全 文 ：2014 年 8 月 第 16 卷 第 8 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Aug. 2014 Vol. 16 No. 8
△ ［基金项目］ 国家自然科学基金(81303171，81374065);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1630032013006)
* ［通信作者］ 庞玉新，副研究员，研究方向:南药资源开发与利用;Tel: (0898)23300268，E-mail:pyxmarx@ 126. com
栽培艾纳香单株左旋龙脑和总黄酮含量变异分析
△
于福来1，2，黄梅1，2，庞玉新1，2* ，王丹1，2，谢小丽1，2，陈振夏1，2
(1. 中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所 /农业部华南作物基因资源与
种质创制重点开放实验室，海南 儋州 571737;
2. 海南省艾纳香工程技术研究中心 海南 儋州 571737)
［摘要］ 目的:探讨艾纳香栽培群体内主要化学成分个体变异规律，为艾纳香优良品种的定向选育奠定基础。
方法:选取同一栽培环境下相同株龄 100 个艾纳香单株，采用 GC测定左旋龙脑含量，紫外可见分光光度法测定总
黄酮含量。通过相关分析、标准差法分组比较等方法分析化学成分单株变异规律。结果:100 个单株艾纳香左旋龙
脑变异系数为 37. 39%，总黄酮变异系数为 20. 13%;分组后左旋龙脑和总黄酮含量分别在 3 个组别间差异达到极显
著(P ＜ 0. 001)水平;相关分析表明，两类成分间存在正相关关系(r = 0. 084，n = 100)，但不具有统计学意义(P ＞
0. 05)。结论:艾纳香栽培群体内单株化学成分含量变异较大，可为高含量育种提供材料。此外，艾纳香叶片中左
旋龙脑和总黄酮积累不具有协同性，应分别对其进行选择。
［关键词］ 艾纳香;左旋龙脑;总黄酮;单株变异;定向选育
Individual Variation of l-borneol and Total flavonoids
Content in Blumea balsamifera(Ai-na-xiang)Cultured Population
YU Fulai1，2，HUANG Mei1，2，PANG Yuxin1，2* ，WANG Dan1，2，XIE Xiaoli1，2，CHEN Zhenxia1，2
(1. Tropical crops Genetic Ｒesources Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences /
Key Laboratory of Crop Gene Ｒesources and Germplasm Enhancement in Southern China，Danzhou 571737，China;
2. Hainan Provincial Engineering Ｒesearch Center for Blumea Balsamifera，Danzhou 571737，China)
［Abstract］ Objective:This study aimed at analyzing the individual variation of l-borneol and total
flavonoids content in Blumea balsamifera(Ai-na-xiang)cultured population，which provides a theoretical
basis for the B. balsamifera directional selection breeding with high-content bioactive components. Methods:
The content of l-borneol and total flavonoids randomly chosen from 100 one-year-old plants growing in the
same field was determined by GC and UV respectively. Simple correlation analysis and standard deviation
grouping were used to analyze the individual variation of l-borneol and total flavonoids content. Ｒesults:The
coefficients of variation (CV)of l-borneol and total flavonoids content were 37. 39% and 20. 13%
respectively. There were highly significant differences(P ＜0. 001)of l-borneol and total flavonoids content among
three groups after standard deviation method grouping. Simple correlation showed that l-borneol had positive
correlation(r =0. 084，n =100)with total flavonoids but not significant(P ＞0. 05). Conclusion:Great individual
variation of l-borneol and total flavonoids content in B. balsamifera cultured population is beneficial for bioactive
components directional selection breeding. There were different selective effects on l-borneol and total flavonoids
for the accumulation of l-borneol is inconsistent with that of total flavonoids in B. balsamifera.
［Key words］ Blumea balsamifera;l-borneol;Total flavones;Individual variation;Directional selection
doi:10． 13313 / j． issn． 1673-4890． 2014． 08． 010
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艾纳香 Blumea balsamifera(L. )DC. 为菊科多年
生草本植物，在我国广泛分布于海南、贵州、广西、
云南等省区［1］。艾纳香新鲜叶片经水蒸气蒸馏、升
华等一系列处理可制得中药艾片(主要为左旋龙
脑)，具开窍醒神，清热止痛之功效［2］。此外，艾纳
香中还含有黄酮等多种活性成分［3-4］。
艾纳香人工种植历史已有近百年，但长期以
来，艾纳香药材以野生为主，优良品种缺乏的现
状仍未改变，规范化生产技术研究与推广工作仍
未落实到位，这直接导致艾纳香药材质量不稳
定，难于有效控制。而通过人工定向选育良种是
提高和稳定艾纳香药材质量的根本途径。艾纳香
具有无性克隆繁殖特性［5］，通过系统选育优良单
株，建立优良材料无性系是实现艾纳香品种选育
的重要途径。植物化学成分为数量性状，其合成
积累受基因型和环境双重因素影响。以往研究对
不同产地、不同季节以及不同部位艾纳香在挥发
性成分和黄酮类成分含量比较方面报道较多［6-8］，
然而同一生长环境不同单株间化学成分含量变异
的研究未见报道。
基于此，本研究从艾纳香化学成分定向选择角
度出发，通过测定同一栽培环境下相同株龄 100 株
艾纳香单株的左旋龙脑和总黄酮含量，进而阐释艾
纳香栽培群体内化学成分在个体间变异规律，以期
为高含量材料的选择提供依据，为优良艾纳香品种
的定向选育奠定基础。
1 材料与仪器
1. 1 试验材料
2013 年 12 月于海南儋州艾纳香栽培基地随机标
记 100 个同一年生单株(实生苗)，每株选取功能叶
片 20 片，阴干后粉碎作为测试样品。以上材料经中
国热带农业科学院热带作物品种资源研究所庞玉新
副研究员鉴定为艾纳香 Blumea balsamifera(L. )DC. 。
1. 2 试验仪器
安捷伦 7890A气相色谱仪，氢火焰离子化检测
器(FID)，安捷伦 G4513A 16 位自动进样器，
Sartarius CPA225D电子分析天平，KQ-500DB型超声
仪，UNICO2012-PCS紫外分光光度计，左旋龙脑对
照品(阿法埃莎化学有限公司，纯度 ＞ 98%)，芦丁
标准品(中国食品药品检定研究院，批号为 100080-
200707，纯度为 92. 5%)，水杨酸甲酯(天津光复精
细化工研究所，纯度 ＞ 99. 5%)，乙酸乙酯，亚硝酸
钠 NaNO2、硝酸铝 Al(NO3)3·9H2O、氢氧化钠、乙
醇等试剂均为国产分析纯。
2 方法
2. 1 左旋龙脑含量测定
2. 1. 1 色谱条件 HP-5 石英毛细管色谱柱(0. 32 mm
× 30 m，0. 25 μm);以 80 ℃为起始温度，保持 2
min，然后以 5 ℃ /min 升温至 100 ℃，再以 20 ℃ /
min升温至 200 ℃;进样口温度为 220 ℃;FID检测
器温度为 240 ℃;进样量 0. 6 μL，分流比为 9∶1。左
旋龙脑对照品和艾纳香供试品色谱图见图 1。
2. 1. 2 供试品的制备 精密称定艾纳香叶片粉末(过
20 目筛)约 2 g，置于 50 mL具塞三角瓶中，加入乙
酸乙酯 25 mL，称定重量，在 40 kHz 的超声条件下
提取 30 min，放冷，用乙酸乙酯补足减失的重量，
摇匀，滤过，取 1 mL续滤液至 10 mL容量瓶中，加
入 1 mL内标液(见 2. 1. 3 项下)，用乙酸乙酯定容，
摇匀，经 0. 22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。
2. 1. 3 线性关系的考察 精密称定左旋龙脑对照品
约 100 mg，加乙酸乙酯定容至 100 mL 作为对照液。
精密称定水杨酸甲酯约 250 mg，加乙酸乙酯定容至
250 mL 作为内标液。量取对照液 0. 1、0. 2、0. 5、
1. 0、2. 0 mL置于 10 mL 容量瓶中，同时加入内标
溶液 1. 0 mL，以乙酸乙酯定容至刻度，即得混合对
照品溶液。按照 2. 1. 1 项下的色谱条件测定。以对
照品中左旋龙脑质量浓度(mg·mL －1)为横坐标(X)，
对照品左旋龙脑与内标物水杨酸甲酯的峰面积比为
纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得到线性回归方程为:
Y = 14. 823X + 0. 0129，r = 0. 999 9，结果表明，左旋
龙脑在 10. 371 ～ 207. 428 μg·mL －1与峰面积呈良好
线性关系。
2. 1. 4 精密度试验 取某一艾纳香药材，按 2. 1. 2 项
下操作制备供试品溶液，在上述色谱条件下连续重
复进样 6 次，记录色谱图。结果左旋龙脑与水杨酸
甲酯的相对峰面积的 ＲSD 值为 2. 1%，表明精密度
良好。
2. 1. 5 重复性试验 取同一艾纳香药材 5 份，按
2. 1. 2 项下操作制备供试品溶液，在上述色谱条件
下进样分析，结果测得左旋龙脑含量的 ＲSD为 3%，
表明重复性良好。
2. 1. 6 稳定性试验 取艾纳香药材 1 份，按 2. 1. 2 项
下操作制备供试品溶液，于室温下放置，分别在 0、
2、4、8、12、24 h各进样一次，左旋龙脑与内标物
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1. 左旋龙脑 2. 水杨酸甲酯
图 1 左旋龙脑对照品(A)和供试品(B)色谱图
的相对峰面积的 ＲSD 为 0. 49%，表明样品在 24 小
时内稳定性良好。
2. 1. 7 加样回收率试验 精密称定 6 份已知含量的艾
纳香叶片粉末约 1 g，每份样品精密加入左旋龙脑标
准品约 5 mg，按 2. 1. 2 项下方法制备，在上述色谱
条件下进行分析，结果得回收率在 80% ～ 120%之
间，ＲSD为 2. 44%，表明回收率较高。
2. 1. 8 样品含量测定 按照 2. 1. 2 项下操作制备样品
溶液，在上述色谱条件下进样分析，根据线性方程
计算不同单株艾纳香中左旋龙脑的含量。
2. 2 总黄酮含量测定
2. 2. 1 显色剂的配制 称取 25 g NaNO2，用蒸馏水
定容至 500 mL，配成 5%的 NaNO2 溶液，备用;称
取 88 g Al(NO3)3·9H2O，用蒸馏水定容至 500 mL，
配成 10%的 Al(NO3)3 溶液，备用;称取 20 g 的
NaOH，用蒸馏水定容至 500 mL，配成 4%的 NaOH
溶液，备用。
2. 2. 2 对照品溶液的制备 精密称定于 105 ℃干燥
至恒重的芦丁对照品约 12 mg，置于 50 mL 容量瓶
中，加 75%乙醇溶液，置水浴锅上微热溶解，放
冷，加 75%乙醇至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
2. 2. 3 供试品溶液的制备 精密称定艾纳香药材粉
末(过 20 目)约 0. 5 g，至具塞锥形瓶中，加 75%乙
醇溶液 25 mL，称定重量，在 40 kHz下超声提取 40
min，放冷，称量，用 75%的乙醇补足减失的重量，
摇匀，过滤，即得供试品。
2. 2. 4 测定波长的选择 分别精密量取对照品溶液
2. 0 mL、供试品 0. 5 mL，将其分别置于 25 mL 容量
瓶中，各加 75%乙醇至 10 mL，加 5% NaNO2 溶液 1
mL，摇匀，放置 5 min，加 10% Al(NO3)3 溶液 1
mL，摇匀，放置 5 min，加 4% NaOH 溶液 10 mL，
最后以 75%乙醇定容至刻度，摇匀，放置 15 min，
以相应的试剂溶液为空白，在 300 ～ 999 nm 波长间
进行全波长扫描，综合分析选择适宜测定波长为 509
nm。吸收曲线如图 2 所示。
图 2 全波长扫描图
2. 2. 5 线性关系的考察 精密量取对照品溶液 1. 00、
2. 00、4. 00、6. 00、8. 00 mL分别置于 25 mL容量瓶
中，按 2. 2. 4 项下方法进行显色反应，以相应的试
剂溶液为空白对照，在 509 nm 处测定吸光度 A。
以对照品浓度 C 为横坐标(X)，吸光度 A为纵坐标
(Y)，绘制标准曲线，得到线性回归方程为 Y =
12. 847X + 0. 009 3，r = 1. 000，结果表明，总黄酮
在 9. 176 ～ 73. 408 μg·mL －1与吸光度呈良好线性
关系。
2. 2. 6 精密度试验 取某一浓度的对照品溶液 2 mL，
置于 25 mL的容量瓶中，按标准曲线绘制项下操作，
测定吸收值，连续 6 次，ＲSD 值为 1. 05%，表明精
密度良好。
2. 2. 7 稳定性实验 取某一浓度供试液，置于 25 mL
容量瓶中，按 2. 2. 5 项下操作，每隔 10 min 测定其
吸光度，共计 60 min，分析得出溶液在显色后 40
min 内 ＲSD 值为 1. 89%，表明在 40 min 内比较
稳定。
2. 2. 8 重复性实验 取同一批样品按 2. 2. 3 项下操作
平行制备供试品溶液 6 份，按 2. 2. 5 项下操作，测
定其吸光度，计算得平均浓度为 13. 91%，ＲSD 值
为 3. 8%。
2. 2. 9 加样回收试验 精密称取 6 份已知浓度的艾纳
香药材粉末(过 20 目筛)50 mg，分别加入相当于供
试品溶液总黄酮质量的芦丁对照品约 7 mg，按
2. 2. 3 项下制备供试液，按 2. 2. 5 项下操作测定吸收
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值，结果得平均回收率为 110%，ＲSD值为 2. 7%。
2. 2. 10 样品含量测定 按照 2. 2. 3 项下方法进行样
品溶液制备，按 2. 2. 5 项下操作测定供试品吸光度
值，计算各不同单株艾纳香中总黄酮的含量。
3 结果与分析
3. 1 不同单株艾纳香叶片左旋龙脑和总黄酮含量基
本统计量
依据 100株艾纳香叶片左旋龙脑和总黄酮含量数
据统计结果如下(表 1 和图 3)，两组数据符合正态分
布。其中，左旋龙脑最大值达 10. 71 mg·g －1，最小值
仅 1. 50 mg·g －1，变异系数为 37. 39%。而总黄酮最大
值 206. 59 mg·g －1，最小值为 65. 63 mg·g －1，变异系
数为 20. 13%。说明艾纳香栽培群体内单株间化学成
分含量差异显著。
表 1 不同单株艾纳香叶片左旋龙脑和总黄酮
含量基本统计量
/mg·g － 1
基本统计量 左旋龙脑 总黄酮
均值 3. 833 142. 959
标准差 1. 433 28. 780
标准误 0. 143 2. 878
方差 2. 054 828. 274
中值 3. 475 143. 465
偏度 1. 570 － 0. 105
峰度 4. 632 0. 003
极小值 1. 500 65. 630
极大值 10. 710 206. 590
全距 9. 210 140. 960
变异系数 /CV% 37. 39 20. 13
图 3 艾纳香单株叶片左旋龙脑和总黄酮含量正态分布
3. 2 不同组别艾纳香单株左旋龙脑和总黄酮含量差
异分析
采用标准差法进行分组，均值加 1 倍标准差定
为高、中组别临界值，均值减 1 倍标准差定为中、
低组别临界值。据此将 100 个单株左旋龙脑和总黄
酮含量数据划分为高、中、低三组，同时对不同组
别采用 Duncan’s 法进行多重比较，其结果列于表 2。
两类成分在三个组别间差异达到极显著(P ＜ 0. 001)
水平。其中，左旋龙脑高含量组占 14%，总黄酮高
含量组占 15%。结果提示，从现有栽培群体内可实
现优良单株选择。
表 2 不同组别艾纳香单株左旋龙脑和总黄酮含量差异分析
组别 临界值 左旋龙脑含量 /mg·g － 1 百分比 /% 临界值 总黄酮含量 /mg·g － 1 百分比 /%
高含量组 ＞ 5. 26 6. 470 ± 1. 405a 14 ＞ 171. 74 188. 149 ± 10. 461a 15
中含量组 2. 38 ～ 5. 26 3. 639 ± 0. 719b 73 114. 18 ～ 171. 74 144. 354 ± 14. 132b 67
低含量组 ＜ 2. 38 2. 089 ± 0. 246c 13 ＜ 114. 18 100. 104 ± 14. 280c 18
平均值 — 3. 833 ± 1. 433 100 — 142. 959 ± 28. 780 100
注:不同组别间多重比较采用 Duncan’s法(P ＜ 0. 001)
3. 3 艾纳香叶片左旋龙脑与总黄酮含量相关分析
为探讨左旋龙脑与总黄酮在艾纳香叶片中积累
的协同性，进一步通过 Pearson 相关分析(图 4)表
明，两者之间存在正相关关系(r = 0. 084，n = 100)，
但不具有统计学意义(P ＞ 0. 05)。结果提示，同时
选择左旋龙脑和总黄酮高含量单株存在较大难度。
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图 4 艾纳香叶片左旋龙脑与总黄酮含量 Pearson相关分析
4 结论与讨论
4. 1 艾纳香栽培群体内单株化学成分含量变异较大，
可为高含量育种提供材料
艾纳香是具有克隆生长习性的多年生宿根性草
本植物［5］，因此通过系统选育高含量单株，建立优
良材料无性系是实现艾纳香品种选育的重要途径。
变异是选择的基础，对发生变异的生物体按照一定
的方向和目标连续选择，就能使变异逐渐积累、巩
固和加强［9］。艾纳香栽培群体内左旋龙脑和总黄酮
含量在单株间表现出较大差异，变异系数分别为
37. 39%和 20. 13%。同时左旋龙脑含量最大值
(10. 71 mg·g －1)和最小值(1. 50 mg·g －1)相差达 7. 14
倍;总黄酮含量最大值(206. 59 mg·g －1)和最小值
(65. 63 mg·g －1)亦相差 3. 15 倍。因此，当以左旋龙
脑或总黄酮为育种目标时，从现有栽培群体内筛选
高含量单株具有较大的选择潜力。
4. 2 艾纳香叶片中左旋龙脑和总黄酮积累不具有协
同性，应分别对其进行选择
本研究通过对 100 个样本的左旋龙脑和总黄酮
相关分析表明，两类成分不具有统计学意义的相关
性(P ＞ 0. 05)。提示两类成分在叶片中积累不具有协
同性。左旋龙脑为莰烷型双环单萜类化合物，是发
生在质体内的脱氧木酮糖-5-磷酸途径［10］。黄酮类化
合物的生物合成是通过苯丙烷代谢途径完成［11］。同
时，植物次生代谢产物合成存在组织分布特异性和
积累时期特异性。所以，以左旋龙脑或总黄酮为育
种目标时，对优良材料进行选择时应将两类成分分
开选择。
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(收稿日期 2014-03-23)
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