全 文 ：遗传 HEREDITAS ( Beijing ) 17( 6): 4— 6 1995
·研 究 报 告·
云南小麦、西藏半野生小麦和普通小麦
叶绿体 DN A限制性内切酶图谱的研究①
彭隽敏　孔　青　 徐乃瑜
(武汉大学生命科学学院 , 武汉　 430072)
摘 要　云南小麦 ( Triticum aestivum ssp. yunnanense King )和西藏半野生小麦 ( Triticum aestivum
ssp. tibetanum Shao )是我国西部地区特有的两个普通小麦 ( T. aestivum L. )亚种。我们采用改进的高
离子强度法 , 提取云南小麦、西藏半野生小麦、普通小麦的两个品种 (中国春和鄂恩 1号 )的叶绿体
DN A,并用 7种限制性内切酶对它们的叶绿体 DN A进行了酶切图谱分析。结果表明:在普通小麦及
其两个亚种中没有叶绿体 DNA的限制性片段长度差异 ,反映了叶绿体基因组在进化过程中相对的
稳定性。
关键词　小麦 , 叶绿体 DN A, 限制性内切酶图谱
Study on the Restriction Fragment Patterns of Chloroplast DNAs
of Yunnan Wheat, Tibet Semiwild Wheat and Common Wheat
Peng Junmin　 Kong Qing　Xu Naiyu
( The School of Life Sciences, Wuhan U niv ersity, Wuhan 430072)
Abstract　 Yunnan wheat ( Triticum aestivum ssp. yunnanense King ) and Tibet semiwild wh ea t
( Triticum aestivum ssp. tibetanum Shao ) a re tw o endemic subspecies of common w hea t( T . aestivum
L. ) in the w est of China. Improved high ionic streng th medium was adopted to ex tract the cpDN As of
Yunnan wheat, Tibet semiwild wheat and tw o cultivars of common wheat( Chinese Spring and Een 1) .
Restriction fragment analysis of cpDNAs w as carried out with th e use of 7 restriction enzymes. The
results show ed tha t there was no diversity of cpDN As from common w hea t and the tw o subspecies, in-
dicating the conservatism of the chloroplast genome during the process o f evolution.
Key words　Wheat, cpDN A, Restriction f ragment pa ttern
叶绿体是高等植物和某些藻类的半自主性细胞器。叶绿体基因组的进化十分缓慢〔15〕。叶
绿体 DNA限制性内切酶图谱分析在研究叶绿体性状遗传、种系发生、亲缘和进化关系上已证
明是一种简单有效的方法〔11, 12〕。
云南小麦和西藏半野生小麦是六倍体小麦 , 染色体组型为 AABBDD,云南小麦产于滇西
南澜沧江和怒江下游 ,其护颖坚硬 ,护颖顶端紧靠外颖 ,极难脱粒 ,穗轴硬而脆 ,受压时易折
断〔 4, 5〕。 西藏半野生小麦是生长于西藏昌都地区的一种形态上很像普通小麦 ,而在成熟时穗轴
易折断的小麦 ,这种小麦一般作为田间杂草混杂在青稞与小麦田间 ,迄今为止 , 尚未发现野生
① 本文所采用的西藏半野生小麦种子承蒙中国科学院遗传所邵启全先生惠赠 ,特此致谢。
DOI : 10. 16288 /j . yczz. 1995. 06. 002
群落〔3, 6〕。在核型上 ,云南小麦、西藏半野生小麦与普通小麦中国春没有大的区别 ,但是 , 通过
云南小麦和西藏半野生小麦与中国春重双端体系列杂交 ,分析 F1代减数分裂时染色体配对情
况〔 10〕 ,以及染色体显带分析〔1〕均表明 , 三者的染色体之间存在某些差异。
普通小麦的野生型至今国内外均尚未发现 ,李蟠等认为 ,中国是现在已知的普通小麦发源
地 ,中国普通小麦起源于黄河、长江流域 ,特别是中、上游的西北和西南高原地区〔2〕。崔运兴等
根据云南小麦和西藏半野生小麦的酯酶同工酶酶谱带的多样性 ,认为云南和西藏在以前可能
存在一个小麦群落 ,它们很可能是中国栽培小麦的发源地之一。此外 ,他们的聚类分析结果表
明:云南小麦和西藏半野生小麦的遗传距离最近 ,进化水平相似 ,应归属同一类型〔7〕。为了探讨
这两个亚种细胞质遗传因子与普通小麦是否存在差异 ,我们对这些小麦进行了叶绿体 DNA
酶切图谱的比较研究。
1材　料　和　方　法
1. 1实验材料
云南小麦 (品种为双江铁壳麦 )、西藏半野生小麦、普通小麦的中国春和鄂恩 1号种子均在
校内实验基地繁殖。
1. 2实验方法
参考 Bookjans〔9〕和龚小松〔8〕的方法 ,略加改进 ,从二、三叶期小麦幼苗中提取叶绿体。幼苗
先经饥饿处理 (即暗处理 ) 1— 2天 ,然后称重 (假定为 100克 ) ,切碎 ,用 400ml缓冲液 A
[50mmol /L Tris, 25mmol /L EDTA, 1. 25mol /L NaCl, 250mmol /L抗坏血酸 , 0. 1%聚乙烯吡
咯烷酮 ( pvp,分子量为 3万道尔顿 ) ,最终 pH3. 5]进行匀浆 ,匀浆液用一层大尼龙网和二层小
尼龙网 ( 160目 )过滤两次。滤液经过 1 000× g离心 5分钟 ,沉淀用 200m l缓冲液 B( 50mmo l /L
Tris, 25mmol /L EDTA, 1. 25mol /L NaCl, 0. 1%巯基乙醇 , 0. 1%牛血清白蛋白 , 0. 1% pvp,
pH8. 0)重新悬浮 , 1 000× g离心 10分钟 ,沉淀再用缓冲液 C( 50mmo l /L Tris, 25mmo l /L ED-
T A, 0. 1% pvp, pH0. 8)洗一次 ,离心所得沉淀即为较纯净的叶绿体。
叶绿体沉淀用缓冲液 C充分悬浮 ,加蛋白酶 E(终浓度为 500μg /ml,使用前置 37℃自消化
2小时 )和 SDS(终浓度为 1% ) ,最后总体积 20ml ,置 37℃水浴中保温 3小时以上破膜。裂解液
用等体积 0. 2mol /L Tris( pH8. 0)饱和酚抽提一次 ,再用等体积饱和酚∶氯仿∶异戊醇 ( 25∶
24∶ 1, V /V )抽提到界面无蛋白 , 最后用氯仿∶异戊醇 ( 24∶ 1)再抽提一次。水相加入 1 /4体
积的 10mol /L的乙酸铵 , 2. 5倍体积的无水乙醇 ,低温放置过夜 ( - 20℃ ) ,然后取出 , 用 10
000× g离心 15分钟 ,叶绿体 DNA沉淀用 70%乙醇洗一次 ,自然干燥 ,溶于 2ml TE缓冲液中
( 10mmol /L Tris, 0. 1mmol /L EDTA, pH8. 0)。
所提叶绿体 DNA( cpDN A)样品加入 RNaseA(使用前置 80℃下 15分钟灭活 DNaseA)至
终浓度为 200μg /ml, 37℃消化 30分钟 ,加入乙酸铵 ,无水乙醇沉淀出叶绿体 DNA,操作方法
同上。所得纯净的 cpDN A沉淀溶于 200μl T E缓冲液中 ,低温保存备用。 cpDN A得率一般在
100μg /100g叶 (鲜重 )左右 ,纯度较好。
cpDNA酶解按华美生物工程公司提供的缓冲液及最佳酶切反应温度进行。酶切反应系统
中含 cpDNA溶液 5μl (约 2— 3μg ) ,内切酶 3μl (约 50u ) , 10×酶切缓冲液 4μl,无菌双蒸水
28μl。在水浴中保温至少 3小时 ,终止反应。然后加入 8μl上样缓冲液 ( 50%蔗糖、 0. 05%溴酚
蓝 ) ,上样电泳 ,电泳结束后 ,用 EB染色 ,在紫外灯下观察摄影。
56期 彭隽敏等:云南小麦、西藏半野生小麦和普通小麦叶绿体 DNA限制性内切酶图谱的研究 　　
2结　果　与　分　析
云南小麦、西藏半野生小麦、中国春及鄂恩 1号的 cpDN A分别用 EcoRⅠ 、 HindⅢ 、Bam H
Ⅰ 、PstⅠ 、 SalⅠ 、 SmaⅠ和 XhoⅠ 7种限制性内切酶进行酶切分析 ,酶切图谱如图版 I所示。叶
绿体 DNA可能的 3种突变方式为 DNA缺失或插入 (引起片段大小变异 ) ,酶切位点改变 (点
突变 )以及 DNA倒位或易位 (引起片段重排 ) ,其中前二种变异都可以用此法检测出来。实验
结果表明 ,这 4种 cpDN A的所有酶切图谱上的带型完全一致 ,没有任何片段差异。
3讨　　论
3. 1叶绿体 DNA提纯方法的改进
叶绿体 DNA提纯方法的设计是围绕叶绿体 DNA的得率、完整性及纯度来进行的。纯度
常会影响叶绿体 DNA的酶切反应。 选用龚小松等〔8〕的高离子强度低 pH法 ,可以有效地控制
核 DNA的污染 ,但非 DNA的污染往往存在 ,酚类物质在提取过程中氧化为醌类物质而吸附
于叶绿体 DNA上 ,极难除去 ,容易抑制叶绿体 DNA的酶切反应。我们在抽提叶绿体 DNA的
缓冲液 A、 B、 C中均加入 0. 1pvp, pvp对酚酶具有抑制作用 ,可以吸附酚酶的底物〔13〕 ,与此同
时 ,缓冲液 A、 B中分别存在抗坏血酸及巯基乙醇。它们都能有效地阻止酚类物质的氧化 ,使之
在酚、氯仿的抽提纯化过程中被除去。
3. 2云南小麦、西藏半野生小麦及普通小麦的亲缘关系
Ogihara ( 1988)
〔14〕曾对普通小麦的 3个不同品种的 cpDN A用 13种限制酶进行了分析 ,没
有发现它们酶谱上的差异 ,其中有一个品种是中国春。我们在实验中也选用了中国春作对照 ,
其图谱与 Ogihara的完全相符合。我们研究的云南小麦、西藏半野生小麦及普通小麦的酶切图
谱的一致性 ,表明它们之间虽属于不同的亚种 ,形态等特性虽有很多差异 ,但它们的 cpDN A
的进化仍处于同一个水平 ;这一结果同时说明 , cpDN A在进化上确是比较保守的 ,不易发生
变异。
参　考　文　献
〔 1〕吕　萍 ,张自立 , 1983. 遗传 , 5( 5): 20— 22.
〔 2〕李　燔等 , 1979. 生物史 ,上海科技出版社 .
〔 3〕邵启全等 , 1980. 遗传学报 , 7( 2): 149— 156.
〔 4〕陈勋儒 , 1980. 遗传 , 2( 6): 17— 19.
〔 5〕金善宝等 , 1959. 中国小麦的种类及其分布 ,南京农学院印行 , 21— 22.
〔 6〕黄亨履 , 1983. 作物品种资源 , 4: 9— 15.
〔 7〕崔运兴等 , 1990. 植物学报 , 32: 39— 44.
〔 8〕龚小松等 , 1991. 科学通报 , 36( 6): 467— 469.
〔 9〕 Book jans G, et al , 1984. Anal. Biochem. , 141: 244— 247.
〔10〕 Chen P D, et al , 1988. 7th In t. Wheat Genet. Symp. ( Abstracts) , Cambridge, pp. 5.
〔11〕 Craw fo rd D J, 1990. Plant Molecular Systematics by John Wiley and Sons , Inc. , pp. 272— 305.
〔12〕 Ichikawa, 1983. Jpn. J. Genet. , 58: 419— 424.
〔13〕 Jones J D, 1965. Phytochemistry, 4: 659— 676.
〔14〕 Ogihara Y, et al , 1988. Theor. Appl. Genet. , 76: 321— 332.
〔15〕 Palmer J D, 1985. Annu, Rev. Genet. , 19: 325— 354.
本文于 1994年 8月 30日收到。
6　　 遗　　传 HEREDITAS ( Beijing ) 1995 17卷
彭隽敏等:云南小麦、西藏半野生小麦和普通小麦叶绿体 DNA限制性内切酶图谱的研究
图版Ⅰ
叶绿体酶切图谱: 1. Bam HI; 2. Eco RI; 3. HindⅢ ; 4. PstI; 5. Sal I; 6. Sma I; 7. Xho I。
a. 鄂恩 1号 ; b. 中国春 ; c. 西藏半野生小麦 ; d. 云南小麦 ; m. λDN A HindⅢ酶切分子量标记。