全 文 ：书麦类作物学报　２０１５，３５（１）：１－６
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ　Ｃｒｏｐｓ　 ｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９－１０４１．２０１５．０１．０１
网络出版时间：２０１５－１－１３
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３５９．Ｓ．２０１５０１１３．１６１５．００１．ｈｔｍｌ
华山新麦草３Ｎｓ染色体特异ＳＣＡＲ标记的开发
收稿日期：２０１４－０９－１９　　　修回日期：２０１４－１０－０２
基金项目：农业部９４８项目（２０１３－Ｚ２８）；陕西省自然科学基础研究计划重点项目（２０１３ＪＺ００７）；陕西省重点科技创新团队计划支持
项目（２０１４ＫＣＴ－２５）
第一作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｊｎ２２７＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者：武 军（Ｅ－ｍａｉｌ：１３５７２０１６１６２＠１６３．ｃｏｍ）
苏佳妮１，郭 静２，王超杰１，敬 樊１，赵继新１，杨群慧１，陈新宏１，武 军１
（１．西北农林科技大学农学院，陕西杨陵７１２１００；２．宿州职业技术学院，安徽宿州２３４１０１）
摘　要：为快速准确地建立小麦－华山新麦草杂交后代的分子标记鉴定方法，采用１５０条１０ｂｐ的随机引
物Ｒ１－Ｒ１５０对华山新麦草、普通小麦７１８２、中国春及华山新麦草１Ｎｓ－７Ｎｓ全套二体附加系共１０个材料进行
了ＲＡＰＤ分析，从中获得了华山新麦草３Ｎｓ染色体上２个特异ＲＡＰＤ分子标记片段ＦＲ－１１３和ＦＲ－１２５。克隆这
两个片段并测序，发现其全长分别为５４３ｂｐ和５１５ｂｐ；分析序列后对其分别设计ＳＣＡＲ引物Ｓ－１１３和Ｓ－１２５，
重新对１０个材料进行ＳＣＡＲ分析，结果只在华山新麦草和小麦－华山新麦草３Ｎｓ二体附加系上扩增出了特异
条带，由此证明已将华山新麦草３Ｎｓ染色体上获得的两个ＲＡＰＤ标记成功转化为稳定可靠的ＳＣＡＲ标记。
这两个ＳＣＡＲ标记可用于检测小麦背景下的华山新麦草３Ｎｓ染色体，同时为小麦－华山新麦草杂交后代提供
了分子鉴定依据。
关键词：小麦；华山新麦草；分子标记；ＲＡＰＤ标记；ＳＣＡＲ标记
中图分类号：Ｓ５１２．９；Ｓ３３６　　　　文献标识码：Ａ　　　　文章编号：１００９－１０４１（２０１５）０１－０００１－０６
Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＳＣＡＲ　Ｍａｒｋｅｒｓ　ｏｎ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　３Ｎｓ　ｏｆ
Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ　Ｋｅｎｇ
ＳＵ　Ｊｉａｎｉ　１，ＧＵＯ　Ｊｉｎｇ２，ＷＡＮＧ　Ｃｈａｏｊｉｅ１，ＪＩＮＧ　Ｆａｎ１，ＺＨＡＯ　Ｊｉｘｉｎ１，
ＹＡＮＧ　Ｑｕｎｈｕｉ　１，ＣＨＥＮ　Ｘｉｎｈｏｎｇ１，ＷＵ　Ｊｕｎ１
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　７１２１００，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｓｕｚｈｏｕ　Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｃｏｌｅｇｅ，Ｓｕｚｈｏｕ，Ａｎｈｕｉ　２３４１０１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｗａｙ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ－Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ
Ｋｅｎｇ　ｈｙｂｒｉｄｓ　ｂｙ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒｓ，１５０ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅｒｓ　Ｒ１－Ｒ１５０（１０ｂｐ）ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｐｅｒｆｏｒｍ
ＲＡＰＤ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ　Ｋｅｎｇ，ｃｏｍｍｏｎ　ｗｈｅａｔ　７１８２，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ　ａｎｄ　１Ｎｓ－
７Ｎｓ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｌｉｎｅｓ　ｏｆ　Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ　Ｋｅｎｇ．Ａｍｏｎｇ　ｔｈｅ　１５０ｐｒｉｍｅｒｓ，Ｒ－１１３ａｎｄ　Ｒ－１２５
ｗｅｒｅ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｔｏ　ａｍｐｌｉｆｙ　ａ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｆｒｏｍ　Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ　Ｋｅｎｇ　ａｎｄ　ｉｔｓ
３Ｎｓ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｌｉｎｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｂｙ　Ｒ－１１３ａｎｄ　Ｒ－１２５ｗｅｒｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ，ｃｌｏｎｅｄ
ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｔｗｏ　ｐａｉｒｓ　ｏｆ　ＳＣＡＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ，Ｓ－１１３ａｎｄ　Ｓ－１２５，ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ
ｔｏ　ｐｅｒｆｏｒｍ　ＳＣＡＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　１０ｔｅｓｔｅｄ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｂａｎｄｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｏｎｌｙ　ｆｒｏｍ　Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ　Ｋｅｎｇ　ａｎｄ　ｉｔｓ　３Ｎｓ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｌｉｎｅ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ
ＲＡＰＤ　ｍａｒｋｅｒｓ　Ｒ－１１３ａｎｄ　Ｒ－１２５ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ　ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ＳＣＡＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　Ｓ－
１１３ａｎｄ　Ｓ－１２５．Ｔｈｅｓｅ　ｔｗｏ　ＳＣＡＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　３Ｎｓ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｏｆ　Ｐｓａｔｈｙ－
ｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ　Ｋｅｎｇ　ｕｎｄｅｒ　ｃｏｍｍｏｎ　ｗｈｅａｔ　ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ，ｗｈｉｃｈ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ａ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ－Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ　Ｋｅｎｇ　ｈｙｂｒｉｄｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｗｈｅａｔ；Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ　Ｋｅｎｇ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒ；ＲＡＰＤ　ｍａｒｋｅｒ；ＳＣＡＲ
ｍａｒｋｅｒ
　　小麦是世界上总产量仅次于玉米和水稻的第
三大粮食作物，在粮食安全中占有重要地位。提
高产量、改良品质、提高抗逆性，一直是小麦育种
工作的重点。小麦近缘属种中含有大量栽培小麦
所不具备的优良性状和有益基因，通过远缘杂交
将其导入小麦，将大大提高现有小麦的农艺性状
和抗逆性。华山新麦草（Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓ－
ｈａｎｉｃａ　Ｋｅｎｇ，２ｎ＝１４，ＮｓＮｓ）［１］是禾本科大麦族
新麦草属的多年生异花授粉植物，具有很强的抗
逆性和喜光性，仅在我国秦岭山脉华山地带生长。
华山新麦草具有耐瘠薄、早熟、抗寒、抗旱、中抗赤
霉病、高抗条锈病和全蚀病等多种优良特性［２－５］，
是小麦抗病育种和遗传改良重要的基因来源，其
与小麦的远缘杂交工作备受农业科学家的关注。
２０世纪８０年代，陈漱阳［６］、候文胜［７］等率先
开展小麦与华山新麦草的杂交工作，获得了一系
列小麦－华山新麦草的异附加系和异代换系。随
着这些育种材料的创制成功，小麦获得了华山新
麦草的抗旱、抗赤霉病、抗条锈病和抗全蚀病等优
良性状。与此同时，小麦与华山新麦草杂交后代
的鉴定工作也在同步进行。如赵继新等［８－９］利用
染色体Ｃ－分带和荧光原位杂交技术，鉴定出了一
系列小麦－华山新麦草异代换系和异附加系。苏
佳妮等［１０］综合利用形态学、细胞学和原位杂交等
方法，鉴定出了一个小麦－华山新麦草易位系２４－
６。但远缘杂交后代稳定性差、分离复杂且数量庞
大，现有的形态学观察、荧光原位杂交和染色体
Ｃ－分带技术等方法成本高、耗时长，使鉴定工作进
展缓慢，限制了华山新麦草在小麦遗传育种中的
应用。因此，寻找新的高效、快捷、准确的小麦－华
山新麦草杂交后代鉴定方法迫在眉睫。
ＲＡＰＤ （ｒａｎｄｏｍ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ＤＮＡ）分子标记技术是由 Ｗｉｌｉａｍｓ［１１］于１９９０年
创建的一种基于ＰＣＲ的ＤＮＡ多态性检测技术。
因其具有操作简便、灵敏度高、成本低、通用性强
等特点，近年来已广泛应用于许多植物的分子标
记研究［１２－１４］。但由于ＲＡＰＤ引物序列较短且易
受反应条件影响，故稳定性、重复性、可靠性差，这
在很大程度上限制了它的应用范围。ＳＣＡＲ（ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ）标记是由
ＲＡＰＤ衍生而来的一种更加稳定可靠的分子标记
技术，由于引物长、退火温度高，所以特异性、稳定
性、重复性都优于ＲＡＰＤ分子标记技术，可以更
加方便快捷地检测异源染色体［１５］。如尤明山
等［１６］把不稳定的ＲＡＰＤ标记转化为稳定可靠的
ＳＣＡＲ标记，检测出了小麦背景下的偃麦草染色
体组Ｅｅ染色体。但在华山新麦草３Ｎｓ染色体上
将ＲＡＰＤ标记转化为ＳＣＡＲ标记的染色体快速
检测研究国内外尚未报道。
为获得华山新麦草３Ｎｓ染色体的特异性
ＳＣＡＲ标记，本研究拟先筛选出３Ｎｓ染色体上的
ＲＡＰＤ分子标记，然后将其转化为特异性ＳＣＡＲ
标记并加以验证，以期为低世代快速准确地鉴定
小麦－华山新麦草远缘杂交后代提供便捷高效的
新方法，同时为华山新麦草３Ｎｓ染色体上有益基
因的利用奠定基础。
１　材料与方法
１．１　实验材料
亲本华山新麦草、亲本普通小麦７１８２、中国
春和小麦－华山新麦草全套异附加系（１Ｎｓ－７Ｎｓ，
２ｎ＝４４＝２２Ⅱ）共１０份，由陕西省植物遗传工程
育种重点实验室提供（表１）。
１．２　主要试剂
实验中所用的常规生化试剂均购于天根生化
科技公司，Ｔａｑ　ＤＮＡ 聚合酶、ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ、
ＭｇＣｌ２ 及１０×ｂｕｆｆｅｒ缓冲液、ｐＭＤ１９－Ｔ　ｖｅｃｔｏｒ等
购自ＴａＫａＲａ公司，胶回收试剂盒购自ＯＭＥＧＡ
公司，所需的引物合成及ＰＣＲ产物测序由北京奥
科鼎盛生物科技公司完成。
１．３　试验方法
１．３．１　ＤＮＡ提取
采用 ＣＴＡＢ 法 提 取 供 试 材 料 的 基 因 组
ＤＮＡ［１７］，略作调整。
１．３．２　ＲＡＰＤ分析
以１０份供试材料的ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ
分析，经过反复筛选后，建立了本实验的反应体系
和扩增程序。２０μＬ的反应体系包括１０×ＰＣＲ
Ｂｕｆｆｅｒ　２μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５μｍｏｌ·ｍＬ
－１）２μＬ，
ＲＡＰＤ引物（２．５μｍｏｌ·ｍＬ
－１）２μＬ，ＭｇＣｌ２（２．５
ｍｍｏｌ· ｍＬ－１）１ μＬ，模 板 ＤＮＡ（５０～１００
μｇ·μＬ
－１）２μＬ，Ｔａｑ酶（５Ｕ·μＬ
－１）０．２μＬ，
ｄｄＨ２Ｏ　１０．８μＬ。扩增程序：９４℃预变性４ｍｉｎ；
９４℃变性４５ｓ，３２℃或３４℃（依ＲＡＰＤ引物而
定）退火５０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，进行４０个循环反
应；７２℃延伸１０ｍｉｎ，１６℃冷却。
·２· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３５卷
表１　亲本华山新麦草、亲本普通小麦７１８２、中国春和小麦－华山新麦草全套异附加系（１Ｎｓ－７Ｎｓ，２ｎ＝４４＝２２Ⅱ）
Ｔａｂｌｅ　１　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ　Ｋｅｎｇ，ｃｏｍｍｏｎ　ｗｈｅａｔ　７１８２，Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ｓｐｒｉｎｇ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｓｅｔ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ－Ｐ．ｈｕａｓｈａｎｉｃａｄｉｓｏｍｉｃ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｌｉｎｅｓ（１Ｎｓ－７Ｎｓ，２ｎ＝４４＝２２ＩＩ）
编 号
Ｃｏｄｅ
材料编号
Ｐｌａｎｔ　ｃｏｄｅ ２ｎ
染色体构成Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
（华山新麦草同源群组Ｐ．ｈｕａｓｈａｎｉｃａ　ｈｏｍｏｅｌｏｇｏｕｓ　ｐａｉｒ）
１ 华山新麦草　Ｐ．ｈｕａｓｈａｎｉｃａ　 １４　 １４Ｎｓ
２　 ７１８２　 ４２　 ４２Ｗ
３ 中国春　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ ４２　 ４２Ｗ
４　 １Ｎｓ附加系１４－６－４－１　１Ｎｓ　ＤＡＬ　１４－６－４－１　 ４４　 ４２Ｗ ＋２Ｎｓ（１）
５　 ２Ｎｓ附加系３－６－４－１　２Ｎｓ　ＤＡＬ　２２－２－５－１　 ４４　 ４２Ｗ ＋２Ｎｓ（２）
６　 ３Ｎｓ附加系２２－２－５－１　３Ｎｓ　ＤＡＬ　２２－２－５－１　 ４４　 ４２Ｗ ＋２Ｎｓ（３）
７　 ４Ｎｓ附加系２０－５－１－１　４Ｎｓ　ＤＡＬ　２０－５－１－１　 ４４　 ４２Ｗ ＋２Ｎｓ（４）
８　 ５Ｎｓ附加系４－８－１０－２　５Ｎｓ　ＤＡＬ　４－８－１０－２　 ４４　 ４２Ｗ ＋２Ｎｓ（５）
９　 ６Ｎｓ附加系５９－１１－１－１　６Ｎｓ　ＤＡＬ　５９－１１－１－１　 ４４　 ４２Ｗ ＋２Ｎｓ（６）
１０　 ７Ｎｓ附加系２－１－６－３　７Ｎｓ　ＤＡＬ　２－１－６－３　 ４４　 ４２Ｗ ＋２Ｎｓ（７）
　　ＤＡＬ：二体附加系；Ｎｓ和 Ｗ分别表示华山新麦草染色体和小麦染色体
ＤＡＬ：Ｄｉｓｏｍｉｃ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｌｉｎｅｓ；Ｎｓ　ａｎｄ　Ｗ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　Ｐ．ｈｕａｓｈａｎｉｃａａｎｄ　ｗｈｅａｔ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
　　ＰＣＲ扩增产物用８％非变性聚丙烯酰胺凝胶
电泳进行检测，硝酸银染色后，观察并拍照。
１．３．３　扩增产物的克隆及测序
按上述反应体系和条件，批量扩增后小心切
下特异条带，用聚丙烯酰胺凝胶回收试剂盒进行
回收。将回收得到的 ＤＮＡ 片段与 ｐＭＤ１９－Ｔ
Ｖｅｃｔｏｒ连接，连接产物转入大肠杆菌ＤＨ５α感受
态细胞后挑选阳性克隆，委托北京奥科鼎盛生物
科技公司进行测序。
１．３．４　测序结果的分析与ＳＣＡＲ引物设计
将得到的核苷酸序列在ＮＣＢＩ网站中进行比
对。根据序列分析结果，用Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０
软件设计ＳＣＡＲ特异引物，由北京奥科鼎盛生物
科技公司合成。
１．３．５　ＳＣＡＲ分析
用特异ＳＣＡＲ引物进行ＰＣＲ检测。扩增体
系不变，将扩增程序调整为９４℃预变性５ｍｉｎ；
９４℃变性５０ｓ，６０℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１
ｍｉｎ，３５个循环反应；７２℃延伸５ｍｉｎ。扩增产物
用１％的琼脂糖凝胶电泳检测，ＥＢ染色后紫外灯
下照相保存。
２　结果与分析
２．１　引物筛选
用Ｒ１－Ｒ１５０这１５０条引物对本实验的１０个
材料进行初步筛选，共有７条引物能够在华山新
麦草和华山新麦草的３Ｎｓ二体附加系上扩增出
明显的特异条带，经多次重复筛选后，只获得２条
稳定性好、重复性强且条带清晰的引物 Ｒ－１１３
（ＧＧＡＡＣＧＣＴＡＣ）和 Ｒ－１２５（ＣＡＣＣＡＧＧＴＧＡ），
见图１、图２。
　　Ｍ：ｍａｒｋｅｒ；１：华山新麦草；２：普通小麦７１８２；３：中国春；４：１Ｎｓ二体附加系；５：２Ｎｓ二体附加系；６：３Ｎｓ二体附加系；７：４Ｎｓ二体附加
系；８：５Ｎｓ二体附加系；９：６Ｎｓ二体附加系；１０：７Ｎｓ二体附加系；箭头所示为华山新麦草和华山新麦草的３Ｎｓ二体附加系上的特异扩增
产物。图２、图５、图６与此相同
Ｍ：ｍａｒｋｅｒ；１：Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ　Ｋｅｎｇ；２：Ｃｏｍｍｏｎ　ｗｈｅａｔ　７１８２；３：Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ；４：１Ｎｓ　ｄｉｓｏｍｉｃ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｌｉｎｅ；５：２Ｎｓ　ｄｉ－
ｓｏｍｉｃ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｌｉｎｅ；６：３Ｎｓ　ｄｉｓｏｍｉｃ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｌｉｎｅ；７：４Ｎｓ　ｄｉｓｏｍｉｃ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｌｉｎｅ；８：５Ｎｓ　ｄｉｓｏｍｉｃ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｌｉｎｅ；９：６Ｎｓ　ｄｉｓｏｍｉｃ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｌｉｎｅ；１０：
７Ｎｓ　ｄｉｓｏｍｉｃ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｌｉｎｅ；Ａｒｒｏｗｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ　Ｋｅｎｇ　ａｎｄ　ｉｔｓ　３Ｎｓ　ｄｉｓｏｍｉｃ
ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｌｉｎｅ．Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ａｒｅ　ａｓ　ｉｎ　Ｆｉｇ．２，Ｆｉｇ．５ａｎｄ　Ｆｉｇ．６
图１　ＲＡＰＤ引物Ｒ－１１３在１０个供试材料中的扩增结果
Ｆｉｇ．１　Ｂａｎｄｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ＲＡＰＤ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｒ－１１３ｉｎ　ｔｈｅ　１０ｔｅｓｔｅｄ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ
·３·第１期 苏佳妮等：华山新麦草３Ｎｓ染色体特异ＳＣＡＲ标记的开发
２．２　特异片段的克隆、测序及序列比对
从３Ｎｓ二体附加系上回收 Ｒ－１１３和 Ｒ－１２５
批量扩增出的特异片段，克隆后测序得到两个全
长分别为５４３ｂｐ和５１５ｂｐ的片段，命名为ＦＲ－１１３
（５４３ｂｐ）和ＦＲ－１２５（５１５ｂｐ），其序列分别见图３、
图４。
２．３　特异引物的设计与验证
用Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０软件对ＦＲ－１１３和ＦＲ－１２５
设 计 特 异 ＳＣＡＲ 引 物 Ｓ－１１３ 和 Ｓ－１２５，其
序列分别为Ｓ　１　１　３－Ｆ：ＣＧＡＡＴＴＧＧＡＴＴＧＧＣＡ
ＧＡＧＧＧＡ；Ｓ　１　１　３－Ｒ：ＡＣＧＡＴＣＴＣＣＣＴＡＣＧＡＡ
ＴＴＧＣＡ；Ｓ　１　２　５－Ｆ：ＧＧＴＧＡＣＧＡＧＧＧＴＧＴＴＧ
图２　ＲＡＰＤ引物Ｒ－１２５在１０个供试材料中的扩增结果
Ｆｉｇ．２　Ｂａｎｄｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ＲＡＰＤ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｒ－１２５ｉｎ　ｔｈｅ　１０ｔｅｓｔｅｄ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ
　　 下划线部分为ＲＡＰＤ引物位置；方框部分为ＳＣＡＲ引物位置。下图同
Ｔｈｅ　ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ　ｐａｒｔ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｔｈｅ　ｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲＡＰＤ　ｍａｒｋｅｒ；Ｔｈｅ　ｂｏｘ　ｐａｒｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｔｈｅ　ｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＣＡＲ　ｍａｒｋｅｒ．Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ａｒｅ　ａｓ　ｉｎ
Ｆｉｇ．４
图３　ＦＲ－１１３的核苷酸序列
Ｆｉｇ．３　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＦＲ－１１３
图４　ＦＲ－１２５的核苷酸序列
Ｆｉｇ．４　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＦＲ－１２５
·４· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３５卷
ＧＡＴＧ；Ｓ１２５－Ｒ：ＡＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＧＧＧＴＣＴ
ＴＴ。用这两对ＳＣＡＲ引物验证发现：在所有供
试材料中，只有在华山新麦草和其３Ｎｓ二体附加
系中能扩增出一条与目标片段大小相符的特异片
段，而在其他供试材料中都扩增不出此片段（图
５、图６），表明该片段为华山新麦草３Ｎｓ染色体组
特有。此结果证明 ＲＡＰＤ标记 Ｒ－１１３和 Ｒ－１２５
已经被成功转化为特异ＳＣＡＲ标记Ｓ－１１３和Ｓ－
１２５，可用于快速准确地鉴定华山新麦草３Ｎｓ染
色体。
图５　ＳＣＡＲ引物Ｓ－１１３在１０个供试材料中的扩增结果
Ｆｉｇ．５　Ｂａｎｄｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ＳＣＡＲ　ｐｒｉｍｅｒ
Ｓ－１１３ｉｎ　ｔｈｅ　１０ｔｅｓｔｅｄ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ
图６　ＳＣＡＲ引物Ｓ－１２５在１０个供试材料中的扩增结果
Ｆｉｇ．６　Ｂａｎｄｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ＳＣＡＲ　ｐｒｉｍｅｒ
Ｓ－１２５ｉｎ　ｔｈｅ　１０ｔｅｓｔｅｄ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ
３　讨 论
华山新麦草具有早熟、耐旱、抗寒、耐瘠薄、抗
病等多种优异基因，且其与小麦杂交具有较高的
受精率（３６．６７％）和成胚率（２６．６７％）［１８］，所以华
山新麦草的优异基因有望通过远缘杂交转移至栽
培小麦中，对小麦遗传改良和抗病育种意义重大。
本课题组对小麦－华山新麦草３Ｎｓ二体附加系２２－
２－５－１进行连续多年的自交和细胞学观察，发现其
染色体数目２ｎ＝４４，且９２％以上的染色体在花
粉母细胞减数分裂中期Ｉ能够以２２个二价体的
形式进行配对，不存在三价体和四价体现象，这说
明２２－２－５－１中的华山新麦草３Ｎｓ染色体已经稳
定地附加到了小麦背景中。田间形态学观察发
现，２２－２－５－１早熟性状突出，整体外形接近亲本
７１８２，但总体株高低于双亲，分蘖数、穗长、穗粒
数、小穗数和千粒重等农艺性状均优于双亲。用
我国北 方 麦 区 流 行 的 条 锈 病 小 种 （ＣＹＲ３１、
ＣＹＲ３２和Ｓｕ１１－１４）连续３年对其混合接种发现，
其亲本华山新麦草对条锈病表现为免疫，２２－２－５－１
表现为高抗，而其小麦亲本７１８２和条锈病对照品
种铭贤１６９均表现为易感。由此推测２２－２－５－１的
这些优异性状很可能来源于华山新麦草的３Ｎｓ
染色体，而且其携带的抗条锈病基因很可能尚未
被发掘。
目前对麦类远缘杂交后代的鉴定多依赖于形
态学和细胞学方法，不仅投入大、耗时长，且受环
境因素和人为因素影响大，实验人员一般需要经
验积累和系统培训，使得鉴定工作一直滞后，这在
很大程度上限制了优质种植资源在小麦遗传改良
中的应用。ＲＡＰＤ转ＳＣＡＲ分子标记辅助育种
技术是一种非常有效的鉴定手段，它既不依赖于
性状，也不需要严格的实验条件，可以在育种材料
较少的情况下，对低世代材料进行早期选择，极大
地提高了育种效率。这种检测方法在品种选育中
具有简单、快速、灵敏、准确、成本低等多项优点，
目前已在小麦育种中得到了初步应用［１９－２１］。如孟
亚雄等［２２］利用 ＲＡＰＤ 转 ＳＣＡＲ 技术，建立了
Ｓｕ１１－４小种的特异ＳＣＡＲ标记，为小麦条锈病的
诊断检测和抗病品种的选育提供了可靠依据。亓
晓莉等［２３］用此方法建立了禾谷孢囊线虫的快速
分子鉴定方法，提高了我国小麦产区禾谷孢囊线
虫的检测效率。但ＳＣＡＲ标记转换的成功率通
常很低，本研究最初筛选出的７个特异ＲＡＰＤ引
物，只有２个成功转化成了ＳＣＡＲ标记。究其原
因，很可能是反应体系不够灵敏、回收ＤＮＡ片段
被污染、引物设计不够合理、退火温度尚未达到最
佳等因素造成。可通过优化反应体系和循环次
数、多次纯化回收的ＤＮＡ片段、缩短引物长度、
提高退火温度等方法来改善［２４］。
本实验开发的华山新麦草 ３Ｎｓ染色体
ＳＣＡＲ标记稳定可靠、操作简单且检测效果好，其
试验方法对其他小麦近缘种属植物具有一定的参
考价值。但本研究只是小麦－华山新麦草分子标
记辅助育种的初探，在未来的研究中，可以考虑进
一步追踪和定位华山新麦草３Ｎｓ染色体上可能
蕴藏的抗条锈病基因，同时开发华山新麦草其他
染色体上的ＳＣＡＲ标记，并以这些ＳＣＡＲ标记作
为探针去筛选基因组文库，为构建华山新麦草物
理图谱奠定基础，使得华山新麦草在小麦育种中
·５·第１期 苏佳妮等：华山新麦草３Ｎｓ染色体特异ＳＣＡＲ标记的开发
发挥更重要的作用。
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·６· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３５卷