全 文 ：位肠 t 健德必执 只 , t hP脚“ 汀勿 , 一` m m un 介。 lot sn 、 19 的 (幻: 肠~ 胎
凤仙花中花色素昔累积与苯丙氨酸解氨酶的关系
柯奕晃王 奚 惕 (东北师范大学生物系 , 长春 1 30 。、 )
R e la t io n sb i p be wt
e e n ht e A c e um
u la t i o n of A n 比o e y a n i n a n d
P k e n y la la n i n e A
~
o n i a L v a s e i n I, n p a t i e n s b ol s am
i n a
H E Y i一 K u n , X 工 iT (决脚时~ 云可及。 ot 卯
,
N州子记哪亡刀份 ,加不 U耐们叮对句, C ha 叼 c为伽 1以扔 2幻
提要 在 M S 、 w hi et 、氏 、 s H 4 种培养基中 , W h i et 对花色素普累积较有利 。 色素产量随继代次
数增加而降低 。 乌 冬D 抑制 P 人 L 活性及花色素普累积 , 在一定浓度范围内 B人 的效果与之相反。
不同搪源 、 温度对花色素昔含量有影响 , 但与 P人L 活性无正相关性。
植物花色素普作为一种食品着色剂正受
到广泛的重视 。 由子野生植物资源 的 限制 ,
利用植物组织培养技术工厂化生产花色素昔
具有重要意义 , 国外已有专利申请山 。 花色
素昔累积受激素 、光 、 温度 、 糖 、 p H 值等多种
因子的影响 。 P A L 是植物苯丙酸类代谢 途
径中的一个关键酶 , 对木质素 、 类黄酮物质
(如花色素昔 ) 的合成起调节作用 。 但是 , 在
不同外界因子影响下 , 花色素昔累积与 P A L
活性的相关性结论不一 。 W el lm a n 图 , G er go r
等即 , E e运 z m a n n 等闭 , S憾业 等`5 , , o z e匕
等即 发现花色素昔含量与 P A L 活性呈 正相
关 。 伪8n 七a be l 等m , S u g a n 。 等 8[] 认为两者
之间无正相关性 。 我们以凤仙花愈伤组织为
实验材料 , 对不同外界因子影响花色素昔累
积与 P A L 活性的相关性进行了研究 , 为进一
步探讨提高花色素昔产量 、 花色素昔累积的
机理提供了方便的实验系统 ; 为工厂化生产
拓色素昔打下基础 。
材 料 和 方 法
M S 培养基 。 待无菌苗长到 3 ~ s om , 取下胚
轴切段 ( 3~ 6 m m ) 接种于含不同激素的 M S
培养基上 , 从中筛选出以含 2 , 企D O . 1 (m以
L
, 单位下同 )十 B A O二 为继代培养基 。 挑
选生长 良好 、 均一的愈伤组织 , 2 0 天继代一
次 , 3~ 4 次以后作各种处理实验 。 培养温度
2 5土 2“ G , 光照 1 0 ~ 1 2 小时 , 光强约 1 《X心 l x o
花色素普的提取和鉴定 取一定盘愈伤
组织 (紫红色 ) 切碎 , 用 1外H ol 甲醇室温下
浸泡 3 小时左右 , 反复几次 , 到最后一次提取
液无色 。 用岛津 U V e 3 0 0 0 紫外分光光度计
作提取液的吸收光谱 (图 1 ) , 在 53 5 n m 有一
峰值 。 提取液的酸碱反应 , 从 p H 1 . 5、 p H
12
.
0
, 提取液逐渐由红变黄 , 最后成为蓝色。
证明提取液主要含花色素昔 。
花色案昔含 t 测定 定容后的色素提取
液用 7 51毛 型分光光度计测其 53 5 n m 的光
吸收值 (A ) , 以克鲜重在 1 0 m l 提取液的 0 . 1
A 为一个色素单位 。 培养的第 1石天测其色
素含量 。
愈 伤 组 织 诱 导 凤 仙 花 ( I饥夕晚坏枷 :
加1sa 仍咖a) 种籽经表面灭菌后接种于无激素
收稿 1 9 8 年 3 月 24 日
致谢 陈龙生同志协助绘图。
1 现在地址南充师范学院。
DOI : 10. 13592 /j . cnki . ppj . 1989. 02. 012
P人L 活性测定 按王敬文叭 、 欧 阳光
察助 , 的方法 , 以变化 O . 01 A 2 90 n m g 一王 F W
h
一 1 为一个酶活力单位 。 培养的第 场 天测
定。
波长砚n m )
图 1 色素提取掖的吸收光谱
实验重复 3 次 , 每个处理取有代表性的
三个样品求其平均值 。
结 果 与讨 论
1
. 不同培养基对愈伤组织生长 及 花色
素普含 t 的影响 4 种培 养基 附加激 素
2
,
4 , D o
.
1 + B A 0
.
1
。如图 2 所示 , 愈伤组织
生长串峰在第 10 夭 , 花色素背含量峰在第
1 5 天 。 B S对愈伤组织生长有利 , 但色素含量
不高。 W五主加对两者均较 好。 选择 W ih 加
为以下实验的基本培养基 。
L i n 山ey , Y eo m a n 观察到迅 速生长 的
细胞累积次生物质较少 , 高度分化的细胞趋
向于累积次生物质 , 并提出用蛋白质 、核酸合
成抑制剂控制代谢方向 , 增加次生产物累积 。
我们的实验结果似乎支持 了这种观 点 。 另
外 , 4 种培养基的总氮量 (N H才+ N O刃 差异
较大 。 sM 的总氮约为 w 址加 的 8 倍 。 、 v 五, et上的愈伤组织花色素昔含量较高 , 可能与缺
氮不利于氮代谢 (如蛋白质合成 ) , 而糖代谢
相对活跃有关 , 这与 工公 w a 刃旧o n 以幻 发现玉米
缺氮后累积较多花色素普的结果相似 。
2
. 不同继代次数对花色紊昔含 t 的 影
晌 花色素昔含量峰期在第 3~ 6 代 , 以后
随继代次数增加而逐渐降低 (图 3) 。 产量降
低的原因可能有两种 : (1) 由外植体发生的愈 .
伤组织中只有部分细胞能合成花色素昔 , 不
断地扩大培养使这些细胞 “稀释 ” , 导致产量
下降; ( 2 )也可能象玩 r k址 等人幽认为的那
样 , 培养过程中 , 由于细胞的染色体畸变引起
产量不稳 。 我们在继代培养愈伤组织时 , 挑
选生长良好 、 均一的材料 , 接触培养基的下部
淡黄色 , 上部为紫红色 。 如只选取顶部含色
素高的较小部分 (小于 0 . 3 m m勺培养 , 则愈
伤组织生长不良、 寻找高产 、 枷七的培养条
件还有待于深入的研究 。
侧备恢切
1420
(欲ù膝琳州1402柳80田42
8
祖七俄斗侧切
R 5
5 H
、V h l t e
M 5
时问 〔d )
图 2 不同培养基对生长 、花色素昔含量的影响
.
36
·
继代次数
图 3 不同继代次数对花色素普含量的影响
8
. 不同激紊对愈伤组织生长 、 花色紊普
含皿的影响 如图 4 所示 , 单用生长素类
过斗城习1086
164 2印40 2的,孟.二人二
执欲à辞琳州
N人 A B 人 Z T
0
.
1 0
.
1 伙 1 0 . 5 0 . 5 0 . 5
0
. 工0 . 1 0 . 1 0 . 1
B A
0
.
1 0
, 舀 1 . 0
0 1 0
.
1 0
.
1 0
.
1 公 , 1
B A B A
氏 1 0 .与 1 . 0 2 . 0 0 . 1
0
.
1
.
0
.
1 0 : 1
0
一
5 1
.
0 2
.
0
图 4 不同激素 ( m g / L )对愈伤组织生长 、花色素普含量的影响
激素有利于愈伤组织生长 , 但花色素昔含量
较低 ; 单用细胞分裂素类激素其结果相反 。 当
两种激素配合使用时 , 似都能找到一个对生
长、 色素累积较好的组合 。 2 , 奋D 0 . 1 + B A
0
.
5
; N AA 0
.
1 + B A I
,
0 ; I A A 0
.
1 + B A 2
.
0
为三组较优组合。 不同植物生长调节剂在不
同实验材料中 , 影响生长 、 花色素昔累积的效
果不同。 在凤仙花愈伤组织中 , 不同调节剂
是否通过调控 P A L 活性来影响花色素昔产
量李 我们为此作了以下实验。
4
. 激素对 P A L 活性 、 花色案昔含盆的
影响 表 1 结果表明 , 单独使 用 2 , 4尸 D ,
r A L 活性 、 花色素昔含量较低 ; B A ,提 高
卫A L 活性 , 促进色素累积 。 两种激素配合使
用时 , 在一定浓度范围内 B A 能减少 2 , 4 se D
对 P A L 活性 、 色素累积的抑制作用 ; 但 B A
浓度超过某一限度后 (如表中 B A S . 0 时 ) , 对
r A L 活性 、 色素累积均产生抑制作用。
表 l 激素对愈仿组织的 p A L 活性、
花色素普含量的影响
激 素 P A L 活性 色素单位
8670加341招552 , 4 一 D Z . 0
2
, 婆一刃 0 . 5
2
,
4 一 D O
.
5 + B A O
.
5
民 4 一D O . 5 + B A 3 . O
2
,
4
一
!以 ) . -5 卜B A S . 0
B A O
.
5
1 12
.
7
1 1 0
.
4
1 5 9
.
0
日2 1 . 0
8 6
.
3
全6 4 . 1
不同激素种类 、 浓度对花色素普累积 ,
P A L 活性的影响结果不同 。 人 l fer m~
以叹
Ibr a址m 发现 I A A 、 N A A 、 2 , 奋D 对胡萝 卜
愈伤组织累积花色素昔有利 , 由五m lt z 则认
为 G A 抑制 花色素昔累积 。 B la k el y 以 ,a
S侧。 kl a n d 发现 N A A、 2 , 奋 D 抑制单冠毛
菊 (丑碑尸吻叩夕材 : 尹助感孙` ) 愈伤组织累积花
色素昔 , oO sn 七a be l币 则认为 N人A 、 IA A 、
2 , 奋 D 促进这种植物悬浮培养细胞 的花 色
素昔累积 。 结果的多样性可能与激 素浓度 、
错养材料的生理状态 、 培养条件等多种因素
有关。 激素影响花色素昔累积与 P A L 活性
的结果也有两种。 oz e h 闭 在胡萝 卜悬浮细
胞培养中发现 , 当加入 , , 4尸 D (5 x 10 一了mo l/
L )时 , P A L 活性 、 花色素昔含量下降; 当除去
2
, 奋 D 培养时 , 酶活性 、 色素含量均增加 。
O
Z e匕 还发现玉米素 ( 1 0一下~ 1 0一 8 m o l / L ) 促
进花色素昔累积 , 但未作相应的 P A L 活 性
测定。 伪刀旧七a加 l m 发现单冠毛菊的细胞悬
浮培养中 , 较高浓度 N A A ( 5 x l 。“ m ol / L )
抑制花色 素昔累 积 , P A L 活 性变化却不
大 。 日u g a n 。囚 的实验结果与之相似 。 我们
的实验结果表明 , 2 , 今 D 通过抑制 P A L 活性
使花色素普含量降低 ; B A 在一定浓度 范围
内可以减轻 2 , 企D 对 P A L 的抑制 , 使色素
产量提高 ; 当 B人 超过某一阐值后 , 也产生抑
制作用 , 并与 2 , -4 D 产生累加抑制效应 。 我
月月月盯
们实验的不足在于未测定培养周期 中 PAL
活性的动态变化 , 故不能排除早期 P A L 活性
高 , 而测定时 P A L 活性较低 , 但花色素昔含
量较高的可能性。
吞. 不 同糖源 、 温度对 P A L 活性 、 花色
案昔含 t 、 愈伤组织生长的形响 果糖 、 葡
萄糖 、 蔗糖浓度均用 3多 。 恒温 2 5士 2叼 ;变
温白天 弱土 ZioC 夜晚 10 士 1℃ 。 果糖、 葡萄
糖 、 蔗糖对花色素昔含量的效应依次增加 ,
P A L 活性与之无正相关。 不同糖对愈 伤组
织生长影响无明显差异。 恒温 , 变温处理 , 前
者较有利于花色素昔累积和愈伤组织生长 ;
卫A毛括性与色素累积间无正相关性 (表 2 ) 。
不同糖源影响花色素昔累积的效果报道
不一 。 S tr a训以的 培养玉米胚乳时发现 , 3外
蔗糖对花色素昔累积的效果较果糖 、 葡萄糖
好 。 M吻u m咖“ 们在尸心瓜玩: 细胞 悬 浮培
养中认为 , 蔗糖较果 糖对花 色素昔 累积有
效 。 T hi m a n 以” 认为 蔗糖促进 毋渝闻咖
成夕时犷h伽苗形成花色素昔 , 葡萄糖无效。这
些结果对蔗糖促进花色素昔 累积的作用一
致 , 但未证明蔗糖是否通过刺激 P A L活性而
增加产物累积 。 我们的结果是否定的。 不同
糖源可能通过影响初生代谢途径使花色素昔
累积不同 。
一般认为低温刺激 P盛L 活性 , 导致花色
素昔累积 。 伪 e朗 y , T址ma n n阴 报道 , 低温有利于苹果中花色素昔累积 。 K oz u上u e 以们 报
道 6℃下贮存的辣椒的 户人毛活性为 21 0 下
的 3 倍。 我们的实验结果表明 , 用间隔低温
(10 幼 处理愈伤组织 , P A L 活性略高于 恒
温 , 但色素量与生长率较低 , 可能由于低温的
作用使愈伤组织处于不利的条件下 , 整个代
谢水平较低 , 色素合成 、 细胞增殖均受到抑
制 。
参 考 文 献
表 2 拾、 温度对 PA L 活性、 花色素普含量、
愈伤组织生长的影响
处理 P A L 活性 色素单位 生长率 (% )
果 糖
葡萄塘
1 5 2
.
5
幻 9 . 9
14 6
.
6
1 9 1
.
3
2 0 2
.
0
7
.
2
1 1
.
6
1 4
,
3
拐 . 么
1 2
。
6
53
.
6
5 1
,
8
5 2
。
7
连2 . 2
1 9
.
2
1 M is aw a 从 时 公 . 栋兆华等译 ) 生物科学动态 1拍.
(1 ) : 加 .
日 W e】」功 an E 时 成 . 卫无叭“ 为e仍 1 9 7 6 , 场 ( 6 ) : 9 1 3 ·
3 日r帐扣 r 习」〕 et 以 . 尸耐卯2~ 19
7习, 74 (肛 3 ) : 加7 .
4 H e in Z功 a n n U , 日泊ltz U . 尸 2侧材“ 1 9性 , 1 1 7 ( 1 ) : 7 5 .
s st 且止 V D 时 a l · P名助她 ,彻 d 1 9 7 6 , 劝 ( 2 )亡 1 04 .
6 伽 e址 Y, K om 山旧 i n e A· P乙口耐 eC ZI尸为岁初 1 1 98 5, 幼
(匀 : 0 .3
7 C o n 时a加 I P ` t a 乙. P沁” 勿 1 9 71 , 帕: 80 6 .
8 8哈an o N , H ay as 址 K . 刀“ 皿匆 (全响 , ) 1 9 85 , . :1
3 7 1
.
9 王敬文 、 薛应龙 , 植物生理学报 1朗1 , , : 8 7 8·
却 上海植物生理学会编 , 植物生理学实验手册 , 上海科学
技术出版社 1 9 85 , 1牡 页 .
U L aw asn
o n A O 时 ` · Z 几向朋雌绅脚以 1 9 7 , , e6 , 2 51 .
12 L
a r k in PJ
, 巳” w e or ft w .R T知叱甲 J 到醉口绷时 1 98 1,
已. : 1 9 7 .
1 3 A l伪仙~ W, eR i n b a dr E . 刀邢礴食形沁 1盯 i , 灯 ,
85 .8
14 lB ak
e
ly LM, st
e w a r d 玉℃ . 过饥分 J oB公 19 6 1, 姐:
3 5 1
.
1 5 所r au 日 J . 尸 Z瀚 t 尸为那初 1 1 9 5 9 , 肠 ( 3 ) : 58 6 .
1 6 M
a娜 nZ ot o T 时 ` · 刁少 B幻 2 0姗 1 , 7 3 , 盯 (3 ) :
5 6 1
.
1 7 T h i m加 n K V 时 心 · 刁少`无刀 “` 无彻 及印加 1 9 5 1 , 林
3 05
.
1 8
1 9
T h i m a n
K O Z u k u
K V et 酩 . 刁犷` h B名OC he 仍 工94 9 , 胜 : 8 .
e N , gO at
a K
.
J 尸 d 名` 1 9 7 2, 盯: 7 0 5 .
塘温蔗恒变
L