全 文 ：2007年第 2期(总第 109期) 广西 热 带 农业 25
滇桂艾纳香的灭菌和愈伤组织诱导
韦鹏霄 1 张明珍 1 岑秀芬 1 包国庆 2 陈 卓 2 陆雪梅 2
(1广西大学农学院 , 南宁 530005;2广西桂西制药有限公司)
摘 要:对滇桂艾纳香的不同部位进行不同灭菌处理 、不同基本培养基 、不同激素种类及浓度的
比较试验 , 结果表明:茎尖在 8%NaClO8+0.1%HgCl28的灭菌处理效果最好 , 菌污染率仅为 3.48%;
外植体不同部位的灭菌效果由好到差依次为茎尖 、叶片 、嫩茎 、花苞 、老茎;愈伤组织诱导率为茎尖>嫩
茎>叶片>花苞>老茎;最佳基本培养基为 MS ,愈伤组织的诱导率达到 86.67%;不同种类及浓度的激
素处理 ,分别以 6-BA1.0 mg/L、KT1.5 mg/L时较为适宜。
关键词:滇桂艾纳香 外植体 愈伤组织 污染率 诱导率
收稿日期:2007-1-23
项目资助:广西壮族自治区科学技术厅(桂科攻 0537017-3)和广西桂西制药有限公司。
作者简介:韦鹏霄 ,男 ,广西大学农学院副教授 ,硕士生导师。研究方向:植物生物技术 ,作物遗传育种 ,药用植物组织培养。
滇桂艾纳香[ Blumea riparia(BI.)DC.]属于菊科艾纳香
属植物 ,又名华艾纳香 、管芽(壮语), 《中国植物志》称其为
假东风草 ,是多年生草本珍稀药用植物 [1]。近年来 ,随着市
场的需求越来越大 , 野生的滇桂艾纳香药材被大量采收使
用 ,使得野生的药材资源正急剧减少 ,药材质量逐渐下降。
由于滇桂艾纳香的自然繁殖速度缓慢 , 再加上环境污染和
大规模的采伐林木等因素的影响 , 致使其野生资源恢复缓
慢 , 能提供给医药的原料质量不稳定 。滇桂艾纳香目前尚
无有关人工栽培 、 育种研究和组织培养的报道 。本试验利
用滇桂艾纳香的茎尖 、 茎段 、叶片 、花苞等外植体进行诱
导 , 以培育优良的组培种苗 ,提供人工栽培 ,为壮药滇桂艾
纳香的进一步保存与开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 外植体的选择与灭菌处理
选取野生的滇桂艾纳香健壮植株 ,分为茎尖 、嫩茎 、老
茎 、叶片和花苞 5个不同部位 ,以NaClO 、HgCl2和H 2O2 3种
不同灭菌剂种类及组合分别设计为单因子 、双因子和三因
子的灭菌处理 , 进行不同浓度和不同处理时间的比较试
验 ,以筛选出适宜不同外植体的灭菌处理。
1.2 培养基的设计与配制
1.2.1 不同基本培养基比较试验
分别以 MS 、改良MS 、B5、White 、Miller和 N6为基本培养
基 ,使用相同的激素水平和附加成分 ,以筛选出适宜外植体
愈伤组织诱导的基本培养基。
1.2.2 不同激素种类与浓度比较试验
以 MS为基本培养基 , 分别附加 6-BA 、KT 2种激素 ,
并设为 0.5 mg/L、1.0 mg/L 、1.5 mg/L、2.0 mg/L和 2.5 mg/
L 5种浓度 , 以筛选出适宜外植体诱导愈伤组织的激素种
类及浓度。
上述培养基均添加 5 g/L的琼脂 , 25 g/L的蔗糖 , pH值
5.8 ,高温高压消毒灭菌 。
1.3 外植体的接种与培养
外植体的接种:将灭菌处理后的不同外植体接入诱导
培养基中 。茎尖长约 2 cm、嫩茎长约 3.5 cm 、老茎长约 3.5
cm 、叶片大小为(1.0×0.6)cm2、花苞长约 1.0 cm。接种数量
视不同外植体而定 , 一般茎尖为 3个/瓶 ,嫩茎为 4段/瓶 ,
老茎为 4段/瓶 ,叶片为 10块/瓶 ,花苞为 10个/瓶 。外植体
灭菌试验每个处理接 30瓶 , 设 5个重复;基本培养和激素
比较试验每个处理接 30瓶 ,设 3个重复。
外植体的培养:接种后的外植体置于室温 25～ 28 ℃下
培养 ,前期予以黑暗条件 , 后期予以光照条件 ,光照强度为
1000～ 1200 Lux ,光照时间为 10～ 12 h/d 。
1.4 灭菌与诱导效果的观测统计
在外植体接种后 10 d ,观察不同处理的菌污染情况 ,统
计菌污染率接种后 15 d , 观测不同处理的愈伤组织发生情
经 作
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况 ,统计愈伤组织诱导率。
2 结果与分析
2.1 不同灭菌处理的灭菌效果
2.1.1 不同外植体的单因子灭菌处理效果
对茎尖 、嫩茎 、老茎 、叶片和花苞 5种外植体 , 分别用
8%、10%、15%的NaClO或 0.10%、0.15%的HgCl2进行单
因子灭菌剂的不同灭菌时间的对比试验 , 结果单独使用
NaClO材料全部被菌污染;低浓度的升汞(0.10%HgCl2)灭
菌效果也很差 ,除了茎尖处理 10 min 、嫩茎处理 12 min和老
茎处理 14 min 的菌污染率分别在 82.63%、 86.47%和
92.15%以外 , 其余处理的菌污染率均为 100%。高浓度的
升汞(0.15%HgCl2)虽然降低了菌污染率 ,但降低的幅度不
大 , 污染率最低仅为 80.24%, 且对材料的伤害大 , 难以诱
导出愈伤组织 ,灭菌效果也不理想 。
2.1.2 不同外植体的双因子灭菌效果比较
从表 1可见 ,外植体采用双因子进行灭菌处理 ,菌污染
率大幅度降低 , 且愈伤组织诱导率有不同程度地提高 。高
浓度灭菌剂的组合处理(A3 、B3、C3、D3和 E3)的菌污染率
虽然在各双因子组合处理中最低 , 但是相对的愈伤组织诱
导率也降低 。在 5种外植体中 ,以茎尖的灭菌效果最好 ,其
中 A1处理的菌污染率仅为 3.48%, 而愈伤组织诱导率高
达 86.67%, 这可能是由于茎尖本身带菌较少且易于灭菌
和茎尖作为活跃生长部位的活力较强;叶片的灭菌效果次
之 ,其中 D1处理的菌污染率为 7.33%,愈伤组织诱导率为
68.67%;嫩茎的灭菌效果再次之 ,其中 B1处理的菌污染率
为 17.59%,稍微偏高 ,愈伤组织诱导率为 74.55%;花苞的
灭菌效果较差 ,菌污染率为 22.69%～ 25.64%;老茎的灭菌
效果最差 ,菌污染率达 24.69%～ 27.24%。5种不同外植体
比较 ,菌污染率高低依次为:茎尖<叶片<嫩茎<花苞<老
茎;愈伤组织诱导率高低依次为:茎尖>嫩茎>叶片>花
苞>老茎。
表 1 不同外植体的双因子灭菌处理效果
外植体部位 处理代号 灭菌时间(min) 菌污染率(%) 愈伤组织诱导率(%)8%NaClO 10%NaClO 15%NaClO 0.10%HgCl2 0.15%HgCl2
茎尖 A1 8 - - 8 - 3.48 86.67
A2 - 8 - 8 - 3.06 79.52
A3 - - 8 8 - 2.84 69.54
嫩茎 B1 8 - - 8 - 17.59 74.55
B2 - 8 - 8 - 13.51 70.59
B3 - - 8 8 - 12.07 64.42
老茎 C1 8 - - - 8 27.24 26.34
C2 - 8 - - 8 27.02 23.81
C3 - - 8 - 8 24.69 20.44
叶片 D1 8 - - 8 - 7.33 68.67
D2 - 8 - 8 - 6.86 66.00
D3 - - 8 8 - 5.25 60.50
花苞 E1 6 - - 8 - 25.64 49.16
E2 - 6 - 8 - 23.46 43.45
E3 - - 6 8 - 22.69 40.26
2.1.3 不同外植体的三因子灭菌效果比较
从表 2可以看出 , 外植体的三因子灭菌处理与双因子
处理相比 ,除了花苞的菌污染率有较明显的降低以外 ,其余
的茎尖 、嫩茎 、老茎和叶片 4个部位的菌污染率均没有明显
的降低。茎尖的三因子灭菌处理最低菌污染率为 2.56%,
比双因子处理的最低菌污染率低 0.28个百分点;叶片的三
因子处理最低菌污染率为 5.12%,比双因子的低 0.13个百
分点;嫩茎的三因子处理最低菌污染率为 10.94%,比双因
子的低 1.13个百分点;老茎的三因子处理最低菌污染率为
24.29%,比双因子的低 0.40个百分点;花苞的三因子处理
最低菌污染率为 18.44%,比双因子的低 4.25个百分点 。5
种不同外植体的菌污染率高低依次为:茎尖 <叶片 <嫩茎
<花苞<老茎;愈伤组织诱导率高低依次为:茎尖>嫩茎>
叶片>花苞>老茎。
2.2 不同外植体愈伤组织诱导效应
在双因子的灭菌处理试验中 , 茎尖的愈伤组织诱导率
最高达到 86.67%, 嫩茎的诱导率最高为 74.55%, 叶片的
诱导率最高为 68.67%, 花苞的诱导率最高为 49.16%, 老
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茎的诱导率最高为 26.34%;与茎尖的诱导率相差 60.33个
百分点(见表 1)。在三因子试验中 ,茎尖的愈伤组织诱导率
最高为 56.17%, 嫩茎的诱导率最高为 49.23%, 叶片的诱
导率最高为 46.14%, 花苞的诱导率最高为 40.17%, 老茎
的最高诱导率为 16.67%;与茎尖的诱导率相差 39.50个百
分点(见表 2)。由试验结果可以看出 ,外植体不同部位的愈
伤组织诱导能力不同 ,在双因子处理和三因子处理试验中 ,
各部位诱导愈伤组织所得出的结果是一致的 , 愈伤组织诱
导能力为茎尖>嫩茎>叶片>花苞>老茎。
表 3 不同基本培养基对不同外植体的愈伤组织诱导效果
外植体部位 愈伤组织诱导率(%)
MS 改良MS B5 White Miller N6
茎尖 82.56 75.46 79.46 63.78 69.47 64.78
嫩茎 71.58 60.49 65.48 48.76 54.79 49.86
老茎 31.48 24.58 28.46 16.78 50.79 18.48
叶片 78.95 66.67 70.35 50.52 55.40 52.94
花苞 48.28 37.49 42.57 24.78 31.48 26.49
2.4.1 不同 6-BA浓度对愈伤组织诱导的效应
由表 4可知 , 6-BA浓度对外植体的愈伤组织诱导有
着重要的影响 , 愈伤组织诱导率随着 6-BA浓度的增加呈
现先上升后下降的趋势 ,以 6-BA浓度为 1.0 mg/L时 , 外
植体的愈伤组织诱导率最高 ,而在 6-BA浓度为 2.5 mg/L
时愈伤组织诱导率为最低;在不同 6-BA浓度处理中 , 均
以茎尖的愈伤组织诱导率最高 , 老茎的愈伤组织诱导率最
低 ,两者的最高愈伤组织诱导率相差 55.99个百分点 ,差异
极显著 。
2.4.2 不同 KT浓度对愈伤组织诱导的效应
表 5显示 ,愈伤组织的诱导率也随着KT浓度的增加呈
现先上升后下降的趋势 , 以 KT浓度为 1.5 mg/L时外植体
的愈伤组织诱导率最高 , 而 KT浓度 2.5 mg/L时的愈伤组
织诱导率最低;在不同KT浓度处理中 ,均是以茎尖的愈伤
表 2 不同外植体的三因子灭菌处理效果
2.3 不同基本培养基对愈伤组织诱导的效应
从表 3可知 , 在同一部位不同基本培养基的愈伤组织
诱导试验中 ,愈伤组织诱导率最高的是 MS培养基 ,诱导效
果依次为 MS>B5>改良 MS>Miller>N6>White;在同一培
养基不同部位的愈伤组织诱导试验中 , 茎尖的愈伤组织诱
导率最高 ,达到 82.56%,其它部位诱导率由高到低依次为
叶片 、嫩茎 、花苞 、老茎。
2.4 不同激素处理对愈伤组织诱导的效应
外植体
部位
处理
代号
灭菌时间(min) 菌污染率
(%)
愈伤组织诱
导率(%)8%NaClO 10%NaClO 15%NaClO 0.10%HgCl2 0.15%HgCl2 3%H2O2 5%H2O 2
茎尖 F1 8 - - 8 - 5 - 3.33 56.17
F2 - 8 - 8 - 5 - 3.01 54.25
F3 - - 8 8 - 5 - 2.56 52.50
嫩茎 G1 8 - - 8 - - 5 15.87 49.23
G2 - 8 - 8 - - 5 12.82 48.42
G3 - - 8 8 - - 5 10.94 45.64
老茎 H1 8 - - - 8 - 5 25.73 16.67
H2 - 8 - - 8 - 5 25.26 15.21
H3 - - 8 - 8 - 5 24.29 14.50
叶片 I1 6 - - 8 - - 5 6.83 46.14
I2 - 6 - 8 - - 5 6.20 44.40
I3 - - 6 8 - - 5 5.12 41.59
花苞 J1 6 - - 8 - 8 - 22.29 40.17
J2 - 6 - 8 - 8 - 19.85 38.45
J3 - - 6 8 - 8 - 18.44 35.26
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组织诱导率位居第一 , 其中诱导率最高达 76.24%,但仍比
同浓度的 6-BA低 2.32个百分点 , 比最适合的 6-BA浓
度低了 6.91个百分点。总体来看 ,不同浓度的KT处理的愈
伤组织诱导率均比同水平的 6-BA处理稍低。
3 讨论
3.1 不同灭菌处理对外植体灭菌效果的影响
野外生长的滇桂艾纳香 , 茎杆与叶片都长有柔嫩的细
毛 ,带菌较多 ,导致污染率高 ,给外植体的消毒灭菌带来许
多困难 , 也是滇桂艾纳香组培快繁的技术难点之一 。从试
验中可知 ,单因子的灭菌处理强度不够 ,不能有效地杀死细
菌 ,对双因子和三因子的灭菌处理进行比较 ,虽然三因子处
理的菌污染率比双因子低 ,但降低的幅度不明显 ,且愈伤组
织诱导率显著下降 。这可能是因为在三因子处理中添加了
不同浓度的双氧水 , 由于双氧水的氧化性强 , 致使材料褐
死。所以 ,为了获得较高的愈伤组织诱导率 ,选择双因子的
灭菌处理比较适宜 。
3.2 不同的外植体对愈伤组织诱导的影响
外植体的不同部位对愈伤组织的诱导试验中 , 在同一
诱导条件下 ,茎尖 、嫩茎 、叶片比较容易诱导出愈伤组织 ,且
愈伤组织的状况和长势也比较好 。究其原因可能是茎尖的
分生组织细胞分裂旺盛 , 同时茎尖也是内源激素合成的场
所 ,所以茎尖的诱导效果最好;其次是嫩茎 ,嫩茎属于柔嫩
的材料 ,生理活性强 ,比较容易诱导出愈伤组织 。老茎则由
于木质化程度高 ,难以诱导出愈伤组织。为此 ,在进行滇桂
艾纳香的愈伤组织诱导培养时 ,可选择茎尖 、嫩茎或叶片作
为外植体。
3.3 不同基本培养基对外植体诱导愈伤组织的影响
以 MS 、改良MS 、B5、White 、M iller 、N 6 6种基本培养
基 ,对滇桂艾纳香的茎尖 、嫩茎 、老茎 、叶片和花苞进行了愈
伤组织的诱导比较试验 , 结果表明 MS培养基的诱导率最
高 。MS 培养基的基本特点是无机盐含量高 ,铵态氮和硝态
氮的比值较高 ,营养全面 ,能满足植物组织细胞生长对矿物
质营养的要求。因此 ,MS 培养基比较适用于滇桂艾纳香的
外植体诱导 。
3.4 不同激素处理对愈伤组织诱导的影响
不同浓度的 6-BA 和 KT 对诱导愈伤组织的试验结
果表明 , 6-BA 的使用效果最好 , 不仅愈伤组织诱导率高 ,
其产生的愈伤组织质量好;在同一浓度下 , 6-BA 处理的
愈伤组织诱导率均比 KT 的高;在 5个梯度浓度中 ,以 6-
BA 在 1.0 mg/L时的愈伤组织诱导率最高 ,而KT 的适宜
浓度是 1.5 mg/L , 这也说明 6-BA 的生理活性比 KT
强 。由此 ,在使用激素诱导滇桂艾纳香愈伤组织时 ,可优先
考虑使用 6-BA 。
参考文献
[ 1] 林 等 .中国植物志(75卷).科学出版社 , 1979.13～
15
表 4 不同 6-BA浓度对不同外植体愈伤组织诱导率的效应(%)
外植体部位 6-BA浓度(mg/L)
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
茎尖 72.49 83.15 78.56 74.63 68.05
嫩茎 63.49 69.49 65.68 61.42 56.96
老茎 24.95 27.16 26.87 25.98 22.59
叶片 69.79 76.64 69.97 69.98 65.45
花苞 44.84 49.48 47.87 45.86 40.76
外植体部位 KT浓度(mg/L)
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
茎尖 62.64 68.49 76.24 72.53 61.57
嫩茎 56.89 61.48 65.58 60.48 54.46
老茎 23.79 24.59 26.96 25.75 21.48
叶片 59.09 66.67 70.59 68.42 55.63
花苞 40.58 42.57 45.67 44.57 38.46
表 5 不同 KT浓度对不同外植体愈伤组织诱导率的效应(%)