全 文 ：遗 传 学 报 , 2 7 ( 7 ) : 6 2 1一 6 2 7 , 200 0
A e t a G e n e万e a iS n i e a
大赖草总 D N A 转化小麦的分子证据
缪 军 , 赵 民安 , 李维琪
(中国科学院新疆化学所 , 乌鲁木齐 83 0 01 1)
摘要 : 用 来 自大麦基 因 组的 4 个高度重复序 列克隆 了 p vH 71 61 、 p H v7 17 9 、 p vH 71 91 和
p vH 72 93
, 经地高辛和同位素 2 种方法标记后作为探针 , 对新疆大赖草 (供体 ) 、 春麦 7 6 1 (受体 )
以及用大赖草总 1〕N A 通过花粉管通道转化成功的大穗转化株基因组在高度严谨条件下进行
了分子杂交 。 结果表明 , 这 4 个探针可以探查出基因组内一种具有主串联重复单位的散在重
复序列 。 比较受体 、 供体和转化株的杂交图谱 , 发现在转化株中出现 了受体没有而供体具有的
带 。 把上述经 pvH 7 179 探针探查 出的在供体 (大赖草 )和转化株中共有 的 iH n d 班片段进行克
隆 , 将大赖草片段克隆命名为 p L 9R 80 。 经与上述 4 种大麦重复序列杂交证明 p L 9R 80 包含了 4
种大麦重复序列的同源序列 。 用大赖草 D N A 克隆 p L 9R 80 对供体大赖草 、 受体春麦 7 61 和转
化株大穗小麦的基因组进行了分子杂交 , 结果表明 p L 9R 80 在大赖草和小麦的基因组间是同
源的 , 并且再次探查出了供体大赖草与转化株大穗小麦共有而 受体没有的带 。 说明 pL 9R 80
为大赖草总 D N A 通过花粉管通道法转化小麦的相关 1〕N A 片段 。 这为总 1) NA 导人提供了直
接的分子证据 。 这个转化片段已 经过分离克隆 , 可用于进一步的研究 。
关键词 : 小麦 ; 大赖草 ; 重复 D N A 序列 ; R F L P ; 分子标记 ; 克隆
中图分类号 : 0 7 5 文献标识码 : A 文章编号 : 03 7 9一引 72 (2 0 00 ) 0 7书 6 2 1书7
198 9 年新疆农科 院和中科院新疆化学所合作用新疆大赖草 (五岁m us r a c e m ou se 、 )总
D N A 通过花粉管通道转化栽培春麦 7 61 , 19 9 2 年 几代出现了大穗 、 多粒 、 高蛋 白、 抗病的
优 良种质 1[] , 以后经多年 自交 ,遗传已趋于稳定 。
花粉管通道法遗传转化虽然已被认为是一个有应用价值的育种途径 , 而且 已广泛在
稻 、 麦 、 棉 、 豆 、 牧草和花卉上得到了应用 2[] 。 但由于其导人片段的 “ 身份 ” 不明 、 重复性差及
无法用 已知基 因探针探查等原因 , 在学术界一直有人对其持有异议 。 导人片段的分离和
识别一直没有进行 , 也不可能进行 2l[ 。 导人的成功只能根据子代性状进行判断 。
以前人们注意过重复序列 。 中科院上海生化所与中国农科院作物所用受体的重复序
列带上卡那霉素抗性基 因导人棉花 、 水稻 , 在筛选的子代中出现了明显高于受体的卡那霉
素耐性 , 并用分子杂交方法证实了卡那霉素抗性基因的存在 2[] . 曾以 申等用中国农业科学
院祖德明培育的高粱稻为对象 , 证明重复序列在高粱稻与母本水稻之间出现了差异 , 沈建
华研究其基因组结构 , 发现高粱稻中比较显著的结构差别出现在中度重复序列部分 3[] 。
收稿日期 : 19 9 9一 9一 18 ; 修订 日期 : 20 0 0一 2一 14
作者简介 : 缪军 , ( 1 968 ) , 男 , 硕士 , 助理研究员 , 研究方向: 生物化学和分子生物学
62 2 遗 传 学 报 27 卷
王斌等用 R A P D方法证实了在用野生大豆总 D N A 导人后 , 变异株中出现了多点 PC R
扩增产物的差异 , 这种方法为验证总 D N A 的导入引人了 1个新的方法 4[] 。
在用大赖草总 D N A 导人小麦出现了多个性状的变异后 , 刘云英等曾经用醇溶蛋白聚
丙烯酞胺 电泳法证实了转化株中有 l 条与大赖草醇溶蛋白有相同迁移率的带 f1] 。 赵 民安
等用大赖草总 D N A 酶解 片段做探针探查大赖草 、 春麦 7 61 及转化株基 因组 , 证 明探针与
受体杂交呈弱 阳性 ; 与大赖草杂交呈极强阳性 ; 与转化株杂交呈阳性 , 也就是说受体经大
赖草总 D N A 转化后与大赖草 D N A 的杂交率明显提高 。 赵民安等还用 RA PD 方法发现在
16 0 个随机引物中约有 20 % 引物在转化株及受体间出现多态性 (未发表资料 ) 。
然而 , 以上所有工作虽然能从一个方面证明转化株基因组确实发生了变化 , 但仍然无
法说 明是什么样的供体片段进人 了转化株 , 更无法说明供体片段在遗传转化中起了什么
作用 。
最近 10 年来人们发现利用重复序列 , 特别是散在重复序列探针鉴定远缘杂交中的异
源 D N A 物质是十分有效的 5[] 。 当前 , 在植物的系统发生遗传进化方面的工作都 已系统地
研究了黑麦 、 小麦 、 大麦中的高度重复序列 , 研究出了一批种属特异性及属间共性的探针 。
ve sr hi 山 n 从大麦 ( .H 、 u仓。 r 。 )制作了一批探针 , 研究了这批高重序列探针的种属特异性 、
拷贝数 、 在基 因组中的组织状况 , 分析了几个探针的初级结构 (序列 ) , 并尝试使用它们对
栽培及野生的大麦进行分类 6[] 。 以后 , S vi ast h ve 和 V e sr 址 in n 合作用这几个探针研究了大
麦属中 31 个种 ( 4 6 个分类群 )的系统发生 , 成功地区分了含有不 同倍性的 X 、 Y 、 I 、 H 基因
组的物种 v[J 。 vS iast h ve 等 人又用其 中 4 个探针将世界各地采集的 28 种赖草进行分析 , 同
样区分出了含有不 同倍性的 W 、 S 、 H 、 Y 基因组的物种 8[] 。
根据 V e sr 瓦 in n 的工作 , 探针 p H v 7 1 6 1 、 p H v 7 1 7 9 、 p枷 7 一9 1和 p H v 7 2 9 3 是在大麦中广
泛存在 、 在小麦中有 同源性 、 在赖草中也可 以杂交 的应属于在属间有共性的探针 。 因此 ,
我们用这 4 个探针对大赖草 、 小麦及转化株的基因组进行了探查 。
根据 4 个大麦重复序列的研究结果 , 我们进一步克隆了供体大赖草和转化株大穗小
麦共有而与受体不同的带 , 得到了一大赖草 阳性克隆 , 以这一克隆的大赖草片段作为探针
对大赖草 、 小麦及转化株大穗小麦的基因组进行了更深一步的探查 。
1 材料和方法
1
.
1 材料
供体大赖草 , 受体春麦 76 ! , 转化株大穗小麦 。
】. 2 方法
1
.
2
.
1 大麦 重 复顺 序 片段 的制 备 4 个 重 复 D N A 序 列 克 隆 p H v7 16 1 、 p H v7 17 9 、
pH v7 1 91 和 pvH 7 2 9 3 由瑞 典 人 5 . s vi ast hve 赠送 。 用 氯 化钙 法制 备感 受 态大 肠 杆菌
D H 5 a
, 并用上述质粒进行转化 , 经四环素筛选抗性菌 , 并大量培养 , 经碱法提取质粒 9[] , 用
sP lt 酶解质粒 , 经琼脂糖 电泳后回收 D N A 片段 。
1
.
.2 2 植物材料 D N A 的提取 提取程序按文献 l[ 0] 方法略有修改 。 取 g5 叶片 ,在液氮
中研 磨成 细 粉 , 加 人经 60 ℃ 水浴 保温 过 的 25 m l 提取 液 【42 % 尿 素 , 0 . 35 m ol / L aN O ,
S Om m o l / L T ir s一 C I , 2 5m m o l / L E l) T A , 5% (V / V )重蒸酚 ]中 , 加人 1 . s m l 的 10% SDS , 保温
15m i n
, 再加人 15m l 氯仿 /异戊醇 ( 2 4 : l ) , 保温 15m i n , 于 6 0 0 0 r / m i n离心 10m i n , 上清液转
7期 缪 军等 :大赖草总 1) N A转化小麦的分子证据 623
移至新管 , 加人等体积异丙醇沉淀 D N A , 用玻璃棒绕出 D N A 沉淀 , 用 70 % 乙醇洗 2 次 , 真
空抽干 , 加人 4m l T E , 于 6 0 ℃溶解 ( l一 Zh ) , 加人 10户1 R N a s e ( 10m g / m l )继续于 6 0 0C 保温
10 m in
, 再用 2 倍体积无水乙醇沉淀 1次 ,溶于 T E , 分装并于 一 20 ℃保存 。
1
.
.2 3 植 物总 D N A 的酶 切 、 电泳 、 转膜 所选用 的限制性 内切酶 有 : 凡 a ! 、 撇。 I 、
vA
“ n
、
gB l n
、
iH dn m
、
aB m H I 和 刀。 I 等 。 电泳分部 : 将 D N A 从凝胶转移至尼龙膜按文
献 【91 方法进行 。
1
.
.2 4 地高辛标记及杂交过程 标记及杂交过程按 B co ihr gn er M an hn ie m 地高辛试剂
盒实验手册提供的程序进行 。
1
.
2
.
5 同位素标记及杂交过程 按文献 【9] 方法进行 。
1
.
.2 6 大赖草 目的片段 的回收 在 去打刀 d班所切大赖草 、 春麦 7 61 、 转化株大穗小麦的电
泳胶中切下 目的片段所在的胶条 , 从中回收 目的片段 。
1
.
.2 7 连接反应 用 iH n d 川切载体质粒 p U 1C 8 . 在小管里加水 .5 5川 、 载体 1川、 目的片
段 2川 , 45 ℃ 水浴保 温 10 而 n , 转人 冰浴 , 再 加连接缓 冲液 l川 , 4T 连接酶 0 . 5川 , 总体 积
10尸l , 于 16 oC 保温 6 h , 再置 4℃冰箱过夜 。
1
.
.2 8 重组 D N A 的转化 、 筛选和鉴定 按文献 9[ ]方法进行 。
1
.
.2 9 大赖草克隆 p L 9R 80 作为探针的杂交实验 p L 9R 80 的同位素标记及杂交方法同
前述 。
2 结果
2
.
1 4 个大麦重复序列的探查结果 (主要以 p vH 7 1 61 和 p H v7 179 的探查结果来说明 )
来 自大麦基 因组的重复 D N A 序列克隆 p H v7 161 和 p H v7 1 79 与小麦基 因组的杂交
呈 主带加弥散的带型 , 说明它们在小麦基 因组中以主带型 串联重复为主也有散在分布 ,
可作为分子标志探查小麦基 因组的变化 。 其 中 p H v7 1 61 同小麦基 因组 的杂交谱带较丰
富 , 杂交主带 较多 , 在不 同的酶切 中 , 少则 3 条 , 多则 十几条 ; 而 p H v7 179 的杂交主带则
较少 , 一般都是 1一 3 条杂交带 。 这种分布与这 4 种探针在大麦 中分布相类 似 , p H v7 1 61
广泛分布在大麦各条染色体及染色体的多个位置 , p H v7 1 79 大多分布在大麦染色体的
一端 [ 7} 。
在 多种 酶和 探针 的组合 中 , 我们发现 转化株 与受体 之 间有 不少 差异 带 , 例 如在
月v a n 一p H v 7 16 1 (图 l , a )组合 中 , 大穗小麦 比春麦 7 6 1 多了 l 条长约 7 0 0 b p 的杂交带 。 在
注v a l 一 pvH 7 17 9 (图 l , b )组合 中 , 大穗小 麦 比春 麦 7 6 1 多 l 条 长约 3o o b p 的差异带 , 在
加m H I 与 p H v 7 1 7 9 和 p H v 7 16 1组合中 , 大穗小麦都有 2 条杂交带 ( 2 . s k b 和 l . 4 k b ) , 而春
麦 7 61 都是 1条长约 3 . 6 k b 的杂交带 。 似乎春麦 7 61 经大赖草总 D N A 转化后在这条带间
多 了一 个 aB m H ! 酶切 位点 , 并且 长度有所增 加 。 在 兔 Z n 、 刀动 d 班、 aB m H I 等 酶切与
p Hv7 1 79 或 p H v 7 161 杂交 中 , 春麦 7 61 都存 在 1条长 约 3 . 6kb 的带 , 而大穗小 麦都存在
3
.
g k b 的带 (在 aB m H ! 中两条 2 . s k b 和 1 . 4 k b 杂交带长度之和也是 3 . g k b) , 说明酶切位点
多集中在重复序列的两端 。 从以上结果可见 , 大穗小麦同春麦 7 61 之间确实存在着差异 ,
并且这些差异可被高重序列所探查 。
把 大穗小麦 和大赖草 与各 个探针 的杂交 图谱进行 比较可见 , 在 vA 。 皿一pvH 7 17 9 ,
iH dn 班一pvH 7 1 7 9中 , 两者存在类似的杂交图谱 , 前者 3 条杂交带相同 , 后者 l 条杂交带相


6 26遗 传 学 报 2 7卷
究这一序列的组织结构特点 , 同时要进行生物活性的测试 , 尝试运用这种序列定向育种的
可能性 。
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