全 文 ：蝴蝶兰根内生细菌的分离及可分泌 IAA细菌的筛选
潘丽晶，陈继敏，张妙彬，何 润，蔡晓平
（珠海市农业科学研究中心，广东珠海 519070）
摘 要：为从蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)根部分离出可分泌吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)的内生
细菌，通过探讨蝴蝶兰根部表面消毒的最佳条件，采用分离培养法、生理生化试验和16S rDNA分析，对
蝴蝶兰根部内生细菌进行研究。结果表明，NA培养基分离出的 6株细菌分别属于短杆菌属
(Brevibacterium)、伯克氏菌属(Burkholderia)、Dyella和类芽胞杆菌(Paenibacillus)；R2A培养基分离出的20
株细菌分别属于伯克氏菌属(Burkholderia)和Dyella；分离获得的26株内生细菌中，具有分泌 IAA功能的
有23株，占分离总菌数的88.5%。综合来看，蝴蝶兰根中存在可分泌 IAA不同种属的内生细菌，为进一
步研究内生细菌与蝴蝶兰植物之间的相互作用提供了菌种资源。
关键词：蝴蝶兰；内生细菌；分离培养；16S rDNA；IAA
中图分类号：S682.31 文献标志码：A 论文编号：2013-2895
The Separation Culture and Screening of IAA-Producing Endophytic Bacteria
from the Roots of Phalaenopsis amabilis
Pan Lijing, Chen Jimin, Zhang Miaobin, He Run, Cai Xiaoping
(Zhuhai Agricultural Science Research Centre, Zhuhai Guangdong 519070)
Abstract: In order to separate indole-3-acetic acid (IAA) producing endophytic bacteria from Phalaenopsis
amabilis roots, we investigated the optimal surface sterilization condition of Phalaenopsis amabilis roots, take
the separation culture, biological and chemischial characters, and 16S rDNA analysis. The results indicated
that, 6 strains isolated by NA medium were Brevibacterium, Burkholderia, Dyella and Paenibacillus. 20 strains
isolated by R2A medium were Burkholderia and Dyella. A total of 23 strains were shown to produce IAA from
26 strains. In general, diverse and abundant communities of IAA-producing endophytic bacteria exist in the
roots of Phalaenopsis amabilis which highlight the microbial resources represented by interactions between
endophytic bacteria and Phalaenopsis amabilis further.
Key words: Phalaenopsis amabilis; endogenous bacteria; separation culture; 16S rDNA; IAA
0 引言
兰科植物组织内存在着及其丰富的内生细菌，与
其他植物的内生细菌一样，兰科植物的内生细菌与兰
科植物建立了复杂的和谐关系。兰科植物的内生细菌
通过合成植物激素、产生铁载体、光合作用和生物固氮
等方式对兰科植物种子萌发和生长具有促生作用[1]。
早在 20世纪 80年代，澳大利亚Wilkinson等就从
地生兰菌根组织中分离出内生细菌。同时表明，其内
生细菌的丰度随着季节和菌根真菌侵染的组织形态
的不同而变化，首次提出兰科植物与内生真菌、内生
细菌的协同作用关系[2]。1994年，Wilkinson等对获得
的内生细菌进行了生理生化特性研究与鉴定，报道了
不同种地生兰的优势菌群[3]，并阐明其内生细菌具有
分泌吲哚乙酸 (indole- 3- acetic acid，IAA)的功能 [4]。
2001年至2007年，俄罗斯Tsavkeiova等发表了有关附
生兰与地生兰根部内生细菌研究的报道。研究指出，
基金项目：2012年度珠海市农业科技三项经费项目“珠海兰花优质组培苗高效生产技术研究”(2012B384008)。
第一作者简介：潘丽晶，女，1976年出生，江西九江人，高级农艺师，博士，主要从事微生物资源研究与应用。通信地址：519070广东省珠海市香洲梅
溪旅游路2428号，Tel：0756-8508131，E-mail：panlijing@msn.com。
收稿日期：2013-11-05，修回日期：2014-01-06。
中国农学通报 2014,30(16):148-152
Chinese Agricultural Science Bulletin
不同生境的兰科植物，其内生细菌的种类也不同[5-6]；
大部分内生细菌具有分泌 IAA活性，并在一定时期达
到最高[7]，在不同的培养条件下，其 IAA的活性存在差
异[8]；具有分泌 IAA活性的内生细菌能够促进种子萌
发[8]、宿主根部的生长[9]。21世纪初，国内研究者开始
关注兰科植物内生细菌的研究，主要在春兰[10-11]、蕙兰[12]
与石斛[13]等品种上见有报道。
蝴 蝶 兰 (Phalaenopsis amabilis) 是 兰 科
(Orchidaceae)蝴蝶兰属(Phalaenopsis)植物，单茎性附生
兰，茎短，叶大，花姿优美，颜色华丽，为热带兰中的珍
品，有“兰中皇后”之美誉。国内有关蝴蝶兰研究的主
要领域在品种种质、组培快繁、遗传基因、生化机制、抗
性生理、栽培管理、病虫害防治等几个方面[14]，而有关
蝴蝶兰内生细菌的研究目前尚是空白。笔者对分布在
蝴蝶兰根部可分泌 IAA的内生细菌进行了分离培养
与鉴定分析，以期为蝴蝶兰内生细菌的开发利用提供
基础资料。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
试验于 2011年 4月—2012年 10月在珠海市农业
科学研究中心梅溪基地内进行。
1.2 试验材料
1.2.1 植物材料 选取 3年生健康蝴蝶兰为供试材料，
随机选取 5株健康蝴蝶兰，每株取根 1 g，样品混合后
用于内生细菌的分离。
1.2.2 培养基
（1）牛肉膏蛋白胨培养基(NA)。牛肉膏10 g、蛋白
胨10 g、NaCl 5 g、琼脂15 g、定容至1 L、pH 7.0。用于
分离时在倒平板之前加入已过滤除菌的制霉菌素
50 μg/mL，用于抑制真菌生长。
（2）R2A培养基。酵母提取物 0.5 g、胰蛋白胨
0.25 g、蛋白胨 0.5 g、酪蛋白酸水解物 0.5 g、葡萄糖
0.5 g、淀粉 0.5 g、磷酸氢二钾 0.3 g、硫酸镁 0.024 g、丙
酮酸钠 0.3 g、琼脂 15.0 g、定容至 1 L。用于分离时在
倒平板之前加入已过滤除菌的制霉菌素 50 μg/mL，用
于抑制真菌生长。
1.3 试验方法
1.3.1 蝴蝶兰根最佳表面消毒条件的确定 称取 1 g
表面清洗干净的蝴蝶兰根，进行表面消毒。表面消
毒程序为：使用 75%乙醇浸泡 3 min，然后置于 2%、
3%、5%次氯酸钠溶液中浸泡，分别处理 2、3、5、7、
10、15、20 min，再用 75%乙醇浸泡 30 s，最后用无菌
水冲洗 5次，每次 1 min，于无菌滤纸上吸干。取最
后一次冲洗水 100 μL涂布于NA平板，同时用处理
后的根于NA平板上轻压涂抹，以涂布 100 μL无菌
水的NA平板为空白对照，28℃培养 6天，检测表面
消毒效果。
1.3.2 内生细菌的分离培养 将以最佳表面消毒条件处
理的蝴蝶兰根进行内生细菌的分离，具体步骤：将表面
消毒处理的蝴蝶兰根置于无菌研钵中，加入 10 mL无
菌生理盐水（浓度为 0.85%）及少量的无菌石英砂研
磨，研磨后取匀浆液经梯度稀释（用生理盐水分别稀释
10、100、1000倍），取不同稀释度的匀浆液200 μL涂布
NA培养基、R2A培养基[11]，28℃培养，根据菌落形态不
同计数不同培养基所分离到的细菌种类数，并挑取优
势菌株，纯化并保存。
1.3.3 内生细菌的生理生化分析 依据《常见细菌系统
鉴定手册》，通过革兰氏染色、过氧化氢酶试验（接触酶
试验）、淀粉水解试验和厌氧试验对内生细菌进行生理
生化分析[15]。
1.3.4 内生细菌的 16S rDNA扩增、序列测定 采用
Axyprep细菌基因组DNA小量试剂盒提取细菌基因
组DNA制备 PCR模板。PCR引物选用 16S rDNA通
用引物，PCR反应采用常规程序。1%琼脂糖凝胶电泳
检测PCR扩增产物，选取条带清晰的PCR扩增产物测
序。引物合成与测序由上海睿安生物科技有限公司
完成。
1.3.5 可分泌 IAA内生细菌的筛选 采用含有L-色氨酸
(200 mg/L)的R2A液体培养基进行可分泌 IAA内生细
菌的筛选，筛选方法同刘琳等[11]。
1.4 数据分析
16S rDNA序列测定结果利用 Blast搜索引擎在
GenBank/EMBL数据库中寻找同源序列并进行相似性
比对分析。
2 结果与分析
2.1 蝴蝶兰根的最佳表面消毒条件
蝴蝶兰根经不同浓度次氯酸钠和不同时间处理，
每个处理条件重复 3次，得到的表面消毒情况如表 1
示。从表 1中可以看出，经乙醇处理后，蝴蝶兰根在
5%次氯酸钠溶液中处理15 min和20 min，均能彻底消
灭根表面污染。
2.2 内生细菌的分离纯化与生理生化特征
不同培养基分离蝴蝶兰根内生细菌在数量和种类
上都存在着一定的差别。本试验使用的培养基有 2
种：NA和 R2A，在NA平板上分离出 6株内生细菌，
R2A上分离出 20株内生细菌。分离结果表明R2A培
养基分离蝴蝶兰根内生细菌的效果较好（表2）。
分离纯化的26株细菌，其生理生化特征如表2所
潘丽晶等：蝴蝶兰根内生细菌的分离及可分泌 IAA细菌的筛选 ··149
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示。26株菌株中，HN1、HN2、HN6 3株为革兰氏阳性，
其余为革兰氏阴性。HN5是兼性好养菌，其余为厌氧
菌。所有分离菌株接触酶试验均为阳性，HN5、HN6、
HR19淀粉水解试验为阳性，其余为阴性。
2.3 内生细菌的16S rDNA序列分析
16S rDNA序列分析结果显示如表3，26株内生细
菌分属于 5个属。一般认为，根据 16S rDNA基因序
列，菌株间相似性在93%~95%，可视为不同的属，相似
性大于 95%可视为同一属 [16]。比对结果显示，菌株
HN1和 HN2与短杆菌属(Brevibacterium)的相似性达
99%。HN3、HR3、HR4、HR6、HR9和HR12菌株与已
知进化关系最近的唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderia
gladioli)相似性均在 99%。HN4、HR1、HR2、HR5、
HR7、HR8、HR10、HR11、HR13和HR19与伯克霍尔德
菌属(Burkholderia)的相似性都在 99%。HN5、HR14、
表1 蝴蝶兰根表面消毒条件的选择
次氯酸钠浓度/%
2
3
5
2 min
+/+
+/+
+/+
3 min
+/+
+/+
+/+
5 min
+/+
+/+
-/+
7 min
+/+
+/+
-/+
10 min
+/+
+/+
-/+
15 min
+/+
+/+
-/-
20 min
+/+
+/+
-/-
注：“/”左、右两侧分别表示最后1次清洗水和根涂抹平板后细菌生长结果。“+”表示有菌生长，“-”表示无菌生长，下同。
HN1
HN2
HN3
HN4
HN5
HN6
HR1
HR2
HR3
HR4
HR5
HR6
HR7
HR8
HR9
HR10
HR11
HR12
HR13
HR14
HR15
NA
NA
NA
NA
NA
NA
R2A
R2A
R2A
R2A
R2A
R2A
R2A
R2A
R2A
R2A
R2A
R2A
R2A
R2A
R2A
+
+
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
杆状
杆状
杆状
杆状
杆状
杆状
杆状
杆状
杆状
杆状
杆状
杆状
杆状
杆状
杆状
杆状
杆状
杆状
杆状
杆状
杆状
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
菌株 培养基 革兰氏染色 形状 接触酶
淀粉
水解
厌氧
培养
表2 内生细菌的主要生理生化特征
HR16
HR17
HR18
HR19
HR20
R2A
R2A
R2A
R2A
R2A
-
-
-
-
-
杆状
杆状
杆状
杆状
杆状
+
+
+
+
+
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
菌株 培养基 革兰氏染色 形状 接触酶
淀粉
水解
厌氧
培养
续表2
短杆菌属(Brevibacterium)
唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderia gladioli)
HN1
HN2
HN3
HR3
HR4
HR6
HR9
HR12
Brevibacterium epidermidis(HQ455048)
Brevibacterium sp. CNJ737 PL04(DQ448693)
Burkholderia gladioli (AY268164)
Burkholderia gladioli (AY268164)
Burkholderia gladioli (AY268164)
Burkholderia gladioli (EU090890)
Burkholderia gladioli (AY268165)
Burkholderia gladioli (AY268165)
99
99
99
99
99
99
99
99
菌群 测序菌株 最相近菌种(登录号) 序列相似性/%
表3 蝴蝶兰根内生细菌的16S rDNA序列相似性分析
··150
HR15、HR16、HR17、HR18和HR20与Dyella相似性大
于97%。HN6与类芽孢杆菌属(Paenibacillus)相似性达
99%。
2.4 分泌 IAA的内生细菌筛选
从蝴蝶兰根部分离得到 26株内生细菌，其中 23
株具有分泌 IAA的能力，占分离总菌数的 88.5%。其
定量测定结果显示如表 4。从蝴蝶兰根中分离的
Dyella内生细菌是分泌 IAA的优势菌属，IAA产量介
于4.236~11.615 mg/L· OD600之间。伯克霍尔德氏菌属
分泌 IAA的能力较不稳定，部分不分泌 IAA。短杆菌
属的两株细菌均有分泌 IAA的能力。类芽孢杆菌属
不分泌 IAA。
伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)
Dyella
类芽孢杆菌属(Paenibacillus)
HN4
HR1
HR2
HR5
HR7
HR8
HR10
HR11
HR13
HR19
HN5
HR14
HR15
HR16
HR17
HR18
HR20
HN6
Burkholderia sp. SBH-9(AB366331)
Burkholderia sp. N-APS2(EU035638)
Burkholderia sp. N-APS2(EU035638 )
Burkholderia sp. N-APS2(EU035638)
Burkholderia sp. SBH-9( AB366331)
Burkholderia sp. CmMC2( HM352343)
Burkholderia sp. N-APS2(EU035638)
Burkholderia sp. N-APS2(EU035638)
Burkholderia sp. N-APS2(EU035638)
Burkholderia sp. IBRC204(DQ381722)
Dyella marensis(GQ181039)
Dyella soli(NR-043258)
Dyella marensis(NR-042691)
Dyella soli (NR-043258)
Dyella soli (NR-043258)
Dyella soli (NR-043258)
Dyella marensis (NR-042691)
Paenibacillus taichungensis (NR_044428)
99
99
99
99
99
99
99
99
99
99
97
98
99
98
98
98
98
99
菌群 测序菌株 最相近菌种(登录号) 序列相似性/%
续表3
Dyella
唐菖蒲伯克霍尔德菌
HN5
HR14
HR15
HR16
HR17
HR18
HR20
HN3
HR3
HR4
HR6
HR9
HR12
0.109 #
7.592 *
11.615*
7.062 *
4.236 *
7.366 *
7.867 *
0
3.833 *
4.444 *
3.904*
4.225 *
3.997 *
菌群 测序菌株 IAA分泌量/(mg/L· OD600)
表4 可分泌 IAA的内生细菌 伯克霍尔德氏菌属
短杆菌属
类芽孢杆菌属
HN4
HR1
HR2
HR5
HR7
HR8
HR10
HR11
HR13
HR19
HN1
HN2
HN6
0
1.963 #
1.990 #
1.347 *
1.110 *
1.847 *
2.557 #
2.159 #
2.073 #
0.886 #
1.804 *
1.502 *
0
菌群 测序菌株 IAA分泌量/(mg/L· OD600)
注：*相对标准偏差值RSD＜10%；#相对标准偏差值RSD介于10%~
30%之间。
续表4
潘丽晶等：蝴蝶兰根内生细菌的分离及可分泌 IAA细菌的筛选 ··151
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
3 结论与讨论
3.1 蝴蝶兰根内生细菌的分离与鉴定
为了从蝴蝶兰根部获得更多的内生细菌，笔者参
照春兰内生细菌的分离培养方法[10]，明确了蝴蝶兰根
表面消毒条件为经乙醇处理后在5%次氯酸钠溶液中
处理 15~20 min，能彻底消灭根表面污染。结合生理
生化特性和 16S rDNA序列分析方法，比较了NA和
R2A培养基分离获得内生细菌的数量和种类，NA培
养基分离出6株菌株，而R2A分离出20株菌株。初步
表明R2A培养基分离出的细菌数较多，更适合用于蝴
蝶兰内生细菌的分离。R2A培养基是含有丙酮酸钠
的贫营养培养基，本研究结果再次证实：贫营养的培养
基以及添加丙酮酸钠的培养基能分离出数量和种类更
多的细菌[17]。
3.2 蝴蝶兰根内生细菌的多样性
综合目前研究来看，根部是兰科植物内生细菌常
见的分离部位[1]，而兰科植物内生细菌的优势菌属是假
单胞菌属(Pseudomonas)和芽孢杆菌属(Bacillaceae)[3,18]。
笔者分离获得的 26株蝴蝶兰根部内生细菌，分属于 5
个属。26株内生细菌中，伯克霍尔德菌属细菌 16株，
是优势菌属，Dyella属7株，短杆菌属2株，类芽孢杆菌
属 1株。本研究结果揭示，伯克霍尔德菌属也是兰科
植物内生细菌的优势菌属之一。这也从另一方面证
实了Wilkinson等[5]、Tsavkeiova等[6]的研究：兰科植物
内生细菌的种类会随生境、宿主的种类和根龄等的不
同而变化。
3.3 蝴蝶兰根内生细菌可分泌 IAA
植物内生细菌能产生植物促生物质，如植物激素
等，其中最活跃的是 IAA。从兰科植物分离的内生细
菌中，大部分都具有分泌 IAA的功能。不同细菌合成
IAA的能力不同，其中假单胞菌属、芽孢杆菌属以及
类芽孢杆菌属为 IAA高产主体菌 [3,8-9,11]。笔者的结果
有别于前人的报道，分离获得的 26株内生细菌中，具
有分泌 IAA的功能有23株。Dyella是分泌 IAA的高产
菌属，其产量介于4.236~11.615 mg/L·OD600之间；而优
势菌伯克霍尔德氏菌属分泌 IAA的能力较不稳定，部
分不分泌 IAA；短杆菌属的 2株细菌均有分泌 IAA的
能力，类芽孢杆菌属不分泌 IAA。研究结果提示，
Dyella是蝴蝶兰内生细菌分泌 IAA的高产菌属。
蝴蝶兰内生细菌的研究目前尚处于起步阶段，笔
者经过鉴定分析发现蝴蝶兰根部具有丰富的可分泌
IAA的内生细菌，而其内生细菌对宿主蝴蝶兰是否具
有促生功能，且促生机理如何，将在今后的研究中进一
步深入探讨。
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