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窄叶蓝盆花花序化学成分及其抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究



全 文 :2014年 7月 内蒙古大学学报(自然科学版) Jul. 2014
第45卷第4期 Journal of Inner Mongolia University(Natural Science Edition) Vol.45 No.4
  文章编号:1000-1638(2014)04-0398-06    DOI:10.13484/j.nmgdxxbzk.20140411
窄叶蓝盆花花序化学成分及其抗氧化和
抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究

冀 敏,李淑娟,马超美
(内蒙古大学生命科学学院,呼和浩特010021)
摘要:研究蓝盆花Scabiosa comosa Fisch花序的化学成分,及其抗氧化活性和抑制α-葡萄糖
苷酶活性.反复采用硅胶柱色谱,RP-C18柱色谱,Sephadex LH-20,MCI,制备型高效液相色谱
等方法分离纯化窄叶蓝盆花花序的化学成分,利用多种波谱技术(UV,NMR,LC-MS)鉴定化
合物结构.进一步对这些化合物的DPPH游离基清除率和α-葡萄糖苷酶活性抑制率进行了测
定.本实验从蓝盆花花序中分离鉴定出10个化合物,7个酚类化合物,2个萜类化合物和1个
甾醇化合物.其中芹菜素-4′-O-β-葡萄糖苷(2),芹菜素-7-O-α-阿拉伯糖(1-6)-β-葡萄糖苷(6)
和3β,23-二羟基乌索-12-烯-28-酸(9)为首次从本属植物中分离得到.体外活性实验结果显
示,木犀草素(3),木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷(4)和绿原酸(7)具有显著的清除DPPH游离基活
性,EC50值分别为19、43和26μg·mL
-1;另外,黄酮苷元芹菜素(1)和萜类化合物熊果酸(8)及
3β,23-二羟基乌索-12-烯-28-酸(9)具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性.
关键词:窄叶蓝盆花;酚类化合物;萜类化合物;抗氧化活性;α-葡萄糖苷酶抑制活性
中图分类号:Q946  文献标志码:A
  窄叶蓝盆花Scabiosa comosa Fisch又名山萝卜花,是川续断科Dipsacaceae蓝盆花属Scabiosa
植物,主要分布在中国北方和东北地区[1].蓝盆花的花序可单独入药也可作为蒙药“古日古木-7”等复
方药的成分药材来治疗肝脏疾病[2].据报道本属植物的化学成分包括黄酮类(芹菜素,木犀草素-7-O-
β-葡萄糖苷,大波斯菊苷和野漆树苷),三萜类(熊果酸)和香豆素类(合欢醚和香柑内酯)
[3].但是,目
前对蓝盆花化学成分的研究相对较少.本实验通过对蓝盆花花序的甲醇提取物进行研究,分离纯化出
10种化合物(图1),分别鉴定为芹菜素(1),芹菜素-4′-O-β-葡萄糖苷(2),木犀草素(3),木犀草素-7-
O-β-葡萄糖苷(4),木犀草素-4′-O-β-葡萄糖苷(5),芹菜素-7-O-α-阿拉伯糖(1-6)-β-葡萄糖苷(6),绿
原酸(7),熊果酸(8),3β,23-二羟基乌索-12-烯-28-酸(9)和β-谷甾醇(10).化合物2,6和9为首次从
本属植物中分离得到,此外,本实验对分离鉴定的化合物进行了清除DPPH 游离基活性实验和抑制
α-葡萄糖苷酶活性实验.
1 仪器和试剂
核磁共振光谱用Bruker AvanceⅢ500spectrometer测定,以TMS为内标;超高效液相-质谱
(UPLC-DAD-ESI-MS)分析用Agilent 1290infinity UPLC系统,连接有阵列四极管检测器(DAD)和
* 收稿日期:2013-06-04;修回日期:2013-11-04
基金项目:国家自然科学基金(No.81160511)
作者简介:冀敏(1988-),河北省石家庄市人,2011级硕士研究生.E-mail:jimoyanhua0710@163.com.
通信作者:马超美(1962-),陕西省三原县人,教授,博士.主要从事天然药物与功能食品研究.E-mail:cmma@
imu.edu.cn.
6430串联四极杆质谱检测器(产地:Agilent Technologies Sin-78,Singapore(International)Pte.Ltd.,
新加坡);制备型高效液相分离用CXTH LC3000制备型高效液相色谱仪(北京创新通恒科技有限公
司),半制备柱(21.5×300mm);活性测定使用DNM-9602型酶标仪(北京普朗新技术有限公司).柱
层析用硅胶为青岛海洋化工厂产品(100~200目),反相硅胶RP-C18为日本 Wako Pure Chemical In-
dustries股份有限公司产品(38~63μm),DIAION HP-20大孔树脂为日本三菱化学公司产品,Sepha-
dex LH-20为瑞典GE Healthcare Bio-Sciences公司产品,聚酰胺为上海摩速科学器材有限公司产品
(100~200目),薄层色谱硅胶板为乳山市太阳干燥剂有限公司产品.活性测定所用试剂和酶购自西
格玛(Sigma)公司.
蓝盆花花序于2011年9月购自内蒙古通辽市库伦旗库伦蒙古制药公司,由本文作者鉴定并与药
材供应单位核对鉴定为Scabiosa comosa的花序,样品存放于内蒙古大学生命科学学院天然药物与功
能食品研究室(蓝盆花1).
图1 从蓝盆花花序中分离鉴定的10种化合物结构式
Fig.1 Structures of the 10compounds isolated from the inflorescence of Scabiosa comosa
2 实验部分
2.1 提取分离
蓝盆花干燥花序2kg,甲醇回流提取3次,时间分别为2h,1h和0.5h.合并提取液,得到浸膏
480.69g.将浸膏加适量水稀释,依次用氯仿和正丁醇萃取.氯仿提取物(93.10g)经硅胶柱色谱分离,
石油醚-乙酸乙酯(1:0~0:1)和乙酸乙酯-乙醇-水(22∶2∶1~6∶4∶1)梯度洗脱得到7个组分(Fr.1
~7).Fr.3(石油醚-乙酸乙酯6∶4~0∶1抽提部分)经RP-C18和硅胶色谱柱分离,洗脱得到化合物
10(150mg)和8(65mg).Fr.4(100%石油醚洗脱部分)经RP-C18、硅胶色谱柱、Sephadex LH-20凝胶
色谱柱和制备型高效液相色谱分离,得到化合物3(20mg),1(18mg)和9(15mg).
正丁醇提取物(126.23g)经硅胶柱分离,石油醚-乙酸乙酯(1∶0~0∶1)和乙酸乙酯-乙醇-水
(22∶2∶1~8∶2∶1)洗脱,得到65个组分(Fr.1b-65b).Fr.20b-24b(乙酸乙酯-乙醇-水20∶2∶1~
993第4期 冀 敏 等 窄叶蓝盆花花序化学成分及其抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究
18∶2∶1抽提部分)经硅胶柱色谱分离,聚酰胺凝胶色谱纯化,甲醇-氯仿(1∶9~3∶17)洗脱得到
化合物5(30mg),2(22mg)和4(10mg).Fr.22b-24b(乙酸乙酯-乙醇-水18∶2∶1抽提部分)经LC-
MS分析与标准品对照,鉴定其主要含化合物7.Fr.40b-44b(乙酸乙酯-乙醇-水10∶2∶1抽提部
分)组分析出晶体,得到化合物6(80mg).
2.2 生物活性测定
2.2.1 清除DPPH游离基活性实验
清除DPPH游离基活性采用文献报道的方法[9]使用96孔板测定.用乙醇配制0.1mmol·L-1的
DPPH溶液,再将样品溶于DMSO中,每孔加入10μL样品和190μL DPPH乙醇溶液,于室温下避光
静置20min,用酶标仪在520nm下测定吸光值A.DPPH清除率公式如下:
DPPH清除率(%)=[Acontrol-(Asample-Acolor)]/Acontrol×100
Acontrol:DMSO代替样品与DPPH溶液反应后的吸光值.
Acolor:样品与未加DPPH的乙醇溶液混合后的吸光值.
EC50值:清除50%DPPH游离基的浓度.
2.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
α-葡萄糖苷酶抑制活性采用文献报道的方法[10]在96孔板上测定.每孔加入80μL底物溶液和
10μL样品溶液(DMSO为溶剂),底物溶液为2mmol·L
-1对硝基苯酚-α-葡萄糖苷的磷酸钾缓冲液
(100mmol·L-1,pH7.0),加入10μL酶溶液后反应开始(所用酶为0.40U·mL
-1的Bacillus
Stearothermophilus,Sigma,Lot#090M1360V).以DMSO代替样品的孔为对照孔,酶反应在37°C
培养20min,培养前后均用酶标仪在405nm测定吸收值,以增加的吸收值(ΔA)用下面的公式计算抑
制率:
%抑制率=(ΔA对照ΔA样品)/ΔA对照
每个样品测4个浓度,每个浓度下至少测试三次,结果用平均值±SD表示.IC50从%抑制率-浓
度曲线上求得.
3 结构鉴定
化合物2黄色粉末,ESI-MS m/z431[M-H]-.1 H NMR(500MHz,CD3OD)δ:7.94(1H,d,J=
8.5Hz,2′,6′-H),7.25(1H,d,J=9Hz,3′,5′-H),6.64(1H,s,3-H),6.46(1H,d,J=2.5Hz,8-H),
6.21(1H,d,J=2Hz,6-H).13 C NMR(125MHz,CD3OD)δ:183.9(C-4),166.2(C-2),165.5(C-7),
163.3(C-9),162.1(C-4′),159.4(C-5),129.2(C-2′,C-6′),126.2(C-1′),118.1(C-3′,5′),105.4(C-
10),104.9(C-3),101.7(C-1),100.2(C-8),95.1(C-6),78.3(C-3″),77.9(C-5″),74.8(C-2″),71.3
(C-4″),62.5(C-6″).以上光谱数据与文献[7]报道基本一致,确定化合物2为芹菜素-4′-O-β-葡萄糖苷.
化合物5黄色粉末,ESI-MS m/z447[M-H]-.1 H NMR(500MHz,CD3OD)δ:7.52(1H,dd,J=
6.5,2.0Hz,6′-H),7.52(1H,d,J=2.0Hz,2′-H),7.32(1H,d,J=8.5Hz,5′-H),6.60(1H,s,3-H),
6.44(1H,d,J=2.5Hz,8-H),6.20(1H,d,J=2.5Hz,6-H).13 C NMR(125MHz,CD3OD)δ:183.3
(C-4),166.5(C-2),165.5(C-7),163.3(C-5),159.5(C-9),150.1(C-4′),148.7(C-3′),127.3(C-1′),
119.8(C-6′),118.0(C-5′),114.9(C-2′),105.4(C-10),105.1(C-3),103.3(C-1″),100.4(C-6),95.8
(C-8),78.5(C-3″),77.5(C-5″),74.8(C-2″),71.3(C-4″),62.4(C-6″).以上光谱数据与文献[5-6]报道
基本一致,确定化合物5为木犀草素-4′-O-β-葡萄糖苷.
化合物6黄色粉末,ESI-MS m/z 563[M-H]ˉ.1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ:12.99(1H,s,5-
OH),10.34(1H,s,7-OH),8.01(1H,d,J=8.5Hz,2′,6′-H),6.96(1H,d,J=9Hz,3′,5′-H),6.88
(1H,s,3-H),6.84(1H,d,J=2.5Hz,8-H),6.46(1H,d,J=2Hz,6-H).13CNMR(125MHz,DMSO-
d6)δ:182.0(C-4),164.4(C-2),162.9(C-7),161.3(C-9),161.0(C-4′),157.0(C-5),128.7(C-2′,C-
004 内蒙古大学学报(自然科学版) 2014年
6′),121.0(C-1′),116.0(C-3′,5′),103.1(C-10),103.0(C-3,C-1),99.9(C-1″),76.2(C3″,C-5″),
99.7(C-8),94.8(C-6),73.1(C-2″),72.4(C-2),70.5(C-3),69.7(C-4″),67.6(C-6″),67.0(C-4),
64.4(C-5).以上光谱数据与文献[8]报道基本一致,确定化合物6为芹菜素-7-O-α-阿拉伯糖(1-6)-β-
葡萄糖苷.
化合物9白色粉末,ESI-MS m/z 471[M-H]-.1 H NMR(500MHz,CD3OD) δ:3.53(1H,d,J
=11Hz,H-23α),3.31(1H,m,H-3),3.30(1H,d,J=11Hz,H-23β),1.14,1.12,1.00,0.98(each
3H,s,4×CH3),1.00(3H,d,J=7.0Hz,H-30),0.88(3H,d,J=6.5Hz,H-29).13 C NMR(125MHz,
CD3OD)δ:181.6(C-28),139.7(C-13),126.9(C-12),73.9(C-3),67.3(C-23),54.4(C-18,C-5),48.9
(C-17),48.5(C-9),40.7(C-14),40.5(C-4),40.4(C-8),39.6(C-19,C-20),38.1(C-1),37.9(C-10),
37.8(C-22),33.8(C-7),31.7(C-21),29.2(C-15),27.4(C-2),24.1(C-16),24.1(C-27),23.9(C-11),
21.6(C-30),19.1(C-6),17.8(C-29),17.6(C-26),16.4(C-25),16.3(C-24).以上光谱数据与文献[4]
报道基本一致,确定化合物9为3β,23-二羟基乌索-12-烯-28-酸.
其他化合物的鉴定通过与标准样品比较其在UPLC-DAD-ESI-MS分析的保留时间、紫外光谱和
质谱数据确定.
色谱条件 超高相色谱(UPLC)柱:Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(50mm×2.1mm i.d.;粒
径:1.8μm);UPLC流速:0.4mL·min
-1;高效液相色谱(HPLC)流动相:A:0.1% HCOOH,B:
MeOH;流速:0min 10%B,3min 100%B,4.5min 100%B,4.51min 10%B,6.0min 10%B.
质谱条件 扫描范围m/z:100~1500;负离子模式检测.
芹菜素(1):保留时间:2.609min;ESI-MS m/z[M-H]-:269.0;UV 267,343nm.
木犀草素(3):保留时间:2.445min;ESI-MS m/z[M-H]-:285.0;UV 255,350nm.
木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷(4):保留时间:1.976min;ESI-MS m/z[M-H]
-:447.0;UV 256,267
(sh),350nm.
绿原酸(7):保留时间:1.390min;ESI-MS m/z[M-H]-:353.0;UV 243,300(sh),327nm.
熊果酸(8):保留时间:3.648min;ESI-MS m/z[M-H]-:455.3.
β-谷甾醇(10):通过TLC与标准品比对,鉴定为β-谷甾醇.
4 化合物的生物活性
4.1 化合物1-10清除DPPH游离基活性的作用
清除DPPH游离基结果见表1.实验结果表明木犀草素(3),木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷(4)和绿原
酸(7)具有清除DPPH游离基的活性,并且木犀草素效果最明显.其他化合物在最高浓度(50μg·
mL-1)下测试清除DPPH游离基能力不到50%.
4.2 化合物1-10对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用
如表1所示,熊果酸(8),3β,23-二羟基乌索-12-烯-28-酸(9)和芹菜素(1)表现出抑制α-葡萄糖苷
酶的活性,其中熊果酸的抑制活性最强.其他化合物在最高浓度(100μg·mL
-1)下对α-葡萄糖苷酶
的抑制率小于50%.
5 讨论
经过各种柱层析,本实验从蓝盆花花序中分离鉴定出10种化合物,其中芹菜素-4′-O-β-葡萄糖苷
(2)、芹菜素-7-O-α-阿拉伯糖(1-6)-β-葡萄糖苷(6)和3β,23-二羟基乌索-12-烯-28-酸(9)为首次从山
萝卜属植物中提取得到的.体外活性实验结果显示:酚类化合物均对DPPH 游离基有清除活性并且
木犀草素(3)的抗氧化活性最大.三萜类化合物显示抑制α-葡萄糖苷酶的活性,且熊果酸(8)的抑制
活性最强.
104第4期 冀 敏 等 窄叶蓝盆花花序化学成分及其抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究
表1 蓝盆花花序中的化合物对DPPH游离基清除活性和对α-葡萄糖苷酶的抑制活性
Table 1 DPPH radical scavenging andα-glucosidase inhibitory activities of
compounds isolated from the inflorescence of Scabiosa comosa
对DPPH游离基
aEC50(μg·mL
-1)
对α-葡糖糖苷酶
bIC50 (μg·mL
-1)
木犀草素 19 >100
木犀草素-7-O-β-葡糖糖苷 43 >100
绿原酸 26 >100
熊果酸 >50  14
3β,23-二羟基乌索-12-烯-28-酸 >50  89
芹菜素 >50  65
  aEC50:清除50% DPPH游离基的浓度.
bIC50:抑制50%α-葡萄糖苷酶活性的浓度(阳性对照药阿卡波糖在同样条件下的IC50值为0.1μg·mL
-1).
据报道,抗氧化物质含量高的食品可能有助于减轻肝脏炎症和全身炎症,这两种炎症均为引起慢
性疾病的关键因素[11].α-葡萄糖苷酶在丙型肝炎病毒包膜糖蛋白的加工和折叠中起着重要作用,可
作为研制抗丙肝药物的靶点之一[12-13].蓝盆花花序是传统蒙药材,常用于治疗肝脏疾病.本研究发现
蓝盆花花序中含有抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶活性的化学成分,这些活性成分有可能是蓝盆花
治疗肝脏疾病的有效成分.蓝盆花常和其他药材组成蒙药复方用于临床,这些成分在复方中的作用和
其药代动力学性质等正在深入研究中.
[致谢] 感谢国家自然科学基金(81160511),同时感谢孟和老师为本实验测定NMR数据.
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204 内蒙古大学学报(自然科学版) 2014年
(责任编委 王迎春)
Chemical Constituents of the Inflorescence of
Scabiosa comosa Fisoh and Their Antioxide
andα-Glucosidase Inhibitory Activities
JI Min,LI Shu-Juan,MA Chao-Mei
(School of Life Sciences,Inner Mongolia University,Hohhot 010021,China)
  Abstract:The inflorescence of Scabiosa comosa Fisohis a traditional Mongolian medicine used
for liver diseases.The present research was carried out to investigate the bioactive constituents of
this traditional medicine.Ten compounds,including 7phenolics,2triterpenes and 1sterol were iso-
lated and identified.Their structures were determined by interpretation of UV,MS and NMR spec-
tral data and by comparison with standard compounds.Apigenin-4′-O-β-glucoside,apigenin-7-O-α-
arabino(1-6)-β-glucoside and 3β,23-dihydroxyursan-12-en-28-oic acid were isolated and identified
fromScabios genus for the first time.The radical scavenging activity on 2,2-diphenyl-1-picrylhydra-
zyl(DPPH)and inhibitory activity onα-glucosidase were measured.The phenolic compounds,luteo-
lin,luteolin-7-0β-glycoside and chlorogenic acid showed potent radical scavenging activity,with
their EC50values being 19,43and 26μg·mL
-1,respectively.A flavonoid aglycone,apigenin,and
both of the triterpene compounds,ursolic acid and 3β,23-dihydroxyursan-12-en-28-oic acid showed
inhibitory activity onα-glucosidase.It was reported that plants with high antioxide capacity may de-
crease hepatic and systemic inflammation.α-Glucosidase is essential for the processing and folding of
the envelope glycoprotein in HCV,and thus are regarded as a promising target for developing anti-
HCV agents.The present findings that some of the phenolic compounds and triterpenes from the in-
florescence of Scabiosa showed antioxidant andα-glucosidase inhibitory activity to suggest that
these chemical constituents may be the bioactive compounds of this herbal medicine for liver disea-
ses.
  Key words:scabiosa comosa;phenolic compound;triterpenes;antioxide activity;α-glucosidase in-
hibitiory activity
304第4期 冀 敏 等 窄叶蓝盆花花序化学成分及其抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究