全 文 ：麦类作物学报 2005, 25( 5): 10～ 13
Journa l of T riticeae Crops
小麦与窄颖赖草远缘杂交幼胚拯救方法的探讨
李桂英 1 , 王琳清 2 , 施巾帼 2
( 1. 中国农业科学院作物科学研究所 ,农业部核技术与航天育种重点开放实验室 , 北京 100081;
2. 中国农业科学院原子能利用研究所 , 北京 100094)
摘 要: 为了探讨小麦×窄颖赖草杂种幼胚拯救的适宜方法 ,以普通小麦 J-11为母本 ,用经 5Gy、 9Gy
的 60Co-γ射线辐照的窄颖赖草花粉授粉 ,采用胚培养一步成苗法和胚 -愈伤组织二步成苗法两种方法进行幼胚
拯救。结果表明 ,采用胚培养一步成苗法 , 27. 9%的幼胚萌发 ,有的幼胚萌动后不久即停止发育 ,最后死亡 ;有的
幼胚只有胚根或胚芽鞘发育 ;有的幼胚胚根、胚芽鞘发育但胚芽不发育 ;部分幼胚发育成畸形苗 ,部分植株根系
发育不良 ,幼胚成苗率只有 18. 6%。 采用胚 -愈伤组织二步成苗法 ,有 33. 3%的幼胚通过愈伤组织途径获得大
量健壮植株 ,平均每一无性系获得 41株再生植株。说明胚 -愈伤组织二步成苗法是小麦×窄颖赖草杂种幼胚获
得大量植株的理想方法 ,但采用何种拯救方法还要同时考虑研究目的。文中还就这两种幼胚拯救方法的优缺点
及选用原则等进行了讨论。
关键词: 小麦 ;窄颖赖草 ;幼胚拯救
中图分类号: S 334. 3; S 336 文献标识码: A 文章编号: 1009-1041( 2005) 05-0010-04
Approaches to Immature Embryo Rescue in Wide Hybridization
between Wheat and Leymus Angustus
LI Gui-ying1 , WANGLin-qing2 , SHI Jin-guo2
(1. Insti tute of Crop Sciences, CAAS, Key Lab. of Agricultural Nuclear Technolog y
& Aerospace Breeding, M inist ry of Agricultu ral, Beijing 100081, China;
2. Insti tute for Application of Atomic Energy, CAAS, Bei jing 100094, China)
Abstract: In order to explore the most sui table method for rescuing w heat× Leymus angustus immature
embryos, two ways of young embryo rescue, embryo culture and embryo-callus culture, w as compared on
thei r ef fects. The result show ed that 27. 9% embryos germinated when rescued wi th embryo culture;
While only 18. 6% embryos developed to intact plants, some embryos stopped developing af ter g erminat-
ed, or only coleoptile developed, or radicle and coleoptile developed, but plantule didnt develop; some de-
veloped into abnormal plants. 123 regenerated hybrid plants ( 41 plants /clone) w ere recovered by embryo-
callus culture. But as to w hich w ay to be taken, research purpose should be considered. The tw o w ays of
embryo rescue were discussed on thei r advantages and disadvantages and principle of their application.
Key words: Wheat; Leymus angustu; Embryo rescue
在小麦与其近缘种属的远缘杂交中往往由于胚乳发育不良或胚与胚乳间的不亲和性致使胚在早期
停止发育 ,导致远缘杂交失败 [ 1, 2]。利用离体培养技术进行幼胚拯救正是克服这一障碍的有效途径。当远
缘杂交结实率很低或者当利用辐射技术克服杂交不亲和性时 ,幼胚发育可能会受到影响 [3 ] ,选择适宜的
幼胚拯救方法关系到远缘杂交的成败。幼胚拯救的方法主要有两种:一种是胚培养一步成苗法 ,另一种
是胚-愈伤组织培养二步成苗法 [3～ 6 ]。普通小麦与窄颖赖草杂交结实率低 [7, 8 ] ,经过辐射处理 ,结实率可
提高到 10. 9% ,但幼胚获得率只有 3. 9% ,且杂种胚发育不好 [7 ]。本研究同时采用这两种方法进行普通
小麦与窄颖赖草杂种的幼胚拯救 ,旨在比较这两种方法的优劣 ,并选择适宜的幼胚拯救方法。
收稿日期: 2005-01-05 修回日期: 2005-03-23
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 ( 39770457)。
作者简介: 李桂英 ( 1964- ) ,男 ,副研究员 ,博士 ,从事作物诱变遗传育种研究。
1 材料与方法
1. 1 材料
母本为普通小麦 J-11( Trit icum aest ivum , AABBDD, 2n= 42) ,父本为窄颖赖草 (Leymus angustus,
NNNNNNNXXXXXXX, 2n= 84) ,由中国农业科学院作物科学研究所提供。
1. 2 方法
1. 2. 1 播种、辐照及授粉 1999年 3月 10日、 17日、 24日分别将普通小麦 J-11分期播种于中国农业
科学院原子能利用研究所试验农场 ,散粉前 3～ 4 d人工剪颖去雄 ,套袋。取散粉期窄颖赖草穗在标准农
用 60 Co-γ射线辐照室进行辐照 ,辐照剂量为 5 Gy和 9 Gy,剂量率为 0. 86 Gy /min。以普通小麦 J-11为母
本 ,授以经过辐照的窄颖赖草花粉。 授粉后约 1. 5 h及 24 h向每朵小花各滴一滴 75 mg /L的 GA3。
1. 2. 2 幼胚拯救方法 采用胚培养一次成苗法和胚 -愈伤组织二步成苗法两种方法进行幼胚拯救。
胚培养一次成苗法:培养基 (Ⅰ )为 Ms+ 3. 0%蔗糖 , p H 5. 8。
胚 -愈伤组织二步成苗法:愈伤组织诱导培养基 ( II)为 Ms+ 2. 0 mg /L 2, 4-D+ 150 mg /L L-asp+
300 mg /L CH+ 3. 0% 蔗糖 , pH 5. 8;愈伤组织继代培养基 ( III)为 Ms+ 1. 0 mg /L 2, 4-D+ 150 mg /L
L-asp+ 300 mg /L CH+ 3. 0%蔗糖 , pH 5. 8;愈伤组织调控培养基 ( IV)为 Ms+ 4. 0 mg /L 2, 4-D+ 150
mg /L L-asp+ 300 mg /L CH+ 3. 0% 蔗糖 pH 5. 8;愈伤组织分化培养基 ( V)为 M s+ 300 mg /L CH+ 3.
0%为蔗糖 , pH 5. 8(其中 L-asp指 L-天门冬氨酸 , CH指水解酪蛋白 ,Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ为培养基的代
号 )。
幼胚的接种: 取回授粉后 13～ 15 d的杂交穗 ,剥下种子 ,用 70%酒精消毒 30 s后 ,换 0. 1%升汞消
毒 7～ 10 min,无菌双蒸水冲洗 4次 ,在实体解剖镜下解剖每粒种子 ,取出幼胚。将幼胚分别接种于培养
基 I和 II中。
培养与继代: 采用胚培养一步成苗法的 ,先置于 25～ 27℃暗培养直到幼胚萌发 ,然后转到光照条件
下 ( 3 000 lx , 12 h /d) ;用胚 -愈伤组织二步成苗法进行幼胚拯救的 ,将胚培养于 25～ 27℃暗条件。愈伤组
织每 4～ 5周继代一次 (培养基Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ )。
幼胚愈伤组织的分化: 将继代 4次的愈伤组织转入去掉 2, 4-D的分化培养基 (Ⅴ )。分化高峰前 ,将
已分化的小植株或胚状体转入相同的培养基 ,尚未分化的愈伤组织继续分化 ,以便获得更多再生植株。
1. 2. 3 试管苗移栽 打开三角瓶 ,散射光下炼苗 1周后 ,移栽到营养钵中 , 1个月后再移栽到大田 , 1个
月后统计成活率。
2 结果与分析
2. 1 两种幼胚拯救方法的培养反应
2. 1. 1 胚培养一次成苗法 接种 1周后 ,部分幼胚开始萌动 , 3周后部分幼胚发育成完整植株 (图 1a) ,
但植株细弱 ;部分幼胚萌动后不久后即停止发育 ,最后死亡 (图 1b) ;部分幼胚只有胚根或胚芽鞘发育
(图 1c右 ) ;部分幼胚胚根、胚芽鞘发育但胚芽不发育 (图 1c左、中 ) ;部分幼胚发育成畸形苗 (图 1d) ;部
分植株根系发育不良 (图 1e)。
2. 2. 2 胚-愈伤组织二步成苗法 幼胚接种培养 20 d后 ,部分幼胚开始明显愈伤化。 4周后继代培养 ,
继代 4次后 ,部分愈伤组织转入分化培养基 ,部分继续继代培养。将愈伤组织转入分化培养基约 1周后 ,
开始出现绿点 , 2周后分化出部分小植株或胚状体 (图 1f ) , 3周后达到分化高峰。 将已分化的植株或胚
状体转入相同的培养基 ,很快出现发育成健壮的再生植株 (图 1g ) ,余下的愈伤组织也很快发育成健壮
植株 (图 1h)。
2. 2 两种幼胚拯救方法的成功率比较
采用两种方法进行杂种幼胚拯救 ,结果见表 1。胚培养一次成苗法共培养 43个幼胚 ,只有 8个幼胚
最后发育成完整植株 ,幼胚拯救成功率为 18. 61% ,其余未发育或发育畸形。利用胚 -愈伤组织培养法虽
然只培养了 9个幼胚 ,但从 3个幼胚诱导出愈伤组织 ,并建立了杂种愈伤组织无性系 ,通过不断继代培
养 ,转分化后分化出大量小植株 ( 123株 ) ,且植株健壮 ,幼胚拯救成功率为 33. 3%。 说明胚 -愈伤组织培
·11·5期 李桂英等:小麦与窄颖赖草远缘杂交幼胚拯救方法的探讨
养法是普通小麦×窄颖赖草杂种幼胚拯救获得大量杂种植株的适宜方法。
a,胚培养一次成苗法获得的健康杂种幼苗 ,但细弱 ; b,胚培养一次成苗法幼胚拯救时幼胚停止发育而死亡 ; c,利用胚培养一次成苗
法拯救杂种幼胚时 ,胚发育成畸形 ,左 ,只有胚芽鞘发育 ,中、右 ,胚根、胚芽鞘发育 ,但胚芽未发育 ; d,幼胚发育成的畸形苗 ; e,幼胚
发育的小植株根发育不良 ; f ,转分化 2周后的胚性愈伤组织、绿芽及胚状体 ; g,胚状体发育成的小植株 ; h ,愈伤组织发育成的植株 ;
i,移栽到营养钵后 6周的小植株。
a, Slim plan t developed f rom the h ybrid emb ryo; b, Em bryo development stop; c, Hyb rid embryo developed abnormally. Lef t: only
coleoptile developed, middle and righ t: radicle and coleop tile developed , but plantule didnt develop; d, Abnormal plant developed f rom h y-
brid embryo; e, Plant wi th poor root developed f rom hybrid immature embryo; f, Embryoids d ev eloped f rom hybrid callus; g, Plan ts de-
v eloped f rom embryos; h, Plants reg enerated f rom hyb rid callus or embryoids; i , Hybrid plants after 6 w eeks of t ransplantat ion.
图 1 两种幼胚拯救方法的培养效果比较
Fig. 1 Results of two methods of immature embryo rescue
表 1 两种幼胚拯救方法的比较
Table 1 Comparison of two kinds of methods for immature embryo rescue
幼胚拯救方法
Methods for
immature
emb ryo rescue
培养胚数
No. of
embryo
cul tured
萌动胚数
No. of
emb ryos
g erminated
萌发率
Percen tage of
em bryos
germinated
(% )
成苗胚数
No. of
embryo
developed
to plants
成苗率
(% )
Percentage
of embryo
developed
to plants
备注
Remarks
胚培养一次成苗法
Embryo culture
43 12 27. 9 8 18. 61
植株细弱
Plants w ere w eak
胚培养二步成苗法
Embryo-callus culture
9 - - 3 33. 33
每一无性系可获大量植株 ,共获得 123株
123 plants w as obtained
2. 3 两种幼胚拯救方法获得的幼苗移栽成活率比较
经过幼胚拯救获得的试管苗经过炼苗 ,移栽 1个月后统计的成活率列于表 2。经胚培养一次成苗法
进行幼胚拯救获得的 8株小植株仅存活 2株 ,存活率为 25% ;经过胚-愈伤组织培养法获得的 123株小
植株 ,根较多、植株健壮 ,移栽后成活率高 ,达到 89. 4% 。胚培养一次成苗法获得的小植株移栽后生长较
慢 (图 1i左 ) ,而胚-愈伤组织培养法获得的植株移栽后发育较快 (图 1i中、右 )。
·12· 麦 类 作 物 学 报 25卷
3 讨 论
按常规幼胚直接成苗法比胚 -愈伤组织法拯救杂种幼胚应该更容易成苗。因为愈伤组织再生成苗有
一个愈伤分化的过程 ,往往根系分化是制约再生植株形成的关键步骤。 但本研究结果却表明胚 -愈伤组
织法较幼胚成苗法效果好得多 ,是进行小麦×窄颖赖草杂种幼胚拯救的适宜方法 ,究其原因可能是:
表 2 两种幼胚拯救方法获得的幼苗移栽成活率比较
Table 2 Survival rate of plants derived from two
ways of embryo rescue after transplantation
幼胚拯救方法
Methods for
immature
embryo rescue
移栽苗数
No of
plantlets
t ransplanted
成活苗数
No of
plant let s
survived
成活率 (% )
Percentage
of survived
plan ts
胚培养一次成苗法
Embryo culture
8 2 25. 0
胚培养二步成苗法
Emb ryo-callus culture
123 110 89. 4
( 1)杂种幼胚发育不完全 ,一些幼胚虽然能萌
动 ,但未能发育成完整植株。 ( 2)胚愈伤组织特别是
禾谷类植物未成熟胚愈伤组织 ,与其他组织相比 ,分
化能力最强 [6 ]。 ( 3)通过愈伤途径获得的胚状体 ,具
有类似胚的结构 ,没有生根的问题。
利用胚-愈伤组织二步成苗法进行幼胚拯救有
很多优点。 ( 1)可以获得大量再生植株 ,而且植株健
壮 ,移栽成活率高。( 2)杂种无性系可以长时间保存。
( 3)愈伤组织是进行细胞学鉴定的很方便的材料。张
学勇 [9 ]和李桂英等 [10 ]利用远缘杂种的愈伤组织进
行细胞学研究均获得了良好结果。 ( 4)该方法从接种到愈伤 ,再到分化时间较长 ,且杂种愈伤组织生长、
继代较易控制 ,所以基本上不存在试管苗越夏的问题。而利用胚培养一次成苗法进行幼胚拯救时 ,胚培
养后一般很快萌发 ,长成植株 ,所以一般需要越夏处理 ,而越夏过程中部分植株容易死亡。细胞学鉴定往
往也只能等到移栽成活后进行。 综合以上两种拯救方法可以看出 ,利用胚 -愈伤组织二步成苗法进行幼
胚拯救是获得大量远缘杂种植株的理想方法。
但是 ,选用何种方法进行幼胚拯救 ,还需考虑研究目的和具体杂交难易程度等。当运用远缘杂交方
法转移亲缘关系远、不易杂交成功的近缘种属的有益基因时 ,利用胚-愈伤组织二步成苗法进行幼胚拯
救效果较好 ;当亲缘关系较近 ,很容易杂交成功时 ,利用胚培养一次成苗法拯救幼胚比较省工省力。当利
用远缘杂交研究种属间的关系时 ,采用胚培养一次成苗法可能是比较好的选择 ,因为胚 -愈伤组织二步
成苗法培养过程中发生染色体变异的几率较大 ,可能会影响到研究结果 ,而胚培养一次成苗法变异几率
则很小。
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·13·5期 李桂英等:小麦与窄颖赖草远缘杂交幼胚拯救方法的探讨