丁醇萃取 3次 ,合并
正丁醇萃取液 ,回收至干 ,加入 5 mL 甲醇溶解 ,再
分别移取0.2 mL于 10 mL 试管中 ,按照“2.2.1”项
下方法测定提取物的吸光度 ,取 3份的平均值 ,根据
上述所得回归方程计算出提取物中皂苷含量 。求得
皂苷的含量为3 .02%。
2.3　样品溶液的制备　取微波辅助提取菝葜药提
取物干燥固体0 .5 g ,以 25%DMSO溶液超声溶解 ,
制成 5 g·L-1的样品溶液。再按照一定的比例稀释
成 1 ,0.2 ,0.04 g·L-1的样品溶液 ,放置 ,备用。
2.4　提取物对 CaN 活性影响的测定
2.4.1　CaN活性测定的原理　CaN 在体外能够水
解对硝基磷酸酚(p-N PP)小分子底物 ,水解后的产
物 420 nm 处有最大吸收。结合 CaN 的酶学特点及
药物与靶酶结合的相关性质 ,确定以 p-NPP 为底
物。通过测定底物水解产物的光密度 OD 值 ,确定
药物对 CaN 的活力变化的影响。一般 OD 值与酶
的活性呈正比关系。OD 值越小 ,酶活力值越弱 ,菝
葜提取物对 CaN 的活性抑制作用越强。药物对
CaN 的抑制作用公式如下:
抑制率(%)= 1-OD药+酶 -OD药对照
OD酶 ×100%
2.4.2　实验分组　(1)空白对照组:水;(2)药物对
照组:菝葜样品溶液+水;(3)酶组:酶溶液+水;(4)
实验组:菝葜样品溶液+酶溶液。
其中菝葜提取样品溶液 ,在某一浓度时 ,实验组
均设 3个平行管 ,并设 3个平行酶对照管 ,检测结果
取平均值 。实验安排见图 1 。
2.4.3　CaN 酶活性测定及结果分析　将所需洁净
试管置冰浴上 ,向每一支试管中分别加入不同浓度
的菝葜药液 10 μL 、酶溶液 10 μL 于冰浴中孵育 5
min ,然后分别依次加入测活液 180 μL , 混匀 。置
30 ℃的水浴中反应 20 min ,取出 ,立即加入终止液
1 800 μL ,于 T6型分光光度计在 420 nm 处上测定
OD值。测定不同浓度的菝葜药液对 CaN 的抑制
作用时每个浓度设 3个平行管 ,并设 3 个平行酶对
照管(以 10 μL 水代替 10 μL 药液)。分别设置菝葜
药液对照(以 10 μL 酶稀释液代替 10 μL 酶)和空白
对照(10 μL 酶稀释液+10 μL 水)。各组所得 OD
值见表 1。
图 1　实验安排
Fig 1　The arrangem ent of ex periment
表 1　菝葜提取物的对酶活性的影响结果
Tab 1　The results of S mi la x china extr actives on CaN
质量浓度
/ g·L -1
OD 值
酶 药物对照 (药+酶)均值
0 0 0.327
0.04 0.000 0.320
0.2 0.327 0.002 0.309
1 0.004 0.274
5 0.014 0.216
　　CaN 是一种丝/苏氨酸蛋白磷酸酶 , 在体外
CaN的活性测定多利用其能使像 p-N PP 这样的小
分子底物去磷酸化 。本实验采用这种方法来考察菝
葜提取物对 CaN 活性大小的影响 ,实验结果表明菝
葜提取物对 CaN 活性的抑制程度与提取物的浓度
呈正相关 , 即随着提取物浓度的增加 , 提取物对
CaN活性的抑制率呈增加趋势 ,见图 2 。
图 2　不同浓度的菝葜提取物对 CaN 抑制作用的大小
Fig 2　The inhibi ti on of dif f erent concent ration s of Sm i lax china ex-
t ractive on CaN
3　讨论
研究表明微波辅助提取应用于天然药物的提取
具有穿透力强 、选择性高 、速度快 、溶剂消耗低 、污染
小以及提取率高等优点 ,适合于多糖 、生物碱 、黄酮
和苷类等物质的提取[ 5] ,倍受天然药物研究和中药
领域科研人员的关注。
CaN通过第二信使 Ca2+和钙调素经 cAMP 通
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路调节参与机体生化和免疫应答过程。这个过程是
T 细胞活化的唯一转导通路 ,通过增加细胞内 Ca2+
的浓度来触发 T 细胞的核转录因子 。CaN 可使核
转录因子去磷酸化 ,从而使 T 细胞受体介导的细胞
因子转录和 T 细胞活化;免疫抑制药物-C sA 、
FK506与 CyP 、FKBP 结合后 ,通过阻断这一活化途
径使 T 细胞不能活化 ,从而发挥免疫抑制作用[ 4] 。
本课题组前期研究发现菝葜提取物对胸腺有抑制作
用 ,能降低 CD+3 T 、CD+4 T 细胞的水平 ,从而抑制
CD +3 T 、CD+4 T 细胞介导的迟发型超敏反应 ,减轻
佐剂性关节炎小鼠的继发性足肿胀 。本实验证明菝
葜提取物对 CaN 的活性具有一定的抑制作用 ,且随
着提取物浓度的增大 ,其抑制作用有逐渐增强的趋
势。当菝葜提取物的浓度为 5 g·L -1时 ,其对 CaN
的抑制率达到了38.23%,表明菝葜提取物中存在对
CaN 有抑制作用的某种或某些活性物质 ,但具体的
活性物质或物质群在发挥作用以及其抑制率为多大
时才能发挥最佳的药效 ,还有待进一步分析研究。
本实验为进一步研究菝葜的药理活性 、作用机制 ,寻
找新的 、不良反应小的 CaN抑制剂提供了一定的理
论基础和实验依据 。
参考文献:
[ 1] 　Sashida Y , Kubo S , Mimaki Y , et a l.Steroidal S aponins from
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Acad S ci USA , 2002 , 99(21):13522-13526.
[收稿日期] 2009-09-01
[ 作者简介] 龚小军 ,男 ,硕士 ,主治医师 ,电话:027-84840255 E-mail:gxjk ao@126.com
胰必清对大鼠急性出血坏死性胰腺炎急性肺损伤的作用
龚小军1 ,王传明1 ,黄重光1 ,潘定宇2 ,刘志苏2 　(1.武汉市第五医院普通外科 ,湖北 武汉 430050;2.武汉大学中南医
院普通外科 ,湖北 武汉 450051)
[ 摘要] 　目的:研究胰必清(YBQ)对大鼠急性出血坏死性胰腺炎急性肺损伤(AHNP-ALI)的治疗效果及其机制。方法:96 只
SD 大鼠随机分为 4 组:A 组(假手术对照组)、B 组(AHNP)、C 组(AHNP+YBQ)、D组(善宁治疗组),开腹胰胆管注入 5%牛
磺胆酸钠法建立大鼠 AHNP 模型 , 分别于术后 3 , 6 , 12 , 24 h 处死大鼠 , RT-PCR 方法检测支气管灌洗液肺泡巨噬细胞中
TLR4、Caspase-1mRNA 表达水平的变化 , 肺组织病理检查行病理学评分。结果:C 组 、D 组 3 h 支气管肺泡灌洗液(BALF)中
PAMs 内 TLR4mRNA 、Caspa se-lmRNA 逐渐回落 ,与 B 组比较 , 差异有显著性(P<0.05)。结论:中药胰必清通过抑制大鼠
肺泡巨噬细胞 T LR4 、Caspase-1mRNA 的表达 , 而达到改善 AHNP-ALI的目的。
[ 关键词] 　胰必清;急性出血坏死性胰腺炎;急性肺损伤;肺泡巨噬细胞;TOLL 样受体 4;白细胞介素 1β 转化酶
[中图分类号] R969　　[ 文献标识码] A　　[ 文章编号] 1001-5213(2010)09-0740-04
Effect of Chinese medicine Yibiqing on rat s acute lung injury induced by acute hemorrhagic ne-
crotizing pancreatitis
GONG Xiao-jun ,WANG Chuan-ming , HUANG Chong-guang , Pan Ding-yu , LIU Zhi-su(Depar tment o f Gene r-
al Surge ry , The 5th H ospital of Wuhan , Hubei Wuhan 430015 , China;2.Depa rtment o f Gene ral Surg ery , .Zhongnang Hospital ,
Wuhan Unive rsity ,H ubei Wuhan 430051 , Chian)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To study the mechanism and effect of Chinese medicine Yibiqing on rat s acute hemo rrhagic necr o-
tizing pancrea titis-acute lung injury (AHNP-ALI).METHODS　 96 SD rats were divided into 4 g roups randomly:sham ope ra-
ted contro ls(n=24);AHNP model(n=24);AHNP+Yibiqing decoction(n=24)g roup and sandostatin gr oup(n=24), AHNP
model w as induced by intr a-ductal administration of 5% sodium tauro cho late.Rever se transcriptase-polymerase chain w as ap-
plied to de tect the expression of TLR4mRNA and caspase-1mRNA in pulmonary alv eola r macrophages of broncho-alveolar lav-
age on various hours (3 , 6 , 12 , 24 h)after the model established.The deg ree o f injury in the lung was judged by the patholo gic
sco re of the lung.RESULTS　The g radually fall of TLR4mRNA 、caspa sel mRNA expre ssion of BALF- PAMs in YBQ g roup 、
SS g roup , compa red to the AHNP g roup , have a significant statistical diffe rence(P<0.05).CONCLUSION　YBQ could reduce
·740· 中国医院药学杂志 2010年第 30卷第 9期 Chin H osp Pharm J , 2010 May , Vol 30 , No.09