全 文 ：植 物 学 报 一9 9 4 , 3 6 ( 3 ) : 2 1 5一 2 2 0
沌d a B o t a 成伪 5 1越ca
兰州百合生殖器官中辜酮含量的变化
杨中汉 唐 因 曹宗粪
(北京大学生物系 ,北京 10 08 7 1 )
摘 要
用直接竞争酶联免疫吸 附分析法检测了兰州百合 ( L il u m d a v i d “ D uc h . )花粉 、雄蕊 、 雌
蕊及花瓣中幽类激素— 皋酮的含量 。 雄蕊中肇酮的含量随发育进程上升 , 开花当天达到最高值 。雌蕊和花瓣中的辜酮含量低 , 而且不伴随花的发育进程变化 。 生殖器官中翠酮含量以成
熟花粉为最高 。 无论蕾期授粉 (亲和 )或自花授粉 (不亲和 )与不授粉的对照相 比 , 雌蕊的攀酮
含量无显著差别 。百合花粉水合后皋酮含量略有下降 。 花粉在体外萌发过程中 , 花粉管中的肇
酮含量随花粉管的生长而急剧下降 ,这时萌发介质中只出现极微量的辜酮 ,而且在整个萌发
时期无明显变化 。 推测皋酮参与雄配子体的发育和成熟 ,并与花粉的萌发有一定关系 ,但无迹
象表明与受精的选择性有关 。
关祖词 辜酮 ;酶联免疫吸附分析 ;花粉 ;授粉 ;百合
T H E C H A N G E S O F ST E R O ID A L S E X H O R M O N E
T E ST O ST E R O N E C O N T E N T S I N R E P R O D U C T I V E
O R G A N S O F L I L I U M D A V I D l l D U C H
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,
r e a e h e d m a x im u m a t a n t h e s is
.
A f t e r
p o l le n s h e d d i n g t e s t o s t e r o n e r a p id ly d e e r e a s e d
.
N o o b v i o u s e h a n g e s o f t e s t o s t e r o n e w e r e
收稿日期 : 1 9 9 2一 1 1一 13 接受日期 : 1 9 9 3一 02 一 1 5
, 国家自然科学基金资助项 目。
植 物 学 报 3 6 卷
o b
s e r v e d w i t h d e v e lo p m e n t o f p i s t i l a n d p e t a l
.
L i ly e x p r e s s e s g a m e t o p h y t i e s e lf
一
in e o m p a t i
二
b il i t y
.
T h e le v e ls o f t e
s t o s t e r o n e s h o w e d l it t l e d if f e
r e n e e in p is t il
,
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I t r a p id ly d e e r e a s e d i n p o l le n t u b e d u r i n g g e r m in a t io n a t t h e f i r s t 3 h
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T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t
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a t e d w i t h d e v e lo p m e n t a n d r i p e n in g o f m a le g a m e t o p h y t e a n d p o l le n g e r m i n a t i o n
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s ig n i n d ie a t e s it s p a r t i e i p a t i o r l in t h e p r oc e s s o f s e l f
一
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.
K e y w o r d s T e s t o s t e r o n e ; E n z y m e li n k e d im m u n o s o lv e n t a s s a y ; P o ll e n : P o l li n a t io n :
L i l y
早在 30 年代 ,在植物中发现 了街类激素〔 , · 2〕 ,近 10 多年来应用一些高灵敏度和特异
的检测方法 二3一 二,使研究工作获得较大进展 。 至今 ,可以认为动物的街类性激素较广泛地
存在于许多植物的多种组织和器官中L6 一` 。〕。 动物的孕激素也曾在植物中检测到圈 ,还发现
植物体内有合成及转化雌二醇的酶系统 , ` · ` ’ 口。 植物中街类激素的生理作用有些报道 , 但
缺乏一致性和系统性 二5 , 1 3 一 1 5〕 。 我们实验室近 10 年来的工作表明 : 雌酮在瓤瓜花蕾出现之
前就有少量存在 , 随花的发育从花蕾时期至开花雌酮含量上升口 6〕。 雌二醇及雌激素总量
在白菜及兰州百合的子房和花柱中最高 ; 还发现雌二醇与亲和授粉有关口 7〕。 关于雄激素
在植物各器官中的存在 ,特别是它们与植物生殖发育的关系 , 文献中报道很少 。 本文研究
了雄性激素皋酮在百合生殖器官 中的含量以及它在雄性器官发育进程中的变化 。
材 料 和 方 法
(一 ) 植物材料
除油菜 ( B asr isc a ca m eP st 二 )花粉为蜂采外 ,其他 5 种均为人工采集 。 油松 (尸in us t ab u -
zae j汾 m is ) 、 白皮松 ( p in u s bu n岁 a n a ) 、 银杏 ( G动 kg o bi l砧 a )和核桃 ( J u g l a sn er g ia ) 4 种采于
北京大学校园内 。 开花当天收集未开裂的花药 ,在室温下晾干 ,待花药自然开裂后 , 收集花
粉 ,贮藏于一 20 C下 。 兰州百合 (L d iu m d va id il) 取自兰州市郊大田 ,依照上述方法采集花
粉 。 开花当天 ,开花前及开花后不同时间剥取花瓣 、 花药和雌蕊 ,贮于一 20 C下 。 取刚开裂
的花药在开花当天对柱头进行 自花授粉与蕾期授粉 ,套袋隔离 , 以开花当天未经授粉的雌
蕊为对照 , 分别在不同时间收集雌蕊 ,存一 20 C备用 。
(二 ) 植物样品的准备
1
. 花粉及其它植物组织 中辜酮的提取 参照 iS m on s 等方法 ,称取 1 9 材料 ,加入 5
m 1 95 %乙醇和少量石英砂 ,在冰浴中研磨 10 分钟 ,每份样品加入 10 0 川 1 , 2 , 6 , 7一 狄 一肇
酮 (1 . 7又 10 ` 鞠 , 10 ic / m m ol ,上海原子能研究所 ) , 再加入 s ml 乙醇充分匀浆 。 材料在乙
醇 中浸泡提取 48 小时 (0 一 4 C ) , 1 0 0 0 又 g 离心 10 分钟 , 取上清液 。 沉淀加 2 m 1 95 % 乙醇
重复提取 2 次 ,合并上清液减压蒸干 ( 4 o C 以下 ) ,用酶结合物溶液定容至 l ml 。 取 Q. s ml
用液闪测定放射性 ,计算回收率 。 剩余样品用作 IE J IS A 测定 。 另取 3 份植物材料称重后在
8 5 C 下烘至恒重 , 用作干重换算 。
3 期 杨中汉等 : 兰 州百合生殖器官中皋酮含量的变化
2
. 萌发花粉管 中肇酮的提取 百 合花粉从 一 20 C取出 , 在 4 C放置 4 小时 , 并 在
1 0 0% 相对湿度的小室中在室温下水合 2 小时 。 每克花粉加 20 0 m l 培养基 ( 10 %蔗糖 , 1 0
p m 硼酸 ) 25 ℃ 下振荡培养 ( 60 次 /分 ) 。 在培养的不同时间取样 ,经醋酸洋红染色 , 统计萌
发率并测量花粉管长度 。 花粉管长度大于花粉直径一半时视为萌发 。 通过离心 ( 4 0 0 0 x
g )把花粉管和萌发介质分开 ,分别提取肇酮 , 加放射性皋酮作内标 ,计算回收率 。
3
. 萌发液中肇酮的提取 参照动物血浆中皋酮提取方法〔` 8〕 ,并加以改进 。 取 20 m l
培养介质置分液漏斗中 ,加入 1 0 川放射性肇酮 ,再加入等体积的二氯甲烷和 1 m l 0 . 1
m ol / L N a 0 H
, 激烈振荡提取 5 分钟 。 取出上层水溶液 ,下层二氯甲烷抽提液用 1 m l蒸馏
水洗 2 次 ,振荡 1 分钟 , 吸出上层水溶液 。 将抽提液于 60 ℃水浴上蒸干 , 用 1 m l 结合物溶
液溶解 ,定容 。 取 0 . 5 m l 测定放射性强度 ,计算回收率 。 剩余用作 E IL S A 测定 。
(三 ) 用直接竞争 E IL S A 检测植物的寨酮
1
. 辜酮抗体由中国科学院动物研究所提供 ,抗体是通过以牛血清蛋白作为载体的人
工抗原免疫家兔而得 ,抗血清滴度为 1 : 1 0 0 0 或更高 。 交叉反应试验表明 5 a( )双氢翠酮
( 51 % )和 5 (助双氢肇酮 ( 27 % )是该抗体主要交叉反应物质 , 其它化合物则很小 ,说明抗
体有很强的特异性 。
2
. 翠酮直接竞争 E IL S A 的建立详见杨中汉等 〔` 9 〕方法 。 用混合酸配法制备辣根过氧
化物酶标记的抗原立2。二。 E IL S A 检测中首先包被抗体 ,加入竞争结合的非标记抗原和酶标
记抗原 。 选择 p H 4及 1 , 3 0 0 0 作为包被液的最适 p H 和最佳稀释度 , 然后确定抗体包被
的温度和时间 (4 ℃下过夜 ) 。 酶结合抗原 4℃下温育 3 小时 。 底物反应在 30 ℃下 1 小时 ,
酶促反应在 4 92 n m 下测定光吸收 。 标准曲线表明该法测定范围是 7一 1 6 0 0 gP , 最低检
测量为 7 p g ,具有很高的灵敏度 。
3
.
E L IS A 内标 曲线的测定 参照 iT js en , ` 〕方法 ,在提取纯化后的油松花粉辜酮样
品中 ,加入不同浓度的皋酮标准溶液 ( 5 0 0一 3 0 0 0 p g / 1 0 0 川) ,用 IE 才 IS A 测定 。 所得结果作
图并与标准曲线比较 ,若两条线相互平行 ,说明提取与测定方法可靠 。对检测的样品 ,从提
取到最后测定至少有 3 次重复 ,每次至少有 5 组平行 。 凡要进行比较的样品尽量放在同批
内测定 。 每次 E L IS A 测定样品时要包括标准曲线 。 用油松和银杏花粉的试验表明 ,在一批
试验中多份测定的重复性较为满意 ,变异系数分别为 n . 6%和 7 . 7% ,相同标本在 3次不
同实验中变异系数为 12 . 4%和 8 . 2% 。
实 验 结 果
(一 ) 几种植物花粉寨酮含量的比较
从表 1可见 , 除油菜和核桃花粉中未检测出肇酮外 , 其余 4 种花粉均含肇酮 。 其中兰
州百合花粉的肇酮含量最高 ,平均 24 4 n g / 9 d yr w t , 白皮松最低 , 平均 n n g / 9 d yr w t 。
(二 ) 花瓣中辜酮含量的分析
百合花瓣含有果酮 ,其含量在 1 0 . 05 一 1 0 . 92 n g / 9 d yr w t 之间 , 花瓣中的肇酮含量不
随花的发育进程而变化 (表 2 ) 。
(三 ) 雄蕊发育过程中辜酮含量的变化
兰州百合雄蕊 中存在案酮 ( 图 1 ) 。 在雄蕊发 汀前期 (花蕾长约 10 m m ) 已有相当数量
2 1 8 植 物 学 报 3 6 卷
的皋酮存在 ,平均约 12 . s gn / 9 d yr wt 。 随着花的发育 , 雄蕊长大 ,皋酮含量迅速增加 , 成
熟花粉辜酮含量为 24 4 n g / 9 d yr w t 。 在开花当天 ,雄蕊中肇酮含量达到最高值 , 即 60 n g /
9 dr y w t
。 开花后 , 随着花粉散发 ,花粉中肇酮含量急剧下降 ,开花后第 2 夭花药中皋酮含
量为 20 n g / 9 d yr w t 。 可见 ,翠酮主要集中在花粉中 , 花药壁中含量甚低 。 雄蕊中皋酮含量
的变化表明 , 肇酮与雄配子体的发育与成熟密切相关 。
表 1 6 种植物花粉中塞酮的含 t
T a b le 1 T h e e o n t e n t s o f t e s t o s t e r o n e in p o l le n o f s ix P la n t s P e e ie s
植物种
P l a n t s lx 沱 i e s
攀酮含量 C o n t e n t s o f t e s t os t e r o n e
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5 5士 1 0 . 3 9
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.
8 3士 7 . 0 9
, 未检测出 。 N o d e t ec t a b le .
表 2 兰州百合花瓣中率酮含 t ( n g / 9 d yr w t)
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a b l e 2 T h e 仁o n t e n t s o f t e s t o s t e r o n e i n p e s t a l o f L il 爪m d a v 泛d i ( n g / 9 d r y w t )
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获芽时期 B u d s t a g e A n t h e s一s
雄蕊发育进展 n e v e l o p m e n t s t a g e o f s t a m e n (d a y )
0 二一价声一月犷一一斌厂一卞一一犷雌蕊发育进展 o e v e一o p m e n t s t a g e o f p , s t i l ( d a y )
图 1 兰州百合雄蕊发育过程中翠酮含量的变化
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图 2 雌蕊发育过程中皋酮的变化
· 一 · 正常开花 , 自花授粉 (不亲和 )
。 · · · ·一 蕾期授粉 (部分亲和 )
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2 T h e e h a n g e s o f t e s t o s t e r o n e d u r l早g
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3 期 杨中汉等 : 兰州百合生殖器官中皋酮含量的变化
(四 ) 雌蕊中辜酮的含量
百合雌蕊也含有皋酮 ,其含量明显低于雄蕊 (图 2 ) 。 在花的发育进程中 , 梁酮含量不
随雌蕊长大而变化 。兰州百合属于配子体 自交不亲和型 ,正常 自花授粉不能受精 、 结实 。蕾
期授粉可部分克服 自交不亲和性 , 导致一定程度的受精 、 结实 。 实验表明 ,蕾期授粉 , 自花
授粉与正常成熟雌蕊 (不授粉 )相 比 ,肇酮含量无明显差别 。 因此 ,可以推测肇酮与百合 自
交不亲和性关系不密切 。
(五 ) 花粉萌发过程中辜酮含量
的变化
花粉体外萌发时 ,水合 2 小时后 ,
花粉中皋酮含量略有下降 。 花粉萌发
的开始 3 小时内 ,花粉管生长最迅速 ,
而花粉管中皋酮含量随花粉管生长急
剧下降 。 萌发 3 小时后 ,花粉管生长缓
慢 , 这时花粉管中皋酮含量下降相应
缓慢 。 花粉管生长与花粉管中皋酮含
量呈负相关 (图 3 ) 。 花粉管中肇酮是
否释放到培养介质中去 ? 实验结果表
明 : 萌发 1 小时时在萌发介质中可检
测 出少量 的辜酮 ( 不足 30 gP / g 击 y
w t
, 即为此时萌发花粉 中辜酮含量的
百万分之一 ) 。 萌发过程中 ,培养介质
中肇酮 含 量 无 明 显变 化 ( 图 3 内 图
A )
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水合作用
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萌 发时间
G e r m 一n a t一o n
图 3 兰州百合花粉萌发过程中翠酮含量的变化
(A ) 萌发介质中肇酮的变化
· 一 · 花粉管生长 。 一 。 皋酮含量
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· 一 · T u b e g r o w t h 。 一 。 C o n t e n t o f
t e s t 0 S t e r o n e
萌发介质中微量的翠酮存在 ,很可能是 由于花粉管破裂或花粉因质膜破损而释放到
介质中的 。 显然 , 随着花粉的萌发和花粉管的生长 ,必定伴随肇酮的代谢和转化 ,积极参与
了百合花粉的萌发与花粉管的生长 。
讨 论
许多研究表明 , 幽类激素较为广泛地存在于植物的许多器官和组织中 。 我们实验室发
现 ,雌激素在雌性生殖器官中含量较高 ,雄性器官中含量较低 [` “ , “ 困。 本文表明雄激素肇酮
在雄性生殖器官中含量较高 ,雌性器官 中含量较低 。 iS m on S 等 已5二在海婴粟和玉米中也发
现 , 雌性器官中孕酮与雌激素含量高于雄性生殖器官 , 雄性激素则相反 。 这种雌雄生殖器
官之间在幽类激素含量上的差异 , 以及与植物其它器官中街类激素含量 比较 , 暗示 街类性
激素在植物生殖过程中有一定的作用 。
在白菜和百合中 . 花柱中雌激素的含量授粉后显著增加 〔` ’ 口。 这表明雌激素与亲和授
粉有关 ,即植物传粉 、 受精过程有雌激素的参与 。本研究表明 ,雄性激素肇酮在雄性生殖器
官中含量较高 ,而且随雄蕊的发育而增加 , 成熟花粉中含量最高 。 可见 ,肇酮与雄蕊发育 ,
雄配子体的发育与成熟密切相关 。 肇酮在花粉发育与萌发过程的变化 , 文献尚未见报道 。
2 2 0 植 物 学 报 3 6 卷
本文研究结果为今后植物体内街类性激素生理意义的研究提供有意义的启示 。
参 考 文 献
1 B u t e n a dn
t A
.
J a e o b i H
.
U be r d i e aD
r s t e l u n g e i n e s k d r y s t a l l i s i e r t e n p f坛nz li e h e n t o ko址 in sn ( T h e ly k i in sn ) u dn se ine ·
id e n , i f i z i e r u n g m i , d e m
一 a 一 f o lo l ik e lh o r m o n
·
U n ` e r s u e h u n g e r U be r d e s w e i bli c h e eS x u a小 o rmo n
·
oH沙 & ,妙二5 2
P h ys 汉 C h e m . 1 9 3 3 . 2 18 : 1 0 4一 1 1 2
2 S k a r z y ns k i B
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P h ) t朋 , 1 9 6 7 . 24 : 2 5一2 9
9 aS d
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T a j i e M
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K o lb a h D
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1 1 L in J T
,
P r oe bs t l n g W M
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