全 文 ：北方药学 2016年第 13卷第 1期
大瓣铁线莲的粗提物体外抗癌活性研究△
苏 琨1 代金华2 白小荣1（1.内蒙古科技大学包头医学院 包头 014040；2.内蒙古集宁师范学院数学系 集宁 012000）
摘要：目的：研究大瓣铁线莲的四种粗提物体外抗癌活性。方法：针对人肝癌细胞 HepG2，采用 MTT比色法，检测 4种不同溶剂的粗
提物做体外抗癌活性研究，计算肿瘤细胞增殖抑制率和 IC50。结果：除乙酸乙酯粗提物外，石油醚、水、正丁醇粗提物的吸光度 A与
阴性对照组比较有显著差异，剂量和药效存在一定相关性。结论；蒙药大瓣铁线莲石油醚、水、正丁醇粗提物对人肝癌细胞 HepG2
有一定抑制作用，有必要对其活性成分进行筛选和分离。
关键词：大瓣铁线莲 粗提物 MTT比色法 体外抗癌活性
中图分类号：R927.1 文献标识码：B 文章编号：1672-8351（2016）01-0099-02
大瓣铁线莲，毛茛科铁线莲属，学名 Clematis macropetala
Ledeb．主要分布于东北、西北、河北、山西等地区，生于山地林
下、林缘草甸[1]。大瓣铁线莲的药材基原为大瓣铁线莲的地上部
分，收载于《中华本草》（蒙药卷）、《中华医学百科全书》（蒙医分
卷）、《无误蒙药鉴》和《内蒙古植物药志》等著作，主治肝热、肺
热、肠刺痛、热泻，有理胃火、助消化、祛解痞的功效。经查阅文
献发现，大瓣铁线莲的药理研究鲜有报道。利用 MTT比色法对
大瓣铁线莲的四种粗提物体外抗癌活性筛选，为大瓣铁线莲的
合理应用和开发提供科学依据，丰富民族医药现代化研究的科
学内涵。
1 仪器与材料
CO2细胞培养箱，日本 SANYO SHEL LAB；酶标仪，Thermo
Scientific Multiskan FC酶标仪。
人肝癌细胞株 HepG2引自中国科学院上海细胞生物研究
所细胞库；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购自美国
Gibco公司；四季青胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。
PBS，DMSO和青链霉素均购自海克隆生物化学制品（北京）有限
公司。噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO），购自美国 Sigma公
司；去离子水，正丁醇、乙酸乙酯、石油醚均为分析纯。
大瓣铁线莲药材为 2014年 7月采于包头市九峰山，经包头
医学院教授李旻辉鉴定为毛茛科铁线莲属大瓣铁线莲（Clematis
macropetala Ledeb.）
2 方 法
2.1 粗提物的提取：大瓣铁线莲地上部分自然阴干后，取其 15
倍质量的工业酒精回流提取 4次，每次 3h。合并提取液并回收
溶剂至膏状。浸膏依次用 8倍质量的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、
水萃取 3次，合并相同提取液并回收溶剂，得 4种溶剂的粗提物
P（石油醚粗提物）、E（乙酸乙酯粗提物）、B（正丁醇粗提物）、W
（水粗提物），置于低温冰箱保存。使用前用杜尔伯科改良伊格
尔高糖培养基（即 DMEM高糖培养基）稀释到所需浓度。
2.2细胞培养：在 5% CO2、37℃条件下，用含 10%胎牛血清的
DMEM 高糖培养基培养人肝癌细胞 HepG2，2d 传代或换液 1
次，取对数生长期细胞进行后续实验。
2.3体外抗肝癌活性成分筛选：取对数生长期的 HepG2细胞，调
节细胞密度为 5×104mL-1，接种于 96孔培养板，每孔 100μL。培
养过夜后，阴性对照组加入 100μL培养基，给药组分别加入终
浓度为 0.0625、0.125、0.25、0.5、1mg·mL-1铁线莲粗提物；阳性对
照组加入不同浓度的顺铂（0.001、0.005、0.01、0.02、0.03mg·mL-1），
另设调零组（不加细胞及药物），每组设 5个复孔，培养 24h后，
弃去含药培养基，每孔加入 100μL无血清培养基及 20μL MTT
（5mg·mL-1）。在 5% CO2、37℃条件下培养 4h后，吸去培养基和
MTT，每孔加入 150μL DMSO，在低速摇床上震荡 10min，在酶标
仪上 492nm波长处测定各组吸光度（A值）。
3 结 果
3.1 4种粗提物的吸光度 A值测定：在 5种不同浓度下测定吸光
度 A，结果见表 1。表中的数据均为减去空白的吸光度 A，每组
数据测定 5次，用平均值±SD表示。
表 1 不同溶剂、不同浓度粗提物的吸光度 A
注：对于阴性对照组，*表示 P<0.05，**表示 P<0.01。
3.2不同浓度粗提物的 HepG2肿瘤细胞增殖抑制率计算：根据
公式计算细胞增殖率:细胞增殖抑制率（%）=（1-加药孔平均 A
值/阴性对照孔平均 A值）×100%。A值为每组各复孔的均值，结
果见表 2。
表 2 不同浓度粗提物的 HepG2肿瘤细胞增殖抑制率
注：负号表示对肿瘤细胞有促进作用。
3.3剂量和药效关系：以抑制率为 Y轴，浓度为 X轴，作剂量和
药效曲线图，见图 1。
图 1 四种粗提物的剂量和药效关系
浓度
mg·mL-1 P的吸光度 B的吸光度 E的吸光度 W的吸光度
0.0625
0.1
0.125
0.2
0.25
0.4
0.5
0.6
0.8
1.0
1.6
0.4826±0.0094**
0.4319±0.0068
0.3848±0.0231*
0.2381±0.0381**
0.1239±0.0174**
0.5502±0.0415**
0.5494±0.0300**
0.4286±0.0136**
0.2608±0.0001*
0.0715±0.0417*
0.5441±0.0236**
0.4944±0.0352**
0.5390±0.1145**
0.5034±0.0010**
0.9538±0.0165**
0.4406 ±0.0106
0.4563±0.0369*
0.3858±0.0197
0.2064±0.0342**
0.1517±0.0273**
浓度
mg·mL-1
P的抑制率
%
E的抑制率
%
B的抑制率
%
W的抑制率
%
0.0625
0.1
0.125
0.2
0.25
0.4
0.5
0.6
0.8
1.0
1.6
2.56
12.79
22.31
51.93
74.99
-3.59
5.86
-2.63
4.15
-81.59
-4.75
-4.60
18.40
50.34
86.39
9.12
5.87
20.42
57.42
68.71
99
北方药学 2016年第 13卷第 1期
一种脱细胞真皮基质（ADM）制备方法的实验研究△
王志远 王富生 朱伟东（深圳市龙岗区第二人民医院烧伤整形外科 深圳 518112）
摘要：目的：优化实验条件，建立提取脱细胞真皮基质的可靠方法。方法：选择 20例包皮环切术后切除包皮为研究材料，用胰蛋白
酶的消化方式、高渗盐水分离皮肤表皮，用去垢剂法和胰蛋白酶去除真皮细胞成分，用组织病理学，抗原性和生物原性观察制备后
细胞真皮基质进行鉴定。结果：20例同种异体真皮在组织学、抗原性及生物原性体征方面符合真皮基质的特性。结论：用酶消化法
分离皮肤表皮，用酶消化法祛除真皮细胞成分，方法可靠，操作简单，制备脱细胞基质，符合真皮基质的特征，制成的真皮基质真皮
基底膜完整，抗原性小，是理想的组织修复材料。
关键词：脱细胞真皮基质 生物敷料 组织修复 同种异体真皮
中图分类号：R622 文献标识码：B 文章编号：1672-8351（2016）01-0100-02
大面积深度烧伤需进行皮肤移植修复创面，自体皮源缺乏
是治疗大面积烧伤难点，故研究真皮替代物具有重要意义，脱细
胞真皮基质（ADM）是近几年国外兴起的一种真皮替代物，是利
用特定的方法将皮肤中的细胞成分去除，仅保留真皮中含胶原
网架的细胞外基质。根据制备材料的来源分为同种异体真皮基
质（Alloderm）与异种真皮基质（Xenoderm）两种。作为真皮替代
物治疗全层皮肤缺损的效价在于它的低抗原性、快速血管化和
作为表皮载体或支架的稳定性，这些特性很大程度上取决于
ADM的最终成分。如今 ADM的应用已远远超出作为单纯真皮
替代物的范围，广泛应用于烧伤与整形科等领域。本课题为深
圳市龙岗区科技局立项课题（YL2013164），着重研究酶消化法、
高渗盐法、酶溶解法、去垢剂法进行 ADM的实验室制备。
1 材料和方法
1.1一般资料：本实验所用 20例整形外科切除废弃包皮组织，研
究材料均来自本院整形外科门诊和住院病例，所取包皮组织为
手术整形切除组织，标本取材前说明目的并征得同意，患者术
前检查排除传染性疾病和慢性疾病。包皮组织均来自成年男性，
年龄 18～38岁，病程 18～38年。
1.2标本处理：切取过长包皮组织放置在无菌袋中，4℃冰箱保
存，术后环形远端包皮从一侧切口展开，形成平面，用剪刀修剪
展开包皮，剪除残留皮下组织、毛囊等皮肤附属组织备用。
1.3制备过程
1.3.1表皮和真皮层分离的方法：采用酶消化和高渗盐水分离法
分离表皮和真皮。酶消化法用的消化酶选择 0.25%胰蛋白酶液
200mL，放置实验包皮，置 4℃冰箱 24h，组织切片染色观察。高
渗盐水分离法是将标本浸泡于 1mmol/L氯化钠 200mL溶液中，
相同放置条件，利用高渗的原理，使锚着细丝与表皮基底细胞的
半桥粒分离,从而完整地去除表皮，24h后组织染色切片观察。
1.3.2 去除真皮中细胞成分的方法
1.3.2.1 去垢剂法：去垢剂是一类可溶于水的脂类，它有亲水部
分和疏水部分，能裂解脂膜，溶解抗原，清除免疫复合物。本课
题选择十二烷基硫酸钠为去垢剂，其在溶液中的稳定性高，不易
受强电解质如无机盐等的影响，能与生物膜中的磷脂等脂质结
合形成复合物；同时十二烷基硫酸钠中的疏水端也能和膜蛋白
结合破坏生物膜,从而使细胞溶解。该法脱除细胞彻底，但同时
对基底膜结构破坏大不利于上皮细胞的黏附生长。
1.3.2.2 生物酶法：采用胰蛋白酶作为脱细胞剂，本课题选择
0.25%胰蛋白酶，在此基础上研究联合使用，观察是否能缩短制
作脱细胞基质时间，是否更能促进真皮基质的无细胞化、保留更
多的基底膜和降低抗原性。
1.4 ADM的鉴定：在物理性质，组织学观察，抗原性和生物原性
观测，制备 ADM进行临床预实验，为今后临床应用打下基础。
3.4不同溶剂的粗提物的 IC50：采用 SPSS19.0统计学软件，采用
logit模式进行 probit分析并计算 IC50。
表 3 四种粗提物的 IC50
4 结论与讨论
关于半数抑制浓度 IC50的计算方法有很多，如线性回归法[2]，
或者利用 SAS、Origin等专业软件绘制曲线方程后，再计算出
IC50[3～6]。由实验数据可知，抑制率和药物浓度不是严格的线性关
系，用线性回归计算得到的 IC50存在较大误差。本实验利用
SPSS软件，录入浓度、抑制率、总值（数值=1）三组相关数据，采
用 logit模式进行 probit分析，由软件计算得到 IC50值（概率为
0.50对应的浓度值）。该方法对实验数据的契合度高，分析结果
更准确。
除乙酸乙酯粗提物外，石油醚粗提物 P、正丁醇粗提物 B和
水粗提物W的 IC50依次为 0.797、0.543、1.031mg·mL-1。虽然三
者的 IC50均大于阳性组（阳性组顺铂的 IC50为 0.04mg·mL-1），但
剂量和药效关系都具有明显正相关性，说明三种提取物存在一
定的抗癌活性。在今后对大瓣铁线莲抗癌作用深入研究时，可
以优先选择正丁醇作为溶剂，提取、分离出抗癌活性更高的单体
化合物。
参考文献
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△基金项目：内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZY13250）。
P E B W
IC50
mg·mL-1 0.797 -0.184 0.543 1.031
100