全 文 ：※分析检测 食品科学 2013, Vol.34, No.16 173
双抗体夹心酶联免疫吸附法检测杏仁过敏原
苦杏仁球蛋白
张洁琼，高淑霞，生 威，张 燕，王 硕*
(天津科技大学食品工程与生物技术学院，教育部食品营养与安全重点实验室，天津 300457)
摘 要：提取中国甜杏仁过敏原蛋白苦杏仁球蛋白，分别制备兔和鼠多克隆抗体，建立双抗体夹心酶联免疫吸附
(ELISA)法。结果表明：对甜杏仁中苦杏仁球蛋白的检测限为(6.36±1.02)µg/L；对中国苦杏仁及美国大杏仁中苦杏
仁球蛋白的检测限分别为(12.11±1.70)µg/L和(18.95±1.52)µg/L，且与常见的14种植物性蛋白没有交叉反应，表明该
方法具有良好的特异性。将该方法用于法式小面包、饼干和脱脂牛乳中杏仁过敏原的检测，苦杏仁球蛋白的添加回
收率为78.94%～125.15%，且相对标准偏差均低于5.81%。
关键词：杏仁；苦杏仁球蛋白；双抗体夹心酶联免疫吸附分析法
Development of Double-Antibody Sandwich ELISA for the Detection of the Almond Allergen Amandin
ZHANG Jie-qiong，GAO Shu-xia，SHENG Wei，ZHANG Yan，WANG Shuo*
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Ministry of Education, College of Food Engineering and Biotechnology,
Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)
Abstract：In the present study, allergen amandin from Chinese sweet almond was prepared, and specific antibodies
against the amandin were produced. A double-antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) based
on rabbit polyclonal antibody and mouse polyclonal antibody was then established. The newly established ELISA could
detect amandin at levels as low as (6.36 ± 1.02) µg/L, showing no cross-reactivity with 14 common plant proteins. The
limit of detection for amandin was (12.11 ± 1.70) µg/L in Chinese bitter apricot kernel and (18.95 ± 1.52) µg/L in
almond (Amygdalus communis L.). The sandwich ELISA were used to detect the amandin in spiked samples of French-
style bread, biscuit and skim milk with recoveries ranging from 78.94% to 125.15%, and relative standard deviation (n = 3)
below 5.81%.
Key words：apricot kernel；amandin；double-antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay (sandwich ELISA)
中图分类号：R155.5 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)16-0173-05
doi:10.7506/spkx1002-6630-201316035
收稿日期：2012-11-12
基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目(2011BAK10B03)；天津市科技计划项目(10SYSYJC28300)
作者简介：张洁琼(1987—)，女，硕士研究生，研究方向为食品安全检测。E-mail：afuhan200694@163.com
*通信作者：王硕(1969—)，男，教授，博士后，研究方向为食品安全。E-mail：s.wang@tust.edu.cn
树坚果是世界公认的八大主要食品过敏原之一，而
杏仁是世界范围内最受欢迎的树坚果类之一，在树坚果
类产品中产量排名第一 [1]。杏仁属蔷薇科李属植物或是
山杏的种子，富含多种营养成分，所以常被用作食品配
料，也因此增加了杏仁过敏人群接触的可能性[2]。
苦杏仁球蛋白是具有高度水溶性的球蛋白，称为
amandin或AMP [3-4]。苦杏仁球蛋白占杏仁种子可溶性蛋
白的65%[5]，其中包含有杏仁过敏人血清IgE识别的主要
反应多肽，是杏仁的主要过敏原，SDS-PAGE分析得出
苦杏仁球蛋白不是单一的多肽链，而是由两组分子质量
在38～41kD和20～22kD范围内的多肽链组成[6-7]。
食品过敏原标识是目前避免敏感人群受到食物过敏
威胁的有效办法[8-9]，而建立有效的过敏原检测方法是过
敏原安全管理的技术保障。目前杏仁过敏原检测方法主
要有聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)法
和免疫分析方法。张霞等[10]建立了杏仁蛋白的荧光PCR
法，特异性高，能检测食品中5～10mg/kg的杏仁蛋白，
灵敏度较好。Martin等[2]建立的基于兔多克隆抗体的竞争
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay，
ELISA)方法的检测限为300µg/L，同时建立的非竞争
ELISA方法可以检测到1～10µg/L杏仁过敏原。Roux等[11]
建立的基于多克隆抗体的间接竞争ELISA检测方法，检
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测限可达到(87±16)µg/L。检测大分子物质，如蛋白质、
微生物时，双抗体夹心ELISA法的灵敏度明显高于竞争
ELISA[12-14]，现有的过敏原商品化试剂盒也都采用双抗体
夹心ELISA法的测定模式。由于易感个体的过敏阈值尚
不能明确，痕量过敏原也有可能引起严重的过敏反应，
而现有检测产品包括德国R-Biopharm公司、北京Biostest
公司以及美国Neogen公司的杏仁过敏原ELISA试剂盒，
检测范围为1.7～20mg/kg，无法完全满足痕量杏仁过敏
原残留的检测需求，因此开发更高灵敏度的杏仁过敏原
检测方法具有重要意义。
本实验拟制备中国甜杏仁苦杏仁球蛋白的抗体，建
立基于多克隆抗体的夹心ELISA方法，以期能有效应用
于食品中苦杏仁及美国大杏仁过敏原的快速检测。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新西兰白兔，BALB/c小鼠 天津市奥臣实验动物
销售有限公司；苦杏仁、甜杏仁产自河北涿鹿；美国大
杏仁(Amygdingus comnnis)产自美国加利福尼亚州，由美
国食品和药物管理局提供；花生、法式小面包、脱脂牛
乳、饼干等购自天津超市。
弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、牛血清蛋白(BSA)、
羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记物、羊抗鼠IgG辣根过氧化
物酶标记物、脱脂乳粉、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、过
氧化氢脲(CH6N2O3)、BCA试剂盒 美国Sigma公司；二
甲基亚砜 德国Merck公司；Protein A-Sepharose 4B、
Protein G- Sepharose 美国Amersham公司；其他化学试
剂(均为分析纯) 天津化学试剂六厂。
1.2 仪器与设备
Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司；冷冻离心
机、微量可调移液器 德国Eppendorf 公司；全波长酶
标仪 美国Thermo公司；蛋白纯化仪、蛋白电泳仪 美
国Bio-Rad公司；摇床、加热磁力搅拌器 德国IKA公
司；96孔酶标板 丹麦Nunc公司；透析袋 德宇生物
技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 杏仁过敏原苦杏仁球蛋白的制备
取50g甜杏仁研磨成粉末，加正己烷(1:10，g/mL)，
室温条件下脱脂3h，抽滤除有机溶剂，重复脱脂1次。
通风挥干残余正己烷，得脱脂杏仁粉。取上述脱脂杏仁
粉，加含0.02% NaN3的双蒸水(1:30，g/mL)提取杏仁蛋白
1h，混合物6000×g离心10min，重复提取2次，收集离心
上清液，4℃放置12～14h后得乳状白色溶液，高速离心
得到白色沉淀为目的蛋白苦杏仁球蛋白，将沉淀溶于磷
酸盐缓冲液(pH7.4)中，双蒸水室温透析9h，冷冻干燥得
苦杏仁球蛋白[7]。
1.3.2 杏仁过敏原苦杏仁球蛋白的鉴定
SDS-PAGE的具体操作按照黄建华等[15]所述并稍作
修改。选择15%分离胶，6%浓缩胶；苦杏仁球蛋白溶液
的含量调整为1mg/mL，与上样缓冲液、β-巯基乙醇的体
积比为5:4:1；样品与预染Marker分别100℃沸水浴8min，
每孔上样量为5µg；恒压80V，电泳2h；凝胶染色过夜，
脱色液脱色20min，凝胶成像。
1.3.3 多克隆抗体的制备
苦杏仁球蛋白溶解于0.9%的生理盐水，与等体积的
弗氏完全佐剂(加强免疫采用弗氏不完全佐剂)充分乳化
后，分别免疫新西兰白兔和BALB/c小鼠，兔免疫剂量为
1mg/只，小鼠的免疫剂量为100µg/只。每2周免疫1次，
分别于第3、4、5次免疫后的7～10d内取血清测定抗体效
价，末次免疫后采全血，离心处理后收集全部血清，分
装后于20℃保存[16-17]。兔血清通过Protein A-Sepharose
4B柱纯化，鼠血清通过Protein G-Sepharose纯化，加入等
体积甘油，20℃保存。
1.3.4 双抗体夹心ELISA方法
包被：纯化后的兔抗杏仁蛋白抗体经包被液稀释
包被于酶标板，100µL/孔，4℃孵育12～16h后弃去孔中
液体，用PBST洗板3次，每次2min；封闭：加入封闭
液200µL/孔，37℃封闭1h后弃去封闭液，用PBST洗板3
次，每次2min；加样：加入梯度稀释的苦杏仁球蛋白溶
液，100µL/孔，室温孵育1h后弃去孔中液体，用PBST洗
板4次，每次2min；加检测抗体：PBS稀释鼠抗体，加
入酶标板100µL/孔，室温孵育1h，PBST洗板4次，每次
2min；加酶标二抗：HRP标记的羊抗鼠二抗经PBS稀释
(1:20000，V/V)，加入酶标板100µL/孔，室温条件下反应
30min，PBST洗板5次，每次2min；显色：提前15min配制
底物溶液，每孔中加入100µL，室温暗处显色20min；终
止：每孔加50µL终止液(1.25mol/L的H2SO4溶液)；读数：
在双波长方式(450～650nm)处用酶标仪读取吸光度。
根据测量得到的吸光度，绘制吸光度与蛋白质量浓
度的曲线。
1.3.5 抗体的特异性
选择常见易致敏食品(松子、榛子、核桃、腰果、
花生、葵花籽、西瓜籽、大米、小麦、大豆、玉米、绿
豆、鸡蛋、牛乳)检测抗体的特异性。大豆和坚果类食品
松子、核桃、腰果、花生、葵花籽、西瓜籽过敏原蛋白
属cupin superfamily，均为种子贮藏球蛋白，是水溶性蛋
白[18]，参照1.3.1节杏仁脱脂方法脱脂，用含0.02% NaN3
的双蒸水以1:30(g/mL)提取粗蛋白，纯化具体步骤分别参
照文献[19-21]。牛乳和鸡蛋过敏原蛋白的提取方法参照
陈寅[22]所述方法。玉米[23]、小麦[24]、大米[25]、绿豆[26]提
取过敏原蛋白后，利用BCA试剂盒进行蛋白定量。过敏
原蛋白经PBS稀释成10、1、0.1mg/L，以PBS作为阴性对
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照，用建立的双抗夹心法检测。交叉反应物孔的吸光度为
P，阴性孔吸光度为N，如P/N＞2时，说明抗体对此蛋白有
交叉。
1.3.6 ELISA方法的应用
1.3.6.1 不同杏仁品种的检测
按照1.3.1节方法分别提取苦杏仁及美国大杏仁中
的过敏原苦杏仁球蛋白。美国大杏仁的苦杏仁球蛋白
用PBS从5mg/L开始2倍梯度稀释，苦杏仁的苦杏仁球
蛋白从2mg/L开始2倍梯度稀释。以优化好的甜杏仁夹心
ELISA方法分别检测苦杏仁以及美国大杏仁中的苦杏仁
球蛋白，并绘制标准曲线。
1.3.6.2 实际样品中苦杏仁球蛋白的添加回收实验
选择超市中3种标签上标注未含有杏仁过敏原的面
包、饼干及脱脂牛乳，取1g上述样品，添加3个不同含
量(10、5、200µg/kg)的杏仁过敏原蛋白，以1:10(g/mL)
PBST提取样品中的蛋白，样品经10621×g离心20min，
过0.45μm纤维素膜。同时用建立的双抗体夹心ELISA检
测，计算得出样品中苦杏仁球蛋白的实际检测质量浓
度，并按照以下公式计算回收率。
h100=
㲟ⱑ⧚䆎⏏ࡴ /ؐ(µg/L)
㲟ⱑᅲ䰙Ẕ⌟ /ؐ(µg/L)
ಲᬊ⥛/%
2 结果与分析
2.1 苦杏仁球蛋白的鉴定
苦杏仁球蛋白是杏仁中主要的水溶性蛋白，由两组
不同分子质量的多肽组成(38～41kD和20～22kD)。分子
质量范围20～22kD的多肽是苦杏仁球蛋白的碱性多肽
链，38～41kD的是酸性多肽链[6]。本实验制备的苦杏仁
球蛋白经SDS-PAGE电泳，染色条带显示蛋白主要由两
部分多肽组成，分子质量分布范围与文献[5,10]报道一致
(图1)，可见所提蛋白即为苦杏仁球蛋白，且纯度较高。
116kD
66.2kD
45kD
35kD
25kD
18.4kD
14.4kD
M 1
M. Marker；1.苦杏仁球蛋白。
图 1 苦杏仁球蛋白的SDS-PAGE电泳图
Fig.1 SDS-PAGE of amandin from sweet apricot kernel
2.2 抗体的制备和纯化
按照1.3.3节多克隆抗体的制备过程，经5次免疫
后，最终获得BALB/c小鼠和新西兰白兔的抗血清效价
分别为1:81000和1:500000。鼠和兔抗血清分别经Protein
G-Sepharose和Protein A-Sepharose 4B层析柱纯化，所得
抗体质量浓度分别为0.63mg/mL和2.4mg/mL，与甘油1:1
混合均匀(V/V)，20℃保存备用。
2.3 双抗体夹心ELISA条件的优化
2.3.1 封闭液及捕获抗体的选择
针对基于多克隆抗体的双抗体夹心ELISA法，非特
异性吸附引起的背景颜色较深，同时由于夹心ELISA方
法检测限的定义与空白值的大小紧密相关，因此首先试
图通过封闭液的优化来降低空白值。本实验优化了不同
包被抗体在包被量相同的条件下BSA、明胶、乳粉、酪
蛋白等封闭液对空白值的影响，结果见表1。
表 1 双抗体夹心ELISA封闭液及捕获抗体的选择
Table 1 Selection of optimal blocking buffer and capture antibody for
sandwich ELISA
封闭液 甜杏仁双抗体夹心ELISA空白A450～650nm包被兔多抗 包被鼠多抗
0.5%乳粉 0.154 0.158
1%乳粉 0.246 0.257
5%乳粉 0.169 0.199
1%BSA 0.219 0.189
1%明胶 0.212 0.201
0.5%酪蛋白 0.302 0.345
0.5%鱼皮胶 0.363 0.446
由表1可知，捕获抗体的选择对空白值的影响不是很
明显。上述7种封闭液中，0.5%乳粉的封闭效果较好，
因此本实验选择捕获抗体为兔抗苦杏仁球蛋白多克隆抗
体，检测抗体为鼠抗苦杏仁球蛋白多克隆抗体，封闭液
为0.5%乳粉。
2.3.2 捕获抗体包被量和检测抗体浓度的优化
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 50 100 150 200 250 300
甜杏仁过敏原蛋白质量浓度/(mg/L)
A 4
50
～
65
0n
m
1.0μg/ᄨ(R2=0.9894)
0.5μg/ᄨ(R2=0.9769)
0.1μg/ᄨ(R2=0.9893)
0.05μg/ᄨ(R2=0.9942)
图 2 捕获抗体包被量对甜杏仁双抗体夹心ELISA检测的影响
Fig.2 Effect of capture antibody coating quantity on the assay of sweet
apricot kernel by the sandwich ELISA
在双抗体夹心ELISA检测方法中，捕获抗体的包被
量直接影响检测的灵敏度，为了获得最佳的测定条件和
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更高的灵敏度，选择0.05、0.1、0.5、1.0μg/孔作为捕获
抗体包被量，4℃包被过夜，固定其他实验条件，绘制检
测曲线图，结果如图2所示，包被量为0.05μg/孔时曲线空
白值最低，线性最好。
以优化后的包被量包板，将检测抗体稀释成不同质
量浓度，固定其他条件，绘制检测曲线图，选择曲线线
性部分作趋势线，结果如图3所示，加入甜杏仁检测抗体
的量为0.01μg/孔时，曲线线性相关性最好(R2=0.9938)，
且抗体使用量较少。
0.03μg/ᄨ(R2=0.9856)
0.015μg/ᄨ(R2=0.9932)
0.01μg/ᄨ(R2=0.9938)
0.0075μg/ᄨ(R2=0.9763)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 100 200 300 400 500 600
⫰ᴣҕ䖛ᬣॳ㲟ⱑ䋼䞣⌧ᑺ/(mg/L)
A 4
50
～
65
0n
m
图 3 检测抗体稀释倍数对甜杏仁双抗体夹心ELISA检测的影响
Fig.3 Effect of antibody dilution factor on the assay of sweet
apricot kernel by the sandwich ELISA
2.3.3 样品稀释液pH值和离子强度的优化
在相关文献中还未发现涉及到样品稀释液离子强度
和pH值的优化。样品稀释液的离子强度和pH值对蛋白的
活性有一定影响，适宜的离子强度和pH值能极大地提高
检测灵敏度。优化结果见表2。
表 2 样品稀释液pH值和离子强度对双抗体夹心ELISA检测的影响
Table 2 Effect of pH and ionic strength of PBS on the assay of sweet
apricot kernel by the sandwich ELISA
磷酸缓冲液优化 平均LOD/(µg/L) R2
离子强度/
(mol/L)
0(双蒸水) 81.71 0.9454
0.1 9.02 0.9949
0.3 20.08 0.9911
0.5 82.24 0.9910
pH
8.5 18.46 0.9799
7.4 9.02 0.9919
5.7 6.36 0.9989
由表2可知，样品稀释液(PBS)的离子强度为0.1mol/L
时，得到的标准曲线线性最好，R2=0.9949，检出限(limit
of detection，LOD)为9.02µg/L，因此选择离子强度为
0.1mol/L的磷酸盐缓冲液作为样品稀释液。由实验结果可
知样品稀释液的离子强度过高或过低都会影响待测蛋白
的活性，从而引起抗原抗体反应的变化。选择不同pH值
的0.1mol/L磷酸盐缓冲液对样品进行稀释，发现当pH5.7
时，检出限为6.36µg/L，线性也最好，R2=0.9989。这可
能是pH值影响了杏仁过敏原蛋白的结构，从而改变了苦
杏仁球蛋白与抗体间的亲和性。Martin等[2]也发现在不
同pH值反应体系中，苦杏仁球蛋白与抗体的亲和力有所
差异，而该差异是由苦杏仁球蛋白中的酸碱性多肽引起
的。本实验中苦杏仁球蛋白与抗体的免疫亲和力在pH5.7
时为最佳，推测此时是苦杏仁球蛋白的酸性肽链在识别
抗体过程中占主要地位。实验最终选择pH5.7、0.1mol/L
的磷酸盐缓冲液作为样品稀释液。
2.4 双抗体夹心ELISA标准曲线的绘制
采用优化后的双抗体夹心ELISA对梯度稀释的苦
杏仁球蛋白溶液进行检测。以苦杏仁球蛋白质量浓度
为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，
得到线性方程为y = 0.0007x＋0.045，R2=0.9986。LOD
定义为空白加3倍标准偏差对应的苦杏仁球蛋白质量浓
度，定量限(limit of quantification，LOQ)定义为空白加
10倍标准偏差对应的苦杏仁球蛋白质量浓度，依据定义
计算得该方法的LOD值为(6.36±1.02)µg/L，LOQ值为
(16.63±3.41)µg/L。该夹心ELISA的检测灵敏度明显高于
文献报道的其他间接ELISA检测方法，也明显高于市售
杏仁过敏原ELISA试剂盒。
2.5 交叉反应
本实验选择了7种树类坚果(松子、榛子等)与7种非
坚果类食物(大米、小麦等)作交叉反应实验，PBS作为阴
性对照，用建立的双抗夹心法测定10、1、0.1mg/L的食
物蛋白，结果见表3。在交叉反应物质量浓度高达10mg/L
时，P/N值仍均小于2，交叉反应结果说明所建立的检测
方法特异性良好。
表 3 双抗体夹心ELISA检测方法与常见食品的交叉反应
Table 3 Cross-reactivity of selected common foods in the
sandwich ELISA
交叉反应物 P/N值0.1mg/L 1mg/L 10mg/L
松子 0.97 1.01 1.60
榛子 0.97 0.99 1.20
核桃 0.87 0.87 0.99
腰果 0.90 0.97 1.03
花生 0.89 0.94 0.98
葵花籽 0.99 1.01 1.04
西瓜子 0.93 0.91 0.97
大米 1.19 0.90 1.22
小麦 1.18 0.90 1.04
大豆 0.89 0.99 1.12
玉米 0.88 0.85 0.84
绿豆 0.81 0.81 0.81
鸡蛋 0.90 0.88 0.92
牛乳 1.13 0.88 0.85
2.6 ELISA方法的应用
2.6.1 不同杏仁品种的检测
为评价所建立的双抗夹心ELISA检测方法对不同品
种的杏仁过敏原的适用性，对购买的苦杏仁及美国大
※分析检测 食品科学 2013, Vol.34, No.16 177
杏仁中过敏原蛋白进行检测，结果如表4所示。该方法
对苦杏仁及美国大杏仁的检测限分别为(12.11±1.70)、
(18.95±1.52)µg/L，而且检测曲线的线性相关系数较高，
因此该ELISA方法能很好地检测苦杏仁及美国大杏仁中
的苦杏仁球蛋白。
表 4 双抗夹心ELISA检测方法对不同杏仁品种的LOD值及R2
Table 4 Detection limits and R2 of amandin in almond and apricot
kernel by the sandwich ELISA
苦杏仁 甜杏仁 美国大杏仁
LOD/(µg/L) R2 LOD/(µg/L) R2 LOD/(µg/L) R2
12.11±1.70 0.9966 6.36±1.02 0.9968 18.95±1.52 0.9928
注：LOD 是 x±s，n=3。
2.6.2 实际样品中苦杏仁球蛋白的添加回收实验
表 5 实际样品中苦杏仁球蛋白的添加回收实验
Table 5 Recovery of amandin in spiked samples by the
sandwich ELISA
理论加标量/
(µg/kg或µg/L)
平均回收率/%
面包 饼干 脱脂牛乳
1000 78.94±2.78 87.88±2.01 87.49±3.93
500 105.63±5.81 108.14±4.39 125.15±2.73
20 115.17±3.00 119.56±3.23 105.33±1.39
注：平均回收率值是 x±s，n=3。
由表5可知，该ELISA方法得到杏仁添加的平均回收
率范围在(78.94±2.78)%～(125.15±2.73)%，添加回收的
相对标准偏差均低于5.81%，说明该检测方法的准确度较
好，且该样品处理的方法简单易操作，同时可以消除样
品基质影响，能够用于实际样品中苦杏仁球蛋白的有效
检测。
3 结 论
本实验建立了基于中国甜杏仁过敏原蛋白苦杏仁
球蛋白多克隆抗体的双抗体夹心ELISA检测方法，检测
苦杏仁球蛋白的LOD值和LOQ值分别为(6.36±1.02)、
(16.63±3.41)µg/L，具有较高灵敏度，且该方法与14种
常见的植物性食物蛋白(如花生、小麦等)没有任何交叉
反应，具有良好的特异性。同时此方法能有效检测低至
(12.11±1.70)µg/L的苦杏仁过敏原蛋白及(18.95±1.52)µg/L
的美国大杏仁过敏原蛋白。利用该方法检测市场上3种不
含杏仁的法式小面包、饼干、脱脂牛乳，建立了有效的
样品前处理方法，以PBST 1:10(g/mL)提取样品中的蛋白
质，10621×g离心20min，上清液过0.45μm纤维素膜，能
有效消除基质影响，得到的苦杏仁球蛋白平均添加回收率
为(78.94±2.78)%～(125.15±2.73)%，说明该方法准确度
较好，可用于食品中杏仁过敏原蛋白的快速准确检测。
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Symposium: pediatric food allergy[J]. Pediatrics, 2003, 111(6):
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