全 文 ：菝葜根茎中黄酮类化合物的提取与含量测定
刘世旺 ,徐艳霞
(黄冈师范学院生物系 ,湖北 黄冈 438000)
摘要:对菝葜植物根茎中黄酮类成分进行了定量测定和定性分析。结果表明 , 在菝葜植物根茎中含有黄酮 、黄酮醇 、二氢黄酮 、
二氢黄酮醇等多种黄酮类化合物。以芦丁为标准品 ,用分光光度法测得菝葜根茎中总黄酮含量为 3.36%。
关键词:菝葜;黄酮;提取;芦丁;含量测定
中图分类号:Q949.72 文献标识码:B 文章编号:1005-8141(2005)06-0481-02
Extraction and Determination of Total Flavonoids from Roots of Smilax China L.
LIU Shi-wang , XU Yan-x ia
(Bio logy Depar tment , Huanggang Normal University , Huanggang 438000)
Abstract:Flavonoids in the roots of Smilax China L w ere analy zed qualitatively.It was found tha t the roo ts of Smilax China L con-
tained flavone , flav onol , dihydroflavone and dihydroflavonol etc.To tal flavonoids content w as also determined to be 3.36% by spectropho-
tometric method using rutin as standard sample.
Key words:S milax china L;flavonoid;extraction;rutin;content determination
收稿日期:2005-10-10;修改日期:2005-10-28
基金项目:湖北省教育厅重点科研项目(项目编号:2000A47003)。
作者简介:刘世旺(1965-),男 ,湖北武汉人 ,医学硕士 , 副教授 ,
现从事生物化学和植物资源学方面的教学与科研工作。
黄酮类化合物又称黄酮体 、黄碱素 ,是在植物界中
分布最广的一类成分 。黄酮类化合物对人体具有明显
的抗溃疡 、解痉 、抗菌 、抗炎 、降血脂和镇痛等生理活性
作用[ 1] 。近年来 ,从植物中分离出来的黄酮类化合物
也显示出多种药理作用 ,如金丝桃苷有抗脑缺血 、心肌
缺血的作用;黄芩苷元 、槲皮素有抗肿瘤的作用等[ 2] 。
此外 ,黄酮类化合物还是具有开发前景的天然抗氧化
剂[ 3] 。所以 ,了解植物体内黄酮类化合物的分布和组
成对于深入开发利用中药资源具有重要意义 。
菝葜(Smilax china L .)是百合科菝葜属中的一
种多年生植物 ,在鄂东大别山地区很常见。由于该植
物地下根茎粗硬发达且形似菱角 ,所以该植物也俗称
“铁菱角” 。菝葜的根 、茎 、叶均可入药 ,其中根茎作中
药使用更为常见 。菝葜根茎具有活血化瘀 、清热利湿 、
强筋壮骨 、消肿毒 、祛风湿 、补气活血等功效[ 4] 。菝葜
根茎中含有皂甙 、黄酮 、生物碱 、氨基酸 、糖及多元酚等
多种成分[ 5] ,但针对菝葜这种植物根茎中总黄酮的提
取和含量测定的研究还未见报道。本文对菝葜根茎中
总黄酮的提取和测定方法进行了比较研究 ,对菝葜根
茎中黄酮类化合物的种类也进行了初步鉴定 。
1 仪器和材料
仪器和试剂:UV -754 紫外可见分光光度计 ,电
子天平 ,旋转蒸发仪 ,微波炉 ,索氏提取器 ,芦丁标准品
(中国药品生物制品检定所),聚酰胺 、乙醇 、石油醚(沸
程 60 ～ 90℃)、亚硝酸钠 、硝酸铝 、氢氧化钠等试剂均
为分析纯 ,蒸馏水为二次蒸馏水 。
样品材料:菝葜样品材料于 2004年 3月采自湖北
省黄冈市团风县 ,由黄冈师范学院生物系项俊副教授
鉴定。取菝葜根茎风干 ,去泥沙 ,粉碎并过 20目筛后 ,
装入塑料袋中冰箱冷藏备用 。为了避免黄酮类化合物
在烘干过程中被破坏而损失 ,备用样品材料直接用于
提取黄酮 ,但其重量值则由同批次样品材料烘干后称
重并折算而来。
2 实验方法
2.1 菝葜总黄酮的提取
提取的方法主要有:①浸提法 。精确称取备用的
菝葜根茎样品材料 10g ,加适量水浸泡 2d 后 ,微沸煎
煮 2h ,冷却并静置 24h;然后用纱布或棉花过滤 ,滤液
倒入分液漏斗中 ,再用正丁醇萃取得正丁醇萃取液 ,正
丁醇萃取液经旋转蒸发仪减压蒸发浓缩 ,除去正丁醇
即得到含黄酮类化合物的提取物;再将此提取物用
95%乙醇溶解并定容至 100ml备用。 ②微波提取法 。
精确称取备用的菝葜根茎样品材料 10g 置于烧瓶中 ,
再向瓶中加入 95%乙醇 300m l ,将此烧瓶放入微波炉
中 ,选择功率为中档 ,间歇进行微波处理(提取液温度
应控制在 60℃以下),微波处理累计时间 60min ,然后
减压浓缩提取液至 100ml备用。 ③直接索氏提取法 。
精确称取备用的菝葜根茎样品材料 10g ,用 200m 的
·481·
资源开发与市场 Resource Development &Market 2005 21(6) ·实验研究·
l95%乙醇在 80℃水浴加热条件下采用索氏回流提取
3h ,提取液减压浓缩至 100ml备用 。④复合索氏提取
法[ 6] 。精确称取备用的菝葜根茎样品材料 10g ,在水
浴加热条件下 , 先用 150ml 石油醚索氏回流提取
50min ,冷却 ,倾出石油醚 ,除去非极性杂质 。挥发掉样
品中吸附的石油醚 ,再将样品装入索氏提取器中 ,用
200ml的 95%乙醇在 80℃水浴加热条件下索氏回流
提取 3h ,得 95%乙醇提取液;将提取液减压浓缩成浆
状 ,加水溶解后置于烧杯中 ,再加入 10g 聚酰胺 ,放置
并经常振摇 , 24h 后过滤得吸附有黄酮类化合物的聚
酰胺;将聚酰胺先用蒸馏水反复冲洗 ,除去糖类 、皂甙
等水溶性杂质 ,然后用甲醇洗脱吸附在聚酰胺上的黄
酮类化合物 ,洗脱时尽量做到少量多次;合并甲醇洗脱
液并置于旋转蒸发仪中 ,减压浓缩至 100m l备用 。
2.2 菝葜总黄酮的含量测定
含量测定:①标准曲线的测定。精确称取已烘干
至恒重的芦丁标准品 12.54mg ,置于 10ml容量瓶中 ,
用95%乙醇溶解并稀释至刻度 , 摇匀。分别吸取
0.00ml、0.10ml、0.20ml、0.30ml 、0.40ml 、0.50m l标准
品溶液分别置于 10ml容量瓶中 ,接着向容量瓶中依次
加入 5.00ml 、4.90ml、4.80ml、4.70ml 、4.60ml、4.50ml
95%的乙醇 ,使各容量瓶中的溶液总体积均变成 5ml ,然
后分别加入 5%NaNO2 0.3ml ,摇匀 ,放置 6min;再分别
加入 10%Al(NO3)3 0.3ml ,摇匀 ,放置 6min;再分别加入
4%NaOH 溶液 4ml ,最后用蒸馏水分别稀释至刻度 ,以
0.00 ml为空白参照 ,分别在分光光度计上测 A510 。②
样品的含量测定。准确吸取上述不同提取方法得到的
已定容的样品提取液 0.15 ml两份 ,分别置于10ml容量
瓶中 ,并分别加 95%乙醇4.85ml ,一份使用与标准曲线
测定相同的方法显色 ,另一份直接用蒸馏水稀释至 10ml
作空白对照 ,并分别测定 A510 ,每种提取液重复测定 3
次 ,最后利用标准曲线回归方程分别计算黄酮类化合物
的含量。③加样回收率试验。吸取标准品溶液0.10ml
置于 10ml容量瓶中 ,然后再加入菝葜样品提取液(直接
索氏提取法提取)0.15ml ,再加入 95%乙醇4.75ml ,采用
与样品含量测定相同的方法显色并测定 A510 ,重复 5
次 ,最后利用标准曲线回归方程分别计算黄酮类化合物
的含量及回收率。
3 实验结果
测得不同浓度标准品溶液的吸光度值见表 1 ,由
此计算得回归方程:A=11.52＊C-0.0055 ,相关系数
R=0.9991。菝葜样品提取液总黄酮含量测定结果见
表 2 ,加样回收率试验结果见表 3。测定吸光度 A510
时 ,10ml溶液中实际加样量为 0.6294mg ,平均加样回
收率为 98.15%。
表 1 不同浓度的标准品溶液的吸光度(A510)
序号 1 2 3 4 5 6
体积(ml) 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50
浓度(mg/ml) 0.00 0.01254 0.02508 0.03762 0.05016 0.0627
吸光度 A 0 0.132 0.283 0.422 0.586 0.711
表 2 菝葜总黄酮含量的测定结果(n=3)
提取方法 平均吸光度
OD510
样品液浓度(mg/ml) 总黄酮含量(mg/ g) RSD(%)
浸提法 0.434 0.0382 25.43 1.21
微波提取法 0.454 0.0408 27.20 1.14
直接索氏提取法 0.575 0.0504 33.60 1.08
复合索氏提取法 0.484 0.0425 28.33 1.26
表 3 回收率试验结果
编号 加入总黄酮量(mg) 测得总黄酮量(mg) 回收率(%)
1 0.6294 0.6173 98.08
2 0.6294 0.6199 98.49
3 0.6294 0.6195 98.43
4 0.6294 0.6158 97.84
5 0.6294 0.6162 97.90
4 讨论
浸提法 、索氏回流提取法是从植物中提取活性成
分的传统经典方法 ,近年来又有微波技术 、超声技术的
加入 ,使植物中许多天然化合物的提取效率大为提高 ,
但由于每种植物中天然成分的组成不同 、性质各异 ,所
以不同植物 、不同成分的提取方法不尽相同 ,针对某种
植物 、某种成分的有效提取方法需要人们去探索和研
究 。本文选择了 4种常见的黄酮提取方法作对比研
究 ,结果表明 ,传统经典的浸提法虽然操作简单 ,但因
提取溶剂与样品中黄酮类化合物结合易饱和 ,故提取
效率不高且提取时间过长;复合索氏提取法由于有两
次纯化步骤 ,操作较复杂 ,同时纯化操作还可能使黄酮
类化合物流失 ,所以最终测得的总黄酮含量值偏低;微
波提取法尽管在马齿苋等植物中取得了较好的效
果[ 7] ,但我们的实验结果表明 ,微波提取法用于提取菝
葜总黄酮时效果并不理想;直接索氏提取法与其它 3
种方法相比 ,则操作简单快捷 ,提取成本低 ,黄酮提取
效率也很高 。所以 ,直接索氏提取法应是提取菝葜植
物根茎中黄酮类化合物的最有效方法 。
为了探讨菝葜总黄酮的组成和种类 ,我们对菝葜
黄酮提取物进行了常规检测试验[ 6] ,结果见表 4。
表 4 菝葜黄酮类化合物检测分析结果
反应类型 实验现象 分析结果
盐酸 -镁粉反应 试液呈现红色 可能含黄酮 、黄酮醇 、二氢黄酮 、二氢黄酮醇等黄酮类化合物
AlC l3反应
滤纸上无明显颜色变化 ,紫外灯下显鲜黄色荧光
可能不含 4′-羟基黄酮醇和 7 ,
4′-二羟基黄酮醇等黄酮类化合物
与碱反应 试液变黄色 可能含二氢黄酮 、黄酮醇等黄酮类化合物
(下转第 486页)
·482·
·实验研究· 资源开发与市场 Resou rce Development &Market 2005 21(6)
4.2 定植时间和定植密度
红阳猕猴桃是落叶果树 ,为提高成活率 ,定植时期
一般在落叶后至来年萌芽前 ,即 11月初至来年 2月下
旬定植完毕 ,分秋 、春两季定植 。秋植从开始落叶时即
可进行 ,此时空气较润 ,地温较高 ,定植后可长出新根 ,
来年立春后能迅速生长。霜冻到来之前应停止秋植 。
春植在立春前后 15d进行最佳 ,过早容易冻坏苗木 ,过
晚由于树液开始流动 ,根系和地上枝梢进入伤流期 ,成
活率不高 。伤流期到来前夕应停止春植 。红阳猕猴桃
的定植密度为株距 2m 、行距 3m , 或株距 2m 、行距
3.5m 。
4.3 定植方法
首先是开挖定植穴或定植槽。定植穴按长 、宽 、深
各 0.8 ～ 1.0m的规格挖大穴 ,或挖成长度等于行长的
大槽 ,挖好后填入 0.2m 厚的秸秆 、绿肥和杂草 ,再施
入少量腐熟的有机肥 ,如厩肥 、饼肥 、人畜粪尿等;然后
回填伴有腐熟的有机肥和磷肥的表土约 0.4m 厚;最
后填入混有有机肥和氮 、磷 、钾速效肥的底土 ,填至高
出地表 0.3m 左右 ,浇透水 ,让土壤塌实后定植。其次
是定植苗木。定植时先按预定的株行距确定苗木的栽
植点 ,再在各点视苗木根系长短挖一小坑 ,深度以放入
苗木后根颈部与地面平行为宜 。挖好小坑后要定好雄
株的位置 ,再把雌雄株分别放于定植小坑内进行定植 。
定植时要扶正苗木 ,让苗木根系舒展 ,用熟土 、细土培
在苗木根系周围 ,当土埋过根系后 ,向上提苗几次 ,使
根系与土壤密接 ,继续培土至与地面相平 ,或培成馒头
状 ,轻轻踏实 ,切忌踩踏。浇足水 ,当水下渗后 ,再覆盖
一层细土即可 。培土时不要将嫁接口埋入土中 ,要将
接口露出地面 5cm 左右 ,以防接口处发生病虫害而死
苗 。
4.4 定植后的管理
红阳猕猴桃苗木定植后 ,首先是定秆 ,即从嫁接口
以上 30 ～ 40cm 处剪断进行定秆 ,秆上要有 5 ～ 6 个芽
眼 。第二是加强定植后管理 ,主要抓好浇水 、遮阳 、施
肥和锄草四个环节 ,其中前两个环节是提高苗木成活
率的关键 ,也是建园成败的关键 。浇水以保持土壤湿
润 ,使土壤相对湿度维持在 70%～ 80%;遮阳以防止
幼苗 、幼芽 、幼叶被太阳晒伤 ,保持空气湿润 ,缩短缓苗
期 ,促进树体提早抽梢和成形 。栽后当年的幼树遮阳
度要求为 70%～ 80%。如遇夏季高温干旱要做好树
盘覆盖工作 ,以减少土壤水分蒸发 ,对幼树的遮阳可采
用间作高秆作物 ,如玉米等;定植苗成活后要结合灌水
多次适量追肥 ,每株每次施尿素 50g 或复合肥 50g ,也
可施入腐熟的人畜粪水 ,施后撒一层细土 ,以防肥水快
速蒸发 。杂草影响幼苗生长 ,应及时锄去 ,锄草以不发
生草荒草害为度 ,但树盘周围的杂草应随时清除 ,以免
与苗木争水争肥 ,但不要喷施除草剂 。第三是引蔓 ,定
植苗成活后 ,萌发抽生的直立新梢是树体将来的主蔓 ,
应精心管理 。通常在苗旁插一竹竿 ,牵引主蔓爬上竹
竿 ,用绑缚材料固定在竹竿上 ,防止主蔓折断 ,使其保
持直立姿态和旺盛的长势。不要让主蔓缠绕在竹竿
上 ,使其尽快生长至支架上 ,同时还要及时除去砧木上
的实生萌蘖 。
参考文献:
[ 1] 韩礼星 ,等.猕猴桃优质丰产栽培技术彩色图说[ M] .北京:中国农业
出版社 , 2002.
[ 2] 黄宏文 ,等.猕猴桃高效栽培[M ] .北京:金盾出版社 , 2001.
[ 3] 陈东元 ,等.猕猴桃无公害高效栽培[ M] .北京:金盾出版社 , 2004.
(上接第 482页)
表 4的结果表明 ,菝葜植物根茎中黄酮种类丰富 ,
很可能含有黄酮 、黄酮醇 、二氢黄酮 、二氢黄酮醇等种
类。菝葜植物根茎中黄酮类化合物的种类和结构还有
待进一步研究 。从实验测定得知 ,菝葜根茎中的黄酮
含量高达 3.36%,而黄酮类化合物的生理作用又多种
多样 。现已知 ,有些黄酮类化合物可以抗菌消炎 、解痉
镇痛;有些黄酮类化合物甚至可以抗瘤防癌 ,这些生理
活性作用与菝葜的药效特点非常相近 ,由此推测 ,黄酮
类化合物很可能就是菝葜植物根茎中最主要的活性成
分 ,进一步分离和鉴定这些黄酮类化合物仍有重要意
义。
参考文献:
[ 1] 谭仁祥.植物成分分析[M ] .北京:科学出版社 , 2002 , 486～ 489.
[ 2] 黄河胜 ,马传庚 ,陈志武.黄酮类化合物药理作用研究进展[ J] .中国
中药杂志 , 2000 , 25(10)∶589～ 592.
[ 3] 李槟榔.天然食用抗氧化物的研究进展[ J] .食品与发酵工业 , 1990
(4)∶74～ 87.
[ 4] 中国植物志编委会.中国植物志[ M ] .北京:科学出版社 , 1978.
[ 5] 刘虎岐 ,高锦明 ,邱明华 ,等.菝葜属的生物学和化学研究进展[ J] .天
然产物研究与开发 , 2001 , 13(1)∶90～ 93.
[ 6] 张存莉 ,马柏林 ,傅建熙 ,等.黑刺菝葜根茎中黄酮成分的分析坚定
[ J] .西北林学院学报 , 2000 , 15(1)∶57～ 59.
[ 7] 王莉 ,顾承志 ,刘志勇 ,等.新疆马齿苋中总黄酮的微波提取及含量
测定[ J] .山西中医 , 2002 , 18(1)∶50～ 51.
·486·
·实验研究· 资源开发与市场 Resou rce Development &Market 2005 21(6)