全 文 ： 工艺研究
指纹图谱在驱虫斑鸠菊澄清工艺中的应用■
新疆维吾尔自治区人民医院临床药学研究所(乌鲁木齐 830001) 于鲁海 徐建国 李燕菊 孙 力 尚 靖
摘 要:目的:探讨建立驱虫斑鸠菊的澄清工艺。方法:采用正交试验设计 ,以 HPLC 指纹图谱色谱峰的变化为指标 , 应用多
指标试验公式评分法考察驱虫斑鸠菊的澄清条件。结果:驱虫斑鸠菊水提取液的澄清条件为:在 ZTC1+1 澄清剂加入前先
调节驱虫斑鸠菊提取液的 pH=7.0 ,澄清剂的加入顺序为先加入 0.5%(g/mL)澄清剂 B 溶液再加入 1.0%(g/mL)澄清剂 A
溶液 ,澄清剂 B 和 A的最佳用量分别为 2.0%(V/V)和 0.5%(V/ V), 反应温度分别为(80±1)℃和(60±1)℃, 反应时间分别
为 2h。结论:该工艺是可行的。
关键词:驱虫斑鸠菊;正交试验;HPLC 指纹图谱;多指标试验:公式评分法:澄清工艺
中图分类号:R291.5 文献标识码:B 文章编号:1006-6810(2007)06-0057-03
驱虫斑鸠菊(Vernonia anthelmintica Willd.)为菊科一年
生草本植物 , 在中国新疆 、巴基斯坦 、印度等地已有数百年
的使用历史 ,是新疆维吾尔医的习用药材。作为药用部位
的驱虫斑鸠菊成熟果实 ,具有清除异常黏液质 、驱虫 、消肿 、
散寒止痛的作用 , 用于治疗湿寒性胃痛 、肝病 、白癫风等
症〔1〕。经药效筛选 , 发现其可能的治疗白癫风的活性部位 ,
并建立了驱虫斑鸠菊活性部位的 HPLC 指纹图谱 , 其中紫
铆素作为参照物。本实验采用正交试验设计 , 以其活性部
位的HPLC 指纹图谱色谱峰峰面积的变化作为考察指标 ,
通过多指标试验公式评分法探讨驱虫斑鸠菊水提取液的澄
清工艺。
1 材料和仪器
驱虫斑鸠菊成熟果实采自新疆阿克苏地区扎木台乡 ,
经北京医科大学药学院天然药物教研室艾铁民教授鉴定 ,
为菊科植物驱虫斑鸠菊(Vernonia anthelmintica Willd.);紫铆
素对照品(自制 , 色谱纯度大于 99.0%);ZTC-预处理剂及
ZTC-Ⅳ型澄清剂(天津正天成澄清技术有限公司):乙脂
为色谱纯 ,其余试剂均为分析纯。
Agilent 1100 高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);电子
天平(德国 Sartorius)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件色谱柱:ZORBAX SB -C18(4.6＊250mm ,
5μm),流动相:乙腈-0.02M 磷酸盐缓冲液(梯度洗脱), 流
速:1.0ml/min ,检测波长:280nm , 柱温:室温 , 进样量:20μl。
2.2 驱虫斑鸠菊水提取液的制备:称取驱虫斑鸠菊成熟果
实适量 ,置于圆底烧瓶中 , 加入8 倍量水 , 浸泡1.0h , 回流提
取 3次 , 每次 1.0h ,过滤 , 合并滤液 ,按 1:10 比例水浴浓缩 ,
备用。
2.3 驱虫斑鸠菊水提取液的澄清过程
2.3.1 ZTC-Ⅳ型澄清剂配制:1.0%(g/ mL)澄清剂 A 溶
液:取 A组分加少量去离子水 , 搅拌成糊状 ,加去离子水至
■[ 基金项目] 国家高技术研究发展计划项目(2002AA2Z3226)
足量 ,溶胀 24h以上 , 备用。
0.5%(g/ mL)澄清剂 B 溶液:取 B 组分加少量 0.5%
(V/V)醋酸溶液 ,搅拌成糊状 , 加 0.5%醋酸溶液至足量 ,溶
胀 24h 以上 ,备用。
2.3.2 澄清液制备:量取驱虫斑鸠菊水提取液 150ml , 按正
交表(表 1)的设计要求 , 用稀盐酸溶液或 0.1mol L 的氢氧
化钠溶液调 pH;在提取液中加入适量预处理剂 A , 直接煮
沸 ,温度降至(55±1)℃后 , 加入同量的预处理剂 B , 恒温
6h , 取出 ,煮沸 15min , 放置;在(80±1)℃下搅拌加入澄清剂
B溶液适量 , 恒温 2h , 且每隔 30min 缓慢搅拌 1 次 , 2h 后降
温至(60±1)℃, 缓慢搅拌加入适量澄清剂 A 溶液 , 恒温
2h , 每隔 1h搅拌 1 次 , 2h 后取出冷却 , 用去离子水补至足
量 ,备用。
2.3.3 供试液制备:上述溶液以 3000r/min 离心 10min , 移
取上清液供测定用。
2.3.4 正交试验设计:根据预试验结果 ,选出处理前 pH 值
(A)、预处理剂用量(B)及澄清剂用量(C)等 3 因素 , 每个因
素采用 4水平进行试验 , 从所获样品的 HPLC 图谱中根据
指纹图谱指定的色谱峰对数据进行提取 、处理 ,并将处理后
数据采用多指标试验公式评分法进行评定 , 优化澄清工艺
的条件。正交试验表见表 1。
表 1 因素水平表
水平
因 素
pH
(A)
预处理剂
%A:%B
(B)
ZTC用量
0.5%B:1.0%A
(C)
(D)(E)
1 不调 pH 0:0 0:0
2 4.0 0.2%:0.2% 2.0%:0.5%
3 7.0 0.4%:0.4% 4.0%:1.0%
4 10.0 0.1%:0.1% 6.0%:1.5%
2.4 数据处理:用多指标试验公式法〔2〕进行数据处理。以
Xi j表示第 i次试验中第 j个指标的测定值(即 Xij表示正交
试验的第 i次试验的色谱图中第 j个色谱峰峰面积值 ,其中
572007年 6 月第 6期 中国民族医药杂志
DOI :10.16041/j.cnki.cn15-1175.2007.06.041
在正交试验各次试验的色谱图中所选定的色谱峰是根据活
性部位指纹图谱而确定的 , 它们相对应的色谱峰的相对保
留时间是一致的), i=1 , 2…n;j=1 , 2…k。 首先以各指标的
最大值各色谱图中同一相对保留时间的各色谱峰中峰面积
值最大者)作为参照对同一指标各数据进行标准化处理 ,
Di j表示第 j个指标下的第 i个测定值的标准化数据。
Di j=100×Xi j (Xj)max [ 1]
再按各指标的重要程度和各组数据的相对标准差确定
另权系数。以 SDj 表示第 j个指标下 Dij的标准差 , 以 RSDj
表示第 j个指标的相对标准差 , 则根据各指标相对标准差
赋权为 RSD RSDj ,其中 RSD为指定指标(参照物紫铆素)的
相对标准差;根据各指标的重要程度赋权为 E j , 由于指纹
图谱中的各个色谱峰(群)所代表的各组分(群)对药效结果
的贡献大小不明确 , 故认为均很重要 , 设为 1;所以结合各
指标的重要程度和各组数据的相对标准差确定的权重系数
为 Fj=Ej＊RSD RSDj 其中 j=1 , 2…k。 [ 2]
因此 ,多指标试验公式为:
Pi=(Fj×Di j Fj i=1 , 2…n;j=1 , 2…k; [ 3]
[ 3]式计算所得的兼顾各指标综合效应的公式分越大
越好。结果见表 2 ,方差分析见表 3。
表 2 L16(45)正交试验设计表及结果
实验号
因素 评价指标
A B C D E 综合评分 Pi
1 1 1 1 1 1 0.927
2 1 2 2 2 2 0.736
3 1 3 3 3 3 0.645
4 1 4 4 4 4 0.679
5 2 1 2 3 4 0.765
6 2 2 1 4 3 0.774
7 2 3 4 1 2 0.763
8 2 4 3 2 1 0.784
9 3 1 3 4 2 0.793
10 3 2 4 3 1 0.673
11 3 3 1 2 4 0.847
12 3 4 2 1 3 0.820
13 4 1 4 2 3 0.582
14 4 2 3 1 4 0.622
15 4 3 2 4 1 0.699
16 4 4 1 3 2 0.692
k1 2.986 3.067 3.240 3.132 3.083
k2 3.087 2.805 3.020 2.950 2.985
k3 3.133 2.955 2.845 2.774 2.821
k4 2.596 2.974 2.697 2.946 2.913
k＊4 0.537 0.262 0.543 0.358 0.262
表 3 试验公式评分方差分析表
方差来源 离均差平方和 自由度 均方 F值 P 值
A 0.0448 3 0.0149 3.585 0.0867
B 0.0088 3 0.0029 0.7027 0.5842
C 0.0411 3 0.0137 3.264 0.1013
误差(D+E) 0.0282 6 0.0042
直观分析表明:在所选因素水平范围内 , 按多指标试
验公式评分法判定 , 澄清剂 (因素 C)和酸碱度 (因素
A)的使用对指纹图谱中的色谱峰 (群)的影响最大 , 预
处理剂 (因素 B)的影响最小。以空白列 D 和 E作为误差
项进行方差分析 , 结果表明:因素 A 和因素 C 为主要影
响因素 , 但三个因素均无统计学意义(P>0.05)。 结合澄
清效果综合考虑 , 对驱虫斑鸠菊提取液调节酸碱度 ,不使用
预处理剂 ,但考虑到澄清效果 , 使用澄清剂。处理过程:对
驱虫斑鸠菊提取液调节 pH=7.0 ,加热至(80±1)℃下搅拌
加入 2.0%(V/ V)的 0.5%澄清剂 B 溶液 , 恒温 2h , 且每隔
30min 缓慢搅拌 1次 , 2h后降温至(60±1)℃,缓慢搅拌加入
0.5%(V/ V)的 1.0%澄清剂A 溶液 ,恒温 2h , 每隔1h搅拌 1
次 , 2h 后取出冷却。
3 讨 论
中药化学成分的组成和治疗机理均较复杂 , 依靠单一
指标进行工艺优化所获物质组成未必能达到按中医理论指
导下的用药目的。中药活性部位指纹图谱的建立可能实现
对其物质组成的全面控制 , 若能构建正确合理的谱效关系 ,
则以所建立的指纹图谱作为中药活性物质工艺筛选的引导
对象 ,所得物质可能更符合中医整体观念下的用药目的 ,因
此利用所建立的指纹图谱作为分析对象进行工艺筛选所获
物质组成可能比单一指标筛选所获物质更能保证中药临床
使用的有效性。
本实验以所建立的指纹图谱为模板 , 对驱虫斑鸠菊澄
清工艺进行筛选。在筛选过程中 , 对各试验样品所获 HP
比图谱进行分析 ,对符合指纹图谱要求的各色谱峰数据按
越大越优的原则在多指标试验公式中以相加形式处理 , 对
于样品的 HPLC 图谱中出现的非共有峰或在指纹图谱中有
相应色谱峰 ,但峰面积高过一定比例 ,则按越小越优的原则
在评分公式中以相减的形式出现。另外 , 关于提取物中如
何保持物质组成比例稳定的问题 , 考虑到批批药材间存在
的差异以及生产实践中提取物可采取“混批勾兑”的做法 ,
因此在以指纹图谱为模板进行工艺筛选时 , 未考虑各共有
指纹峰面积比值的稳定 , 仅以兼顾各色谱峰的公式分越大
越好作为评定指标。
参考文献
〔1〕中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国
58 中国民族医药杂志 2007 年 6月第 6 期
卫生部药品标准·维吾尔药分册〔S〕.新疆:新疆科技卫
生出版社 , 1999:47.
〔2〕韩可勤 ,杨静化 , 刘晓东.药学应用概率统计〔M〕.南京:
东南大学出版社 , 2000:130.
2007年 5 月 8 日收稿
Application of fingerprint on clarifying techniques for
Vernonia anthelmintica Willd.
Yu Lu hai Xu Jian guo Li Yan ju Sun Li Shang Jing
(The Clinical Medical Instiute of Xingjiang ,Urumqi 830001 ,China)
Abstract:Objective:To explore the clarifying techniques for Vernonia anthelmintica Willd..Method:The clarifying
techniques was studied by multi-index test experiment formula evaluation and orthogonal design ,which took change of
peak area inHPLC fingerprint of active part for Vernonia anthelmintica Willd.as indices.Result:The optimum clarify-
ing procedure was:The pH of water-extracting for Vernonia anthlmintica Willd.was adjusted to 7.0 before using
ZTC1+1 natural clarifying agent;the adding sequence of clarifying agent was 0.5%(g mL)B solution before 1.0%
(g mL)A solution;its optimum amount was 2.0%(V V)B solution and 0.5%(V V)A solution;the clarifying tem-
perature after adding B solution and A solution was(80±1)℃ and (60±1)℃, respectively;and the clarifying time
was 2 hours each.Conclusion:The clarifying techniques of Vernonia anthelmintica Willd.was feasible.
Key words:Vernonia anthelmintica Willd.;Orthogonal test;HPLC fingerprint;Multi-index test;Experiment formula
evaluation;clarifying techniques
香附油 β-环糊精的包合工艺研究
湖南湘西自治州人民医院(吉首 416000) 毕 华
摘 要:目的:探讨香附油 β-环糊精(β-CD)的包合工艺条件。方法:利用饱和水溶液法制备包合物 , 针对影响包合物的主
要因素 ,用正交设计法安排实验进行工艺探讨 。结果:探讨出的最佳包合工艺条件为包合温度为 80℃,搅拌时间为 2h ,香附
油 β-环糊精的投料比为 1:6(体积重量比)。
关键词:香附油;β -环糊精;包合物;正交设计法;工艺研究
中图分类号:R29 文献标识码:B 文章编号:1006-6810(2007)06-0059-02
为提高化学稳定性及生物利用度等 , 可用 β-环糊精
来包合中药的挥发油防止散失 , 该技术已得到广泛应
用〔1～ 3〕。香附是中医常用的妇科要药 , 具有疏肝理气 , 调经
止痛之功 , 挥发油是其重要的成分。本实验用 β-环糊精
对香附油进行包合 ,以正交设计法安排实验 , 针对影响其包
合率的 3个主要因素进行了工艺探讨。
1 材料和仪器
1.1 材料:β -环状糊精[ 中国医药(集团)上海化学试剂公
司 ,批号 010610 , 纯度≥99%] ;香附油(自行提取)。
1.2 仪器:JJ-1 增力电动搅拌器(江苏省金坛市恒丰仪器
厂);HH-S 数显恒温水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂);
JPT-1型架盘天平(江苏常熟衡器厂);DZF-6020 型干燥
箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。
2 方法与结果
2.1 香附油的提取:将香附原药材粉碎过 2 号筛 , 利用水
蒸气蒸馏法进行香附挥发油的提取 , 即得挥发油 ,备用。
592007年 6 月第 6期 中国民族医药杂志