全 文 ： 中国现代应用药学 2016年 7月第 33卷第 7期 Chin J Mod Appl Pharm, 2016 July, Vol.33 No.7 ·879·
角的变化，当外界环境改变时，聚丁二炔生物传
感器可以产生肉眼可见的颜色变化。利用该特点，
聚丁二炔生物传感器可以作为一种有用的工具用
于检测目标蛋白，由图 4中可见，随着 CK19抗原
浓度的增加，CR值呈相应的增加，当抗原浓度达
到 2 ng·mL1时，CR达到 20.2，溶液呈浅紫色，
根据文献报道，蓝色 (0≤CR<10)；紫色 (10≤
CR<30)；粉色(30≤CR<60)；红色(CR≥60)，这与
文献报道一致[6]。另据文献报道，加入非极性的脂
类可以提高聚丁二炔纳米粒的灵敏度，如加入脂
质体如 20%~30% DMPC可以通过降低 PDA骨架
的刚性，显著提高 PDA的颜色变化，在本实验中
我们将 PDCA/DMPC的摩尔比调整至 4∶1，使得
PDA/PC 的变色灵敏度明显提高，2 ng·mL1 的
CK19溶液，可产生肉眼可见的颜色变化，并可以
用于识别溶液中存在的单个肿瘤细胞，灵敏度高。
(Kim K-W)在溶液状态下，溶液中细胞角蛋白
CK19 和 MCF-7 细胞表达的 CK19 与 PDA/PC 生
物传感器表面抗 CK19 单克隆抗体发生特异性免
疫反应，由聚丁二炔生物传感器溶液的颜色变化
实验结果可见，CK19 和 MCF-7 作为一种交联剂
加入 PDA/PC溶液中，由于 PDA的聚合产生肉眼
可见的颜色反应，有人认为这是由于聚集引起
PDA 骨架的铰接并因此降低作用有效连接的长
度，在 PDA 生物传感器 π–π 共轭将影响 PDA 胶
束的可视性。导致溶液吸收波长由 650 nm 向
550 nm 改变，从而产生肉眼可见的蓝→红颜色变
化，这与文献报道一致 [7]。颜色变化时间约在
20 min，体系有 70%~80%发生了颜色变化，在大
约 1 h内体系的颜色变化即基本完成，变色速度较
快。该检测方法灵敏、高效，可以为肿瘤细胞的
体外快速检测提供依据，从而为探索 PDA/PC 生
物传感器在 CTC的检测提供依据，促进 CTC的检
测在基层医院的开展，为癌症早期诊断、预后评
价及个体化治疗方案设计提供依据。
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收稿日期：2016-02-08



吴兴铁线莲总黄酮的提取及体外抗肿瘤活性研究

张志荣，吴文辉*，陶周超(浙江中医药大学，杭州 310053)

摘要：目的 对吴兴铁线莲总黄酮成分进行分离提取，研究其抗肿瘤活性。方法 采用紫外可见分光光度法测定总黄酮
含量，以聚酰胺层析柱层析乙醇洗脱提纯吴兴铁线莲中的黄酮成分得到黄酮浸膏，通过 MTT 比色法用酶标仪测定光吸收
值，计算半数抑制浓度(IC50)，观察 100~25 600 mg·L1 不同浓度的铁线莲黄酮溶液对小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 体外增殖的作
用，来反映其抑制肿瘤细胞生长的灵敏性。结果 铁线莲浸膏稀释液经芦丁标准曲线吸光度测定，浸膏中黄酮含量为
82.7%，铁线莲干粉中黄酮含量为 47 mg·g1，2.843 g 铁线莲浸膏经洗脱提纯得到黄酮浸膏 0.158 g。提纯后铁线莲黄酮溶

基金项目：浙江省中医药科技计划项目(2015ZB058)
作者简介：张志荣，男，硕士，主治医师 Tel: (0571)86919399 E-mail: fdzuo1502@163.com *通信作者：吴文辉，男，博士，主
治医师 Tel: (0571)87071109 E-mail: wuxiaxpy@163.com
·880· Chin J Mod Appl Pharm, 2016 July, Vol.33 No.7 中国现代应用药学 2016年 7月第 33卷第 7期
液对骨髓瘤细胞 SP2/0 的增殖抑制率随总黄酮浓度的升高而增加，最后趋于稳定，其 IC50 值为 408.8 mg·L1。结论 吴兴
铁线莲黄酮提取物能抑制骨髓瘤细胞 SP2/0 体外增殖，具有特异性强、灵敏度高的抗肿瘤活性，其良好的量效关系可为
防治肿瘤潜在价值的开发应用提供依据。
关键词：吴兴铁线莲；黄酮；抗肿瘤活性；增殖抑制率
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-7693(2016)07-0879-05
DOI: 10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2016.07.011

Study on Flavonoids Extraction from Clematis Huchouensis Tamura and Its in Vitro Antineoplasmic
Activity

ZHANG Zhirong, WU Wenhui*, TAO Zhouchao(Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310053,
China)

ABSTRACT: OBJECTIVE To study the antineoplasmic activity of the flavonoids component extracted from Clematis
huchouensis Tamura. METHODS The content of total flavonoids was determined by Ultraviolet-Visible Spectrophotometry.
Polyamide column chromatography combined with ethanol elution was used to purify the flavonoids of Clematis huchouensis
Tamura to obtain its extract. ELIASA was applied in measuring optical density value with the adoption of MTT colorimetric
method. The meadian inhibitory concentration(IC50) was determined. The effect of Clematis huchouensis Tamura flavonoids
solution with the concentration varying between 100~25 600 mg·L1 impacting on in vitro proliferation of myeloma cells SP2/0
in mice was observed. So that its sensibility in inhibiting tumor cell growth was realized. RESULTS The flavonoids in the
Clematis huchouensis Tamura extract was 82.7% by absorbance measurement of rutin standard curve in its dilution. The
flavonoid content in Clematis huchouensis Tamura dry powder was 47 mg·g1. Flavonoid extract of 0.158 g was obtained by
elution and purification of 2.843 g Clematis huchouensis Tamura extract. Inhibition rate of purified Clematis huchouensis Tamura
flavonoids solution impact on proliferation of myeloma cell SP2/0 increased along with the upward tendency of total falvonoids
and eventually tend to be stable. The IC50 value was 408.8 mg·L1. CONCLUSION Flavonoids extraction from Clematis
huchouensis Tamura demonstrate antineoplasmic activity with strong specificity and high sensitivity through inhibition of
myeloma cells SP2/0 proliferation in mice. Its favourable dose-effect provides reference for further application of potential role
in the prevention and treatment of tumor.
KEY WORDS: Clematis huchouensis Tamura; flavone; antineoplasmic activity; proliferation inhibition rate

吴兴钱线莲，别名金剪刀、河边威灵仙，为
双子叶植物毛茛科铁线莲属植物湖州铁线莲
(Clematis huchouensis Tamura)的全草，主要分布
在浙江东北部平原地区，性味辛温，功效祛风湿、
通络止痛、抗癌、天灸。民间于夏、秋季采全草
鲜用，或晒干备用，有较好的应用基础。前期研
究发现铁线莲中多糖提取物具有较强的抑制肿瘤
细胞作用[1]。已知植物中的黄酮类化合物具有很高
的活性，作为吴兴铁线莲主要成分之一，尚无有
关铁线莲总黄酮抗肿瘤活性的研究报道。为明确
和观察其药理作用，本实验采用紫外可见分光光
度法测定黄酮含量，对乙醇萃取物总黄酮成分进
行分离纯化，进一步对吴兴铁线莲的有效成分进
行抗肿瘤活性测试。
1 材料和仪器
吴兴铁线莲采自浙江湖州，经浙江中医药大
学药学院姚振生教授鉴定为湖州铁线莲 Clematis
huchouensis Tamura。鼠骨髓瘤细胞 SP2/0(浙江中
医药大学动物实验中心，批号：JN-C0485，规格：
每瓶>5×100 000 cells)；芦丁对照品(中国药品生
物制品检定所，批号：0080-9504)；四甲基偶氮唑
盐(MTT，美国 Sigma公司，批号：m5655，规格：
1 g)；二甲基亚砜(DMSO，无锡海硕生物有限公司，
批号：20081107，规格：500 mL)；RPMI-1640培
养基(美国 GIBCO公司，批号：1228161，规格：
500 mL)；新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有
限公司，批号：2060311，规格：200 mL)；5-氟尿
嘧啶(5-Fu，上海旭东海普药业有限公司，批号：
020104，规格：5 mL)；0.25%胰蛋白酶溶液(杭州
吉诺生物医药技术公司，批号：25200072，规格：
100 mL)。
FZ102 微型植物试样粉碎机(上海金鹏分析仪
器有限公司)；RE-52 AAA型旋转蒸发仪(上海亚荣
生化仪器厂)；AG135 型电子天平(瑞士梅特勒-托
利多)；HH 系列数显恒温水浴锅(上海红星仪器有
限公司)；DZF-6050 型真空干燥箱(上海基屹生物
中国现代应用药学 2016年 7月第 33卷第 7期 Chin J Mod Appl Pharm, 2016 July, Vol.33 No.7 ·881·
科技有限公司)；UV-1900双光束紫外-可见分光光
度计(北京普析通用仪器有限公司)；SW-CJ-2FD型
超净工作台(上海博讯实业有限公司)；Thermo3111
型 CO2 细胞培养箱 (美国 Thermo 公司 )；
Nikon/TE2000-S型倒置荧光相差显微镜(日本尼康
公司)；BIO-RAD/680型酶标仪(美国伯乐生命医学
产品有限公司)；LDZ5-2 型低速离心机(北京医用
离心机厂)；SPS-2001F型电子天平(美国奥豪斯)；
MC99-3 自动液相色谱分离层析仪(上海沪西仪器
厂)。
2 方法
2.1 完全培养基的配制
RPMI-1640 细胞培养基 10.4 g，碳酸氢钠
2.0 g，加超纯水定容至 1 000 mL，调 pH 7.2~7.4，
0.22 mm 微孔滤膜过滤除菌，分装后 4 ℃保存备
用，临用前加 10%的新生牛血清及 1%的双抗。
2.2 阳性对照液(5-Fu)的配制
吸取 5-Fu 原液 (25 g·L1) 40 mL 加入到
9.96 mL RPMI-1640 培养基中，混匀，终浓度为
100 mg·L1，4 ℃保存备用。
2.3 样品的制备
新鲜吴兴铁线莲的茎叶，恒温烘干至恒重，
粉碎，过 120目筛。取上部粉末 50 g以 1∶5的比
例加入石油醚，70 ℃回流脱脂 2次、每次 1 h，过
滤后留取滤液。残渣风干后加 80%乙醇浸泡过夜，
于 85 ℃下回流提取 2 次、每次 1 h，留取滤液用
四层纱布过滤，将 4 次回流所得药液合并，蒸发
浓缩，烘干至恒重，得到铁线莲浸膏 2.843 g，蒸
馏水定容至 500 mL，配制成 5.686 g·L1的铁线莲
样品溶液备用。
2.4 样品中黄酮含量测定及分离
芦丁等黄酮类化合物具有 3’,4’-邻位羟基，碱
性条件下与亚硝酸钠、硝酸铝反应而显红色，故
作为对照品，采用分光光度法测定[2]。精密称取芦
丁对照品 10.2 mg 置于 50 mL 量瓶，用 95%乙醇
溶解，定容备用。
取芦丁对照品 1 mL于 10 mL具塞试管中，先
后加入 5%亚硝酸钠试液 0.3 mL、10%硝酸铝溶液
0.3 mL和 4%氢氧化钠溶液 4.0 mL，蒸馏水稀释至
刻度，摇匀静置后显色，于 420~700 nm进行扫描，
选择最大吸收波长。
分别取芦丁对照品 0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL
于 10 mL量瓶中显色，以 0 mL的空白溶液做参比
对照，于最大波长处测定吸光度，绘制标准曲线。
取 5.686 g·L1铁线莲样品溶液 1 mL和 0 mL
于 10 mL具塞试管中，其中 0 mL为空白溶液。以
空白溶液为参比，测定吸光度，并根据标准曲线
计算样品中黄酮含量[3]。
将 500 mL 5.686 g·L1的吴兴铁线莲溶液过聚
酰胺柱层析，以 2 BV·h1流速过柱，溶液中的黄
酮被吸附，再用蒸馏水洗涤(体积约为 10 BV)柱子。
用 300 mL 50%的乙醇溶液洗脱下来的液体进行旋
蒸，收集浓缩液进行真空干燥直至恒重，即为铁
线莲黄酮浸膏。
2.5 抗肿瘤活性检测
①含药培养基的制备：精密称取 0.128 g挥发
干的铁线莲总黄酮，加入 5 mL RPMI1640培养基
充分溶解。②细胞复苏：将装有 SP2/0细胞的冻存
管于温水中充分溶解，1 500 r·min1离心 4 min。
吸弃上清液，分别加入 1 mL含青霉素、链霉素、
10%新生牛血清的 RPMI1640培养基反复吹打，再
置于培养箱内培养。③细胞传代培养：按 1∶4的
比例传代，每隔 1 d传代 1次，维持细胞处于对数
生长期。④细胞接种：将 SP2/0 细胞分别用
RPMI1640 培养基制备成 6×104~1×105 个·mL1
的细胞悬液，加入到 96 孔细胞培养板内，每孔
100 mL。设空白对照组、阴性对照组、阳性对照
组和不同浓度给药组，每组设 8 个重复孔，培养
过夜。⑤加药：细胞贴壁后，分别加入 100 mL不
同浓度的铁线莲总黄酮溶液。阳性对照组加
100 mL 5-Fu，阴性对照组加 100 mL培养液。空白
对照组仅加 200 mL培养液。培养 68 h后，加入
20 mL MTT溶液(5 g·L1)，37 ℃、5% CO2培养箱
内反应 4 h。小心吸弃上清，每孔加入 DSMO
150 mL，剧烈震荡 10 min。⑥细胞增殖抑制率的
计算：在 490 nm 波长处测定其光吸收值(OD 值)
以间接反映活细胞数量，根据公式细胞增殖抑制
率(%)=(对照组 OD 值实验组 OD 值)/对照组 OD
值×100%。⑦半数抑制率(IC50)的计算：将黄酮浓
度和对应抑制率经变换后根据数据做图，通过
excell 软件确定拟合曲线，计算铁线莲总黄酮对
SP2/0细胞的 IC50值。
3 结果
3.1 总黄酮的测定及分离
经统计分析，得芦丁标准曲线回归方程：
y=10.63x+0.013 3(R2=0.999 4)。
·882· Chin J Mod Appl Pharm, 2016 July, Vol.33 No.7 中国现代应用药学 2016年 7月第 33卷第 7期
取 5.686 g·L1铁线莲样品溶液 1 mL 稀释至
10 mL，得到 0.568 6 g·L1铁线莲溶液，于最大吸
收波长处测定吸光度。经测定，3组黄酮的吸光度
分别为 0.490，0.568，0.579，取平均值 0.513。根
据标准曲线方程得到稀释后铁线莲溶液中总黄酮
含量为 0.47 g·L1，计算得黄酮含量为 2.35 g，铁
线莲浸膏中黄酮含量为 82.7%，50 g铁线莲干粉黄
酮含量为 47 mg·g1。根据“2.4”项下方法，得到
0.158 g黄酮浸膏。
3.2 铁线莲黄酮对 SP2/0细胞的体外增殖抑制活性
根据“2.5”项下方法制得 50~25 600 mg·L1
不同浓度的铁线莲黄酮溶液，分别测其接种 SP2/0
细胞的 OD值，结果见表 1，发现 OD值随总黄酮
浓度的升高而逐渐降低，计算抑制率逐渐增大，
最后趋于稳定。在浓度>800 mg·L1的黄酮提取物
与 5-Fu组对细胞的增殖抑制率无统计学差异。拟
合曲线公式为 y=20.45ln(x)72.97，R2=0.916，IC50
值为 408.8 mg·L1。
表 1 不同浓度铁线莲黄酮提取物抑制率比较(n=8, sx  )
Tab. 1 Comparison of inhibition rate of flavon extraction
with dirrerent concentration from Clematis huchouensis
Tamura(n=8, sx  )
药 物 浓度/mg·L1 增殖抑制率/%
铁线莲黄酮提取物 100 32.01±0.481)
铁线莲黄酮提取物 200 36.65±0.331)
铁线莲黄酮提取物 400 33.19±0.371)
铁线莲黄酮提取物 800 70.09±0.691)
铁线莲黄酮提取物 1 600 84.59±1.15
铁线莲黄酮提取物 3 200 88.21±0.57
铁线莲黄酮提取物 6 400 89.55±0.53
铁线莲黄酮提取物 12 800 88.96±0.91
铁线莲黄酮提取物 25 600 89.72±0.48
阳性对照(5-Fu) 100 81.80±0.82
阴性对照 0 0
注：与 5-Fu组比较，1)P<0.05。
Note: compared with 5-Fu group, 1)P<0.05.
4 讨论
铁线莲属植物有保肝、降压、抗炎、抗菌、
抗肿瘤和细胞毒等多种药理活性。不同铁线莲属
植物所含的化学成分有差异，黄酮是主要的结构
类型之一。植物中所含黄酮类物质具有多种药效
作用，测定方法主要有 HPLC 和分光光度法，前
者灵敏度高、快速准确但样品前处理复杂且仪器
昂贵，后者设备简单、操作容易，稳定性和重复
性良好，广泛用于植物总黄酮的测定[4-5]。采用紫
外分光光度法可测定不同提取时间和溶剂倍量下
植物水提液中总黄酮浓度[6]。
流行病学调查提示，植物内黄酮显著降低肿
瘤风险，研究表明多种植物黄酮类提取物具有抗
肿瘤活性，其作用机制涉及多途径。先前的实验
基础表明铁线莲乙醇提取物具有抗肿瘤作用，并
呈良好的浓度-剂量依赖关系[7]，本实验进一步从
提取物这一混合物中分离出黄酮，作为研究抑瘤
作用的有效成分。采用 MTT法评价了吴兴铁线莲
黄酮对小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0 细胞)的增殖抑制作
用，结果显示具有显著的抑制 SP2/0细胞生长的作
用，并随浓度的升高而升高，呈现良好的浓度-剂
量依赖关系。其 IC50值为 408.8 mg·L1，该数值较
小，说明所提取黄酮类物质抗肿瘤的特异性能较
强。先前使用过人肝癌细胞 HepG2 和人胃癌细胞
MGC8-03[1]，本实验所用小鼠细胞是较接近人类的
细胞，反映铁线莲该天然草药的广泛抗肿瘤活性。
而且根据表 1 铁线莲黄酮浓度为 800 mg·L1时所
得抑制率>70%，认为该浓度范围以上对肿瘤细胞
增殖高度敏感，具有特异性强、灵敏度高的抑瘤
活性。根据氧自由基学说，自由基引发过氧化损
伤是肿瘤发生的原因之一，铁线莲黄酮类可能通
过清除自由基抑制肿瘤细胞的增殖、阻滞细胞周
期，以及诱导肿瘤细胞凋亡等多种机制发挥作用[8]。
本研究对铁线莲粗提物进行纯化以研究有效
成分的抗肿瘤效应，依据黄酮多机制抑瘤的理论，
验证吴兴铁线莲的黄酮提取物防治肿瘤的潜在功
效。有利于降低中草药使用剂量，为多途径开发
提供新思路，对发挥中草药高效、低毒、多靶点
优势应用于肿瘤防治具有参考价值。还可调整洗
脱配方以期获得更佳的黄酮洗脱率，通过色谱和
半制备液相方法得到纯化的单体黄酮[9]，以进行扩
大化的抑癌实验。
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收稿日期：2015-10-16



MCL-1 siRNA 通过线粒体凋亡途径部分逆转耐顺铂结肠癌细胞系
SW480的耐药性

焌徐烨，郁峰，崔 辉，陈诚豪，都志军(浙江省立同德医院肛肠科，杭州 310012)

摘要：目的 探讨顺铂耐药结肠癌细胞的 MCL-1 表达水平与顺铂耐药性的关系。方法 用 MTT 法检测顺铂耐药结肠癌
细胞系 SW480(SW480-R)对顺铂的敏感性。通过检测 siRNA 下调 SW480-R 细胞 MCL-1 的表达作用观察其对细胞耐药性
的影响。Western blot 试验检测 SW480-R 细胞 Bcl-2 家族蛋白及线粒体来源促凋亡因子的表达水平。Annexin V/PI 染色检
测 SW480-R 细胞的凋亡。结果 SW480-R 细胞相比于常规 SW480 细胞对顺铂的敏感性显著下降，Western blot 结果表
明 SW480-R 细胞的 MCL-1 水平显著上调而其他 Bcl-2 蛋白家族成员(Bcl-2，Bcl-xl，BIM，BAK，BAX)表达水平变化不
明显。体外转染 MCL-1 siRNA 能逆转 SW480-R 细胞的耐药性，提高顺铂对 SW480-R 的杀伤活性。在 SW480-R 细胞中，
MCL-1 siRNA 能促进线粒体来源的促凋亡因子(细胞色素 C、凋亡诱导因子、Smac/DIABLO)在顺铂治疗下从线粒体中释
放到细胞质中，进而诱导耐药肿瘤细胞发生凋亡。结论 MCL-1 的高表达可能是结肠癌细胞产生顺铂耐药性的重要机制，
MCL-1 基因沉默能通过线粒体凋亡途径逆转耐顺铂结肠癌细胞系 SW480 的耐药性。
关键词：MCL-1；结肠癌；SW480-R；顺铂；凋亡
中图分类号：R965.2 文献标志码：A 文章编号：1007-7693(2016)07-0883-06
DOI: 10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2016.07.012

MCL-1 siRNA Reverses the Chemoresistance of Cisplatin-resistant SW480 Cells via the Pathway of
Mitochondrial Apoptosis

XU Ye, YU Feng, CUI Junhui, CHEN Chenghao, DU Zhijun(Department of Anus-intestines, Tongde Hospital of
Zhejiang Province, Hangzhou 310012, China)

ABSTRACT: OBJECTIVE To investigate the relationship between the expression of MCL-1 and the cisplatin-resistance in
cisplatin-resistant colon cancer cells. METHODS MTT assay was performed to evaluate the sensitivity of cisplatin-resistant
SW480(SW480-R) cells to cisplatin. RNA interference was used to down-regulate the expression of MCL-1, detecting the role of
MCL-1 siRNA in chemoresistance in SW480-R. Western blot analysis was performed to measure the expression of BCL-2 family
proteins and mitochondria-derived pro-apoptotic proteins. The apoptosis of SW480-R cells was determined by Annexin V/PI
staining. RESULTS The sensitivity of SW480-R to cisplatin was significantly reduced compared with the routine SW480 cells.
The results of Western blot assay indicated the level of MCL-1 was significantly up-regulated in SW480-R, whereas the other
Bcl-2 family proteins (Bcl-2, Bcl-xl, BIM, BAK, and BAX) were not influenced obviously. Transfection of MCL-1 siNRA in
vitro could reverse the drug-resistance in SW480-R, enhancing the anti-tumor effect of cisplatin. Furthermore, the MCL-1 siNRA
promoted the release of mitochondrial-derived pro-apoptotic factors (cytochrome C, Smac/DIABLO, apoptosis inducing factor)
into cytoplasm in SW480-R cells treated with cisplatin, leading to the induction of apoptosis. CONCLUSION Overexpression
of MCL-1 is one of the most important mechanisms for the induction of chemoresistance in colon cancer. Knockdown of MCL-1
can reverse the chemoresistance of cisplatin-resistant SW480 cells via the pathway of mitochondrial apoptosis.
KEY WORDS: MCL-1; colon cancer; SW480-R; cisplatin; apoptosis

作者简介：徐烨，女，硕士，主治医师 Tel: (0571) 89972372 E-mail: tongdexuye@163.com