全 文 ：广东农业科学 2015 年第 9 期 73
收稿日期：2014-12-16
基金项目：广东省自然科学基金（S2013010012424） ；国
家自然科学基金（31300118，81373320） ；广东省国际合作项目
（2012B050500014） ；广州市科技计划项目（12C14071616） ；国
家公益性行业（农业）科研专项（201203021）
作者简介：陈冠州（1989-），女，在读硕士生，E-mail：
183596784@qq.com
通讯作者：王忠文（1963-），男，副教授，E-ma i l：
wangzwen@126.com
蜘蛛兰红斑病的病原鉴定
陈冠州1，沈会芳2，林壁润1，2，王忠文1，张景欣2，蒲小明2，李培谦1，黄 宁1
（1.广西大学农学院，广西 南宁 530005；2.广东省农科院植物保护研究所，广东 广州 510640）
摘 要：蜘蛛兰具有较好的观赏和药用价值。在广州市区绿化带发现蜘蛛兰叶部红斑病发生严重，影响其正
常生长和美观。为了探清该病害的致病菌，采用病原物组织分离法、柯赫氏法则致病性测定、病原菌培养性状、
形态特征及 β- 微管蛋白（β-tubulin）序列分析等进行分类鉴定，确定了该致病菌为水仙花壳多孢（Stagonospora
curtisii）。该病原菌的确定，可为有效防控该病害提供理论依据。
关键词：蜘蛛兰；红斑病；水仙花壳多孢；病原鉴定
中图分类号：S432.4+4 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2015）09-0073-04
Identification of red spot pathogen of spider lily
CHEN Guan-zhou1，SHEN Hui-fang2，LIN Bi-run1，2，WANG Zhong-wen1，ZHANG Jing-xin2，
PU Xiao-ming2，LI Pei-qian1，HUANG Ning1
（1. Agricultural College of Guangxi University，Nanning 530005，China；
2. Institute of Plant Protection，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China）
Abstract：Spider lily has well ornamental and medicinal value. Spider lily was found being infected with red
spot disease in green belt in Guangzhou，and its normal growth and appearance was severely affected. In order to find
the causes of the disease，the methods of pathogen isolation and Kochs postulates pathogenicity test were adopted to
obtain the pathogen，and the pathogen was identified based on cultural characteristics，mophological characteristics
and sequence analysis of β-tubulin，the results showed that the pathogen was identified as Stagonospora curtisii. The
determination of the pathogen can provide theoretical basis for the prevention and control of red spot disease.
Key words：spider lily；red spot；Stagonospora curtisii；pathogen identification
蜘蛛兰又称为美洲水鬼蕉、蜘蛛百合、海水仙
等，是一种石蒜科蜘蛛兰属多年生球根花卉植物；
原产于热带美洲，主要分布在南美洲和东南亚国家
的热带丛林地区；在我国的广东、广西、福建、云南
和重庆等地也有大面积分布［1］。蜘蛛兰因其容易栽
培、叶色四季常青、花型独特而受到越来越广泛的
种植作为庭院和行道等的绿化［2］。据资料记载，蜘
蛛兰也具有多种药效作用，具有舒筋活血、消肿止
痛之功效，可治风湿关节疼痛、跌打肿瘤、痔疮等
疾病［3-4］。蜘蛛兰已报道的病害有褐斑病、叶枯病、
炭疽病和病毒病［5］。近年报道发现，蜘蛛兰受病原
真菌危害加重，严重影响了蜘蛛兰的观赏价值和药
用价值。刺盘孢属菌（Colletotrichum spp.）、拟盘
多毛孢属菌（Pestalotiopsis spp.）等均可在蜘蛛兰
上危害。2008 年，西南大学谭舒心等对采自重庆不
同地区蜘蛛兰褐斑病病叶标本进行研究发现，该病
害是由刺盘孢（Colletotrichum spp.）和拟盘多毛孢
（Pestalotiopsis spp.）单独或共同引起的［6］；刘雅婷
等对云南昆明市园林花卉进行病毒病的调查和研
究发现，蜘蛛兰上的病害症状表现为沿叶脉出现系
统性黄斑和坏死、同心环纹，该病害是由番茄斑萎
病毒属 Tospovirus病毒引起的病毒病［7］；在广东省
惠州市、云南省昆明市等地均有发现蝴蝶兰炭疽病
的发生危害［8-9］。2014 年，我们在广州市区也发现
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2015.09.019
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较大面积的蜘蛛兰叶部受到一种危害严重的叶斑
病的侵害。本研究系统报道了蜘蛛兰红斑病病原
菌的鉴定方法及分类地位，为病害的防控提供理
论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
蜘蛛兰红斑病叶采自广州市绿化带。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），其制作方法
参照《植病研究方法》［10］。
主要试剂和仪器：FPCB Solution（生工生物工程
（上海）股份有限公司提供）、三氯甲烷、异丙醇，引
物 Bt2a（5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′）
和Bt2b（5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）［11］，
离心机、漩涡振荡器、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像
仪等。
1.2 试验方法
1.2.1 病原菌的分离纯化 病叶组织块经 70% 酒精
中浸泡10 s、0.1%的升汞溶液浸泡 60 s、灭菌水浸洗
3 次，晾干组织块表面水分后将其移到 PDA 培养基
上，28℃培养［10］；分离出菌株，单孢纯化备用。
1.2.2 致病性测定 采用离体叶片接种法。接种前
将健康蜘蛛兰叶片用 70%乙醇擦拭一遍，自然晾干
后，剪成 8 cm 左右的小段，将菌饼接到叶片中部，并
将接种叶片放到垫有滤纸的培养皿内保湿密封。共
接种10 片健康叶片。以接种无菌落琼脂块作为空白
对照。28℃条件下培养，每天观察并记录发病情况。
根据柯赫氏法则，对发病叶片病部进行病原菌再分
离、再接种和观察［12］；
1.2.3 病菌形态学观察 采用 PDA 培养基 28℃条
件下培养，观察并记录好致病菌在 PDA 培养基上生
长的菌落形态特征，显微观察致病菌的产孢结构、
孢子形态和测量孢子大小等［13］。
1.2.4 病菌 β-tubulin 序列分析 （1）提取 DNA：
参照新型植物基因组植物 DNA 提取试剂盒（百
泰克，北京）提供的使用方法进行病原菌 DNA 的
提取。（2）β-tubulin PCR 扩增：PCR 扩增反应体系：
10×EasyTaq Buffer（+Mg2+）5 μL，High Pure dNTPs
4 μL，Bt2a 4（4 μmol/L）1 μL，Bt2b（4 μmol/L）1 μL，
Easy Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.5 μL，Template
DNA 2 μL，ddH2O 36.5 μL，反应总体积 50 μL。PCR
反应程序：94℃预变性 3 min，94℃变性 30 s，57℃
退火 30 s，72℃延伸1 min，共 30 个循环，72℃终延
伸 5 min。（3）PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测
后送上海生物工程服务公司测序。（4）将获得的序
列在 NCBI 的核酸序列库中进行同源性序列比较分
析，用 mafft-6.857.win32、Clustalx 和 MEGA6 软件
将 Z3 扩增得到的微管蛋白基因序列与数据库中已
知菌株相应序列进行聚类分析，确定病原菌的分类
地位。
2 结果与分析
2.1 病害症状
病斑常常始发于叶上半部分，初期是红褐色的
小斑点，病健交界处比较明显，接着扩大成圆形、椭
圆形或不规则病斑；继续扩大后病斑中央呈干枯
状、灰白色，外部呈褐色或红褐色，病斑边缘有黄
色晕圈；后期病斑连成片，呈褐色或黑色，最终导
致叶片病部枯死或整张叶片坏死，病叶脱落（图1，
彩插二）。
2.2 致病性测定
叶片接种菌饼后 7 d，叶片接种部位开始发病，
产生红褐色的小点。接种后 8 d，接种的叶片全部
发病，形成红褐色病斑，与室外植株发病部位症状
一致。对照组叶片无任何症状。从接种后发病叶片
分离获得了培养性状和分生孢子形态与最初分离
物一致的分离物，回接到新鲜健康叶片后致叶片发
病，符合柯赫氏法则，确定该菌为病原菌，菌株编
号为 Z3。
2.3 形态学鉴定
采用 PDA 培养基于 28℃恒温条件下培养该菌
株，其菌落近似等径生长，培养 5 d 后，菌落直径在
6.5~7.0 cm 之间，菌落边缘整齐，贴近培养基的菌丝
基部呈灰色，气生菌丝茂密、细长、无色，后变成灰
色或黑色，菌丝有分隔，菌丝间常发生网结；分生
孢子器球形、扁球形，褐色，分散或集中，埋生或半
埋生长在培养基表面，呈黑色小黑点凸起，直径110
~200 μm；分生孢子梗短，圆柱形、棒状或有时似瓶
梗状，自分生孢子器底层细胞上长出，分生孢子无
色、多数单孢，少数双孢，圆形或椭圆形，孢子长宽
为 5~10 μm × 4~5 μm。根据该病原菌的形态特征，
符合魏景超《真菌鉴定手册》中对水仙大褐斑病病
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菌 Stagonospora curtisii（Berk.）Sacc. 的描述［14］，初步
将其鉴定为 Stagonospora curtisii（图2，彩插二）。
2.4 病原菌 β-tubulin序列分析
经测序，蜘蛛兰叶斑病的病原菌 β-tubulin 片段
长度为 348bp。将菌株的 β-tubulin 序列与 NCBI 中
已有的相关菌株的 β-tubulin 序列进行同源性比较，
结果表明蜘蛛兰叶斑病的病原菌与 Phoma narcissi
（GenBank No.FJ427150.1）菌株的同源性为 98%，
Phoma narcissi是 Stagonospora curtisii的同种异名，
根据形态鉴定结果及 β-tubulin 序列分析结果，将蜘
蛛兰叶斑病的病原菌鉴定为 Stagonospora curtisii，聚
类分析结果见图3。
3 结论与讨论
叶斑病是一种植物叶部较为常见的病害，蔬菜、
水果、粮食、花卉、树木等均会发生叶斑病，但引起发
病的病原物却不尽相同，细菌、真菌、病毒等都有可
能引起叶斑病［15］。本研究中采用形态学和 β-tubulin
序列分析分子鉴定的方法对蜘蛛兰红斑病病原进
行了分离鉴定，探明了引起蜘蛛兰叶斑病的病原分
别为 Stagonospora curtisii。据报道，S. curtisii能引
起朱顶红的红斑病，病害主要发生在叶片和花梗，
也能侵染危害花蕾和球茎鳞片，该病害是一种世
界性病害，在西欧、加拿大、美国、日本和中国等处
都有发生，严重影响了朱顶红的观赏价值和经济价
值［16-17］。此外，S. curtisii也可引起兰花圆斑病和水
仙叶大褐斑病［18］。本研究结果发现，P. narcissi也可
在蜘蛛兰上发生危害，引起红斑病，且危害严重。
Alicja 等研究发现，浓度分别为 6.0 μg/cm3 和
50.0 μg/cm³ 的酚酮和扁柏酚可以抑制 P. narcissi菌
丝的生长［19］；从紫花木薯中提取得到的皂苷混合成
分浓度为 0.1% 时，对 P. narcissi菌丝的抑制率达到
67%［20］；还发现水杨酸（SHAM）可以抑制 P. narcissi
在 PDA 培养基和朱顶红鳞茎的鳞片上生长发展。对
于朱顶红红斑病的防治可以采用无病球根种植、轮
作、及时处理病源等农业防治方法和药剂防治方法，
如 50% 菌核净可湿性粉剂800 倍液、70% 代森锰锌
可湿性粉剂 600 倍液和 40% 嘧霉铵水悬浮剂1 200
倍液等药剂都能达到一定的防治效果，最好是结合
栽种前种球与土壤消毒等综合防治［17］。本研究明确
了蜘蛛兰红斑病的病原菌，对制定病害的防控策略
具有重要意义。
参考文献：
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relationships and possible hybrid origin of lycoris
图 3 基于 β-微管蛋白序列构建蜘蛛兰红斑病病菌的系统发育树
100 Phoma pinodslla AY831517
Phoma pinodslla AY831511
38
68
61
Z3
28
84
95
0.005
98
98
Pevronellaeas sucalyptica GU237562
Pevronellaeas sucalyptica GU237563
Phoma bosysmas FJ427097
Phoma calidophila FJ427168
Phoma sancta FJ427171
Phoma sancta FJ427172
Phoma naycissi FJ427150
Phoma glomsyata EU541426
Phoma glomsyata EU541424
Phoma cof f sas-arabicas FJ427104
Phoma cof f sas-arabicas FJ427105
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（责任编辑 杨贤智）
蜘蛛兰红斑病的病原鉴定(内文73�76页）图版
图2 蜘蛛兰叶斑病病茴菌落、分生孢子器、分生孢子
基于Geoserver的WebGIS在海洋牧场可持续管理中的应用
(内文163�168页）图版
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