全 文 ：0 引言
碧 玉 兰 (Cymbidium lowianum) 为 兰 属
（Cymbidium）虎头兰亚属（Subgenus Cyperorchis (Br)
seth etcribb）植物，附生与地生中间类型，是云南的特
有种之一[1]。碧玉兰为总状花序，具有10~20朵或更多
的花；花苞片卵状三角形，萼片和花瓣苹果绿或黄绿
色，有红褐色纵脉，唇瓣淡黄色，中裂片上有深红色或
黄色“V”形斑，是主要观赏部位之一。株型美观，栽培
管理较为容易，可作盆栽、园林地栽或鲜切花应用。多
倍体具有器官巨大性、内含物增多和增强抗逆性等特
点，能显著提高观赏和应用价值，但目前还没有关于野
生碧玉兰多倍体诱导的相关报道。作者通过多倍体诱
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30760155，30160074）；教育部基金资助项目（Z2005-2-65008）；云南省科学基金资助项目（2009BB013）。
第一作者简介：李雪娇，女，1983年出生，云南嵩明人，硕士研究生，云南农业大学助教，从事花卉种质创新研究。通信地址：650201云南省昆明市金
黑公路云南农业大学花卉研究所，Tel：0871-5227813，E-mail：xuejiao341@126.com。
通讯作者：李枝林，男，1955年出生，云南宾川人，教授，主要从事花卉生物技术、资源利用与栽培技术研究，通信地址：650201云南省昆明市金黑公路
云南农业大学花卉研究所，Tel：0871-5227813，E-mail：lzl-yn@sohu.com。
收稿日期：2010-03-09，修回日期：2010-03-30。
野生碧玉兰多倍体诱导及鉴定
李雪娇，李枝林，黄丽萍
（云南农业大学花卉研究所，昆明 650201）
摘 要：研究旨在培育云南野生碧玉兰新种质，丰富兰花种质资源。以云南野生碧玉兰种子无菌萌发的
试管苗为材料，采用浸泡法，在无菌条件下用不同浓度的秋水仙素溶液对碧玉兰丛生芽进行多倍体诱
导，结果表明：以0.04%的秋水仙素处理72 h效果最好，诱导变异率达60%，死亡率为30%，变异试管苗
形态上表现为叶片变宽、叶色加深、叶面粗糙、部分叶尖开叉并有双脉、植株矮壮，且生长缓慢；经细胞学
检测，二倍体碧玉兰染色体数目为40（2n=2x=40），变异苗染色体数目大部分为80（2n=4x=80）；四倍体叶
表皮气孔变大，单位面积内气孔数明显减少；通过RAPD分析，结果显示二倍体和四倍体在带型上存在
差异。
关键词：碧玉兰；多倍体诱导；秋水仙素
中图分类号：S682.31 文献标志码：A 论文编号：2010-0665
Induction and Identification of Polyploids in Wild Cymbidium lowianum
Li Xuejiao, Li Zhilin, Huang Lipin
(Flower Research Institute, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201)
Abstract: In order to create new germplasm, the germplasm of wild Cymbidium lowianum in Yunnan was
studied, according to tissue culture; seedlings were treated with different concentrations of colchicines solution
at different stages in order to figure out the best inducing method and obtain tetraploids. Results showed that,
using 0.04% colchicines solution 72 hours could obtain the inducing ratio to 60% and the death ratio is 30%,
the variant plants showed stems became more dwarf and stronger, the leaves became wider and greener, some
leaves could be seen the splits and double leaf vein infrequently, and the plant grow slowly. The chromosome
number of diploid Cymbidium lowianum was 40(2n=2x=40), most of polyploid chromosome’s number was 80
(2n=4x=80), the size of stoma on the leaf lower epidermis of the polyploid was larger than that of the diploid’s.
Besides, the number of stoma per unit leaf area of polyploidy leaf reduced distinctly. The molecular marker
RAPD display that there were some differences between diploid and polyploid plants.
Key words: Cymbidium lowianum; polyploid induction; colchicines
中国农学通报 2010,26(13):261-266
Chinese Agricultural Science Bulletin
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导结合组织培养的方式创造了新种质，期望对碧玉兰
多倍体育种提供科学依据和技术基础。
1 材料与方法
1.1 试验时间及地点
2009年 7月 18日于云南农业大学花卉研究所实
验室进行试验。
1.2 材料
选用采自云南临沧地区的野生碧玉兰成熟果实，
在种子无菌萌发和组培快繁的基础上，利用前期研究
培养出的种子无菌萌发试管苗进行多倍体诱导。
1.3 方法
1.3.1 多倍体的诱导 配制 0.00%、0.01%、0.04%、
0.08%、0.12%、0.15% 6个浓度的秋水仙素灭菌溶液，
在无菌条件下取丛生芽，浸泡于无菌秋水仙素溶液中，
振荡培养24、36、48、72 h后用无菌水冲洗4~5次，滤干
水分，转入 1/2MS+2.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+8%
香蕉泥培养基上(pH 5.8)，于（25±2）℃光照培养，定期
观察并统计生长情况及死亡率，60天后得变异株，即
可统计相关数据和进行倍性检测。
1.3.2 多倍体的鉴定 用形态学观察、气孔鉴定，染色体
鉴定、RAPD分析4种方法鉴定诱导材料[2-9]。
（1）形态学观察。根据多倍体植株较二倍体植株
呈现出的在叶形、叶色、株形、株色、生长势上的差别，
对变异植株进行初选。在试管内对碧玉兰叶片的长与
宽进行测量，各检测20株。
（2）染色体鉴定。根据兰科植物根系具有较粗的
髓部组织和轻微木质化的特点，采用以下制片方案：
取材时间和取材部位：取材时间选择早上 9:00~
10:00，取材部位为植株健壮根系。
预处理液的选择：选择0.1%的秋水仙素作为预处
理液，于室温下预处理 4 h左右，用蒸馏水洗涤 3~5次
后转入Carony’s液（乙醇:乙酸=3:1）中，置冰箱内固定
8 h[10]。
（3）压片：将固定好的根系取出后放入 1 mol/L的
HCl于60℃水浴锅中水解6 min[11]，再将解离好的根尖
用蒸馏水清洗3~5次后，采用常规压片法制片。
（4）镜检：将做好的切片放于B203 LED型双目生
物显微镜下观察染色体分散情况，记录并摄像。
1.3.3 气孔鉴定 气孔大小与植株倍性成正相关，气孔
密度与植株倍性成负相关，通过观察植株叶片下表皮
气孔大小和气孔面积等作进一步鉴定。
1.3.4 RAPD分析 将二倍体碧玉兰和四倍体碧玉兰植
株进行RAPD分析检测二者的差异性。DNA提取方
法采用常规的植物基因组DNA CTAB微量提取法[12]。
用琼脂糖凝胶电泳估算样品DNA浓度。并参照范成
明 [13]在进行兰花RAPD分析中所筛选的引物,最终选
出 12条引物作为初选引物备用。PCR扩增产物用
0.5×TBE配制2%琼脂糖凝胶进行电泳，在每个样品中
加入凝胶上样缓冲液 8 μL，用 1.5%琼脂糖凝胶，每个
泳道上样10 μL。电泳缓冲液为×0.5TBE，设定恒定电
压 150 V，电泳时间 150 min。放入EB染液中染色 30
min后用自来水冲洗凝胶1 min，置于凝胶成像系统中
观察、拍照。
2 结果与分析
2.1 不同处理时间和秋水仙素浓度对碧玉兰死亡率和
诱变率的影响
以秋水仙素诱导35天后幼苗停止生长，最后逐渐
死亡为统计死亡率的标准；以气孔增大为其变异指标
的标准。从表 1所示结果可以看出：随着秋水仙素浓
度和处理时间的增加，幼苗的死亡率逐渐增高，由此可
看出，不同浓度的秋水仙素对碧玉兰幼苗都有较强的
毒害作用，同时，实验所设计的 5个秋水仙素浓度和 4
个处理时间，都能不同程度的诱导出碧玉兰多倍体，一
般情况下，高浓度的秋水仙素和长时间的处理更容易
获得变异苗，而通过对试验结果的分析，当浓度超过
0.04%时，死亡率逐渐升高,变异率却有降低的趋势，这
可能与碧玉兰本身的生理特性有关，当秋水仙素浓度
达0.15%，处理72 h时，死亡率最高，为65%，变异率却
只为47.5%。试验目的在于筛选出最适合的处理浓度
和处理时间，故从总体情况来看，用0.04%的秋水仙素
处理72 h，能获得较高的变异率和较低的死亡率，分别
为60%和30%，诱导效果较好。
2.2 多倍体鉴定
2.2.1 形态学观察 从外观形态看，二倍体植株和变异
0.00
24
36
48
72
40
40
40
40
0
3
6
7
0
7.5
15
17.5
0
0
0
0
0
0
0
0
浓度/% 时间/h 处理苗数 死亡数 死亡率/% 变异苗数 变异率/%
表1 不同处理时间和秋水仙素浓度的诱变结果
·· 262
0.01
0.04
0.08
0.12
0.15
24
36
48
72
24
36
48
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24
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72
24
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24
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40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
2
12
18
19
4
12
20
12
7
13
15
20
8
12
14
10
11
18
20
26
5
30
45
47.5
10
30
50
30
17.5
32.5
37.5
50
20
30
35
25
27.5
45
50
65
6
11
6
7
4
15
17
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11
12
20
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15
7
10
22
6
15
13
19
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27.5
15
17.5
10
37.5
42.5
60
27.5
30
50
52.5
37.5
17.5
25
52.5
15
37.5
32.5
47.5
浓度/% 时间/h 处理苗数 死亡数 死亡率/% 变异苗数 变异率/%
续表1
图1 二倍体植株 图2 四倍体植株
图3 变异植株 图4 叶尖开叉的变异植株
李雪娇等：野生碧玉兰多倍体诱导及鉴定·· 263
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植株有较大差别，主要表现为多倍体变异植株粗壮、矮
小，叶片颜色变深，叶片表面粗糙，叶片形态发生变异，
如叶尖开裂、叶片为双叶脉等（如图1~图5）。
在试管内对碧玉兰叶片的长与宽进行测量，各检
测20株。从表2、表3数据可得，通过对碧玉兰二倍体
植株进行多倍体诱导后，经过形态学初步检测后可知，
碧玉兰二倍体与多倍体植株在外型上表现出了明显差
异，碧玉兰多倍体植株表现出了多倍体巨大性的特征，
尤其是 2种检测材料的叶片宽度具有显著差异，但是
二者的叶长却没表现出明显的差异，而多倍体植株的
叶片颜色与二倍体植株相比也有一定程度加深，由正图5 双叶脉的变异植株
表2 碧玉兰变异植株和二倍体外型比较
观察材料
二倍体植株
变异植株
幼苗生长情况
正常
植株矮化，生长速度慢，苗畸形，根粗壮
叶型特征
叶表面光滑、细长，叶片黄绿色
叶片加厚，叶片变短、变宽，叶面及叶柄粗糙，叶色加深，叶尖开叉，
部分苗有双叶脉现象
表3 碧玉兰二倍体与多倍体植株叶片外型指标的统计学比较
检测项
叶长/cm
叶宽/cm
叶面积/cm2
二倍体
3.205±1.29
0.375±0.09
1.279±0.8
多倍体
3.845±1.6
0.549±0.13
2.3095±1.32
Ｔ值
-1.212
-4.778
-2.782
Ｔ0.05
2.093
2.093
2.093
Ｔ0.01
2.8609
2.8609
2.8609
常的黄绿色变成了深绿色，同时也具有叶表面粗糙、植
株变矮的特点。总体来说，二者在外观形态仍具有较
大区别，可以作为鉴定碧玉兰多倍体的初步依据。
2.2.2 染色体鉴定 碧玉兰二倍体植株的体细胞染色体
数目为 2n=2x=40(图 6)，经诱导后的材料染色体数目
出现了加倍现象（图 7），即 2n=4x=80，同时还存在 25~
112条染色体数目不等的细胞类型，变异后的大部分
四倍体植株继代后仍能保持四倍体的性状和染色体数
目不变，性状趋于稳定，而且稳定后的变异苗生长速度
比二倍体植株快，染色体镜检结果与形态学检测结果
基本相符，差异较小。
2.2.3 气孔鉴定 取碧玉兰二倍体植株和变异植株叶
图6 碧玉兰二倍体体细胞中期染色体2n=2x=40 图7 碧玉兰四倍体体细胞中期染色体2n=4x=80
·· 264
片，平均分成上、中、下三部分，撕取叶片下表皮，在显
微镜下观察。采用目镜测微尺测定气孔的长径、短径，
用椭圆面积近似公式（S=长径×短径）计算气孔的面
积。
从气孔鉴定来看，四倍体植株叶片的气孔明显增
大，且单位面积内的气孔数变少（图 8、图 9）。通过对
碧玉兰二倍体及四倍体植株叶片下表皮气孔的显微镜
观察，并对气孔长径、短径测量结果的统计分析，得到
的统计结果如下：
从表4可以看出，四倍体碧玉兰叶片的气孔比二
倍体碧玉兰叶片的气孔明显增大，而且单位面积内的
气孔数明显变少。通过T检验结果可知，四倍体植株
叶片气孔的长径、短径与二倍体相比都表现出了明显
的差异。
图8 二倍体叶片气孔(×10) 图9 四倍体叶片气孔(×10)
表4 碧玉兰二倍体与四倍体植株叶片的气孔比较
检测项
长径/µm
短径/µm
长径×短径/µm2
二倍体
29.088±3.27
21.6±2.68
626.2272±91.8
四倍体
35±3.02
28.23±2.34
987.4022±89.9
T
-6.489
-9.971
-15.75
Ｔ0.05
2.0639
2.0639
2.0639
Ｔ0.01
2.7969
2.7969
2.7969
2.2.4 RAPD分析 从电泳检测结果（图 10）可以看出，
碧玉兰B系列（二倍体碧玉兰）与Y系列（四倍体碧玉
兰）之间存在着显著差异，尤其是B6、B7、B8与Y6、
Y7、Y8之间差异较明显。由此可推断出在碧玉兰的
多倍体诱导过程中，除了染色体数目加倍之外，也产生
了RAPD分子标记差异，此现象将为碧玉兰的多倍体
育种提供更多依据并为品种的保护奠定基础。
3 讨论
3.1 对影响碧玉兰多倍体诱导成功率的影响因素的探
讨
徐冠仁等[14]提出，利用秋水仙素使染色体加倍的
关键因素是秋水仙素的处理方法、处理材料、浓度、处
理时间长短，及恢复期温度等。另外，还包括植物本身
的生理特性、诱导材料的选择、诱导方法的选择、实验
图10 二倍体与四倍体碧玉兰RAPD检测结果
李雪娇等：野生碧玉兰多倍体诱导及鉴定·· 265
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设计、实验条件的选择、秋水仙素浓度、实际操作过程
中引起的误差等因素。
3.2 用秋水仙素结合组织培养诱导兰花多倍体的优势
与不足
秋水仙素结合组织培养诱导多倍体的过程均在室
内进行，实验条件比较容易控制，对于兰花正常生长所
需的温度、光照、水分等因素，室内培养就可以人为创
造相应的生长条件使兰花正常生长，而兰花生长所需
的营养元素，经预先优化好的培养基配方就能提供充
足的养分，这为创造优良的兰花新品种奠定了重要的
实践基础。另外，用秋水仙素结合组织培养诱导多倍
体可以减少嵌合体[15]。在实验中出现了嵌合体，还需
要不断的继代和稳定，因此一定程度上延长了育种的
时间。同时，由于整个多倍体诱导过程都在无菌条件
下进行，故加大了试验操作的难度。
此外，秋水仙素有剧毒，对外植体有毒害作用，常
常使材料在处理过程中死亡。而且抑制种子的萌发和
根的生长。与组织培养结合时，不但使离体组织受害、
明显抑制不定芽分化、再生植株生长缓慢，甚至可使外
植体在继代培养中褐化死亡[15]。笔者同样发现秋水仙
素对碧玉兰组培苗的毒害作用，尤其是在秋水仙素诱
导后的一段时期能明显抑制幼苗的生长。
3.3 染色体数目多样性的探讨
对于在碧玉兰多倍体诱导后出现了不同倍性(包
括非整倍体)的染色体植株，对变异植株进行稳定并分
别扩繁，在植株以后的生长过程中，可对不同倍性碧玉
兰植株的外观形态、生长状况等进行比较，为今后培育
更加丰富的碧玉兰新种质资源创造条件和提供参考依
据。
3.4 碧玉兰多倍体诱导过程中结合振荡培养的可行性
有学者认为在振荡条件下浸渍外植体诱导效果更
好[16]。郭启高等[17]将剥去芽鞘的姜(Zingiber officinale)
芽浸泡于0.05%~0.4%的秋水仙碱溶液中，150 r/min振
荡48 h，清洗后转入分化培养基中培养，能够获得较高
的诱导率。试验在用秋水仙素诱导碧玉兰多倍体时也
采用振荡处理24 h，对提高诱导率有一定的促进作用，
因此，今后用秋水仙素诱导多倍体过程中添加一定量
的二甲基亚砜作为渗透剂，或者采用振荡培养的方式，
能有助于提高多倍体的诱导率和秋水仙素的利用效
率，是一条可行的途径。
笔者通过对碧玉兰进行多倍体育种，除了可以改
良性状，在创造新品种的同时，还为兰花的杂种优势利
用储备亲本资源。为进一步培育优质的碧玉兰新品种
做好准备，同时为云南野生兰花资源的开发与利用、创
建品牌花卉、参与国际竞争奠定良好基础。
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