全 文 ：20 卷 4 期
2004 年 7月
生　物　工　程　学　报
ChineseJournal of Biotechnology
Vol.20 　No.4
July　2004
　
收稿日期:2003-12-10 , 修回日期:2004-03-17。
基金项目:国家自然科学基金项目(No.30370857)和国家 863高技术项目(No.2001AA241032)资助。
＊通讯作者。 Tel:86-531-8364525;E-mail:Xiagm@sdu.edu.cn
混合小麦亲本与新麦草不对称体细胞杂交体系的建立
李翠玲　夏光敏＊
(山东大学生命科学学院 ,济南 250100)
摘　要　以小麦品种济南 177悬浮细胞系来源的原生质体与同品系胚性愈伤组织制备的原生质体混合后作为受
体;以经过 380μW cm2 紫外线照射 1min、2min 的新麦草原生质体分别作为供体 , 用 PEG 法诱导融合。组合Ⅰ(176+
cha9+新麦草 UV 1min)获得 16个再生克隆。经过形态学 、同工酶 、染色体和 RAPD分析 ,确定其全部为属间体细胞
杂种 。其中的 5 个克隆再生杂种植株。用 7 对小麦 SSR引物对杂种克隆的叶绿体基因组进行了分析;组合Ⅱ(176
+cha9+新麦草 UV 2min)只获得 3个克隆 , 且逐渐褐化死亡。表明以小麦济南 177 的两种培养细胞混合作受体的
融合体系有利于杂种的获得及再生;紫外线对融合产物的生长发育有明显的剂量效应。
关键词　小麦 ,新麦草 , 不对称体细胞杂交 ,再生体系 , RAPD
中图分类号　Q943.1　　文献标识码　A　　文章编号 1000-3061(2004)04-0610-05
　　植物体细胞杂交技术能有效地克服有性杂交的不亲和
性 ,同时实现细胞核基因和胞质基因的转移 , 创造远缘体细
胞杂种。不对称体细胞杂交可以转移供体细胞中的少数染
色体 、染色体片段以及胞质基因组 , 获得转移部分供体核基
因组的不对称杂种 ,或者仅有胞质基因组重组的胞质杂种 ,
因此 , 体细胞杂交技术在作物遗传改良中占有特殊的地
位[ 1 , 2] 。小麦是世界上最重要的粮食作物之一 ,对其产量 、品
质及抗性进行改良具有非常重要的意义。在小麦的一些野
生近缘种中 ,存在许多对小麦品性改良有用的基因 , 利用体
细胞杂交技术 ,可将这些基因转移到小麦中 , 是丰富小麦种
质资源的一条重要途径。
新麦草(P .juncea(Fisch.)Nevski 2n =14)属禾本科
(Poaceae)小麦族(Triticeae)新麦草属(Psathyrostachys Nevski),
为山地草原及山地半荒漠常见牧草 , 具有耐寒 、耐旱 、耐盐
碱 、耐贫瘠 、抗病害等优良性状 , 尤其对小麦主要病害 , 如黄
矮病(Comeau and Plourde 1987)、白粉病 、赤霉病 、叶锈及条锈
病有很好的抗性。是改良禾谷类的重要种质资源[3 ,4 ,5] 。因
此研究新麦草的基因组和基因向小麦转移的方法具有重要
意义。小麦与新麦草的远缘杂交十分困难 ,至今仅有很少数
成功的报道[ 6] 。但目前还未见在育种中利用的报道。 本实
验室曾在 1996年简要报道过小麦与新麦草的体细胞杂交 ,
但杂种再生频率低 , 未能结实[ 7] 。 因此 , 有必要探索新的融
合体系 ,为利用体细胞杂交技术将新麦草中的目标性状转移
到小麦奠定基础。
小麦(Triticum aestivum L.)品种济南 177 幼胚来源的愈
伤组织经过长期的继代培养后 , 形成了两种类型的细胞系。
其中胚性愈伤组织 176 结构紧密 , 具有分化能力 , 但分裂能
力较弱;而非胚性愈伤组织 cha9 结构松散 ,其形成的悬浮细
胞系分裂旺盛 ,但由于继代时间较 176 长 , 已经丧失植株再
生能力。本文报道用济南 177 的两种培养细胞 cha9 和 176
混合作为受体 ,与 UV 照射的新麦草培养细胞进行融合 , 通
过基因组互补 ,获得小麦与新麦草的属间不对称体细胞杂种
植株。
1　材料与方法
1.1　双亲原生质体的游离
以小麦品种济南 177 的悬浮细胞系 cha9 及胚性愈伤组
织 176为材料 ,在含 2 , 4-D为 2 mg L 的液体和固体 MB 培养
基上继代培养 , 取继代 3d的悬浮细胞系和继代 7d 的胚性愈
伤组织游离原生质体。方法参照文献[ 8 , 9] 。
新麦草原生质体来源于其分裂旺盛的悬浮细胞系。其
继代培养基同小麦。由于长期继代 , 在进行融合实验时 , 分
化能力已经丧失。取继代 3d 的悬浮细胞系 , 按材料:酶液=
1∶2 的比例混合 , 于 25℃缓慢振荡游离 8 h。 酶液成分:1%
纤维素酶 RS , 1%半纤维素酶 , 0.5%的果胶酶 Y-23 , 5 mmol L
MES , 0.6 mol L甘露醇 , 5 mmol L CaCl2 , pH 5.8。原生质体收
集方法同小麦 , 用洗液(0.6 mol L 甘露醇 , 5 mmol L CaCl2 ,
pH 5.8)将密度调至 1×106 mL。取直径为 3.5 cm 的培养皿
放入约 0.2 mL 悬浮液 , 在皿底成一薄层 , 用强度为 380
μW cm2的紫外线照射 1min、2min后作为融合供体。
1.2　原生质体的融合和培养
将两种小麦的原生质体按 1∶1 的比例混合后与等体积
的新麦草原生质体混合均匀 , 用 PEG法诱导融合 ,设计的融
合组合如下:
DOI :10.13345/j.c jb.2004.04.030
Ⅰ　176+cha9+新麦草 1min;Ⅱ 　176+cha9+新麦草
2min;Ⅲ　176+新麦草;Ⅳ　cha9+新麦草;Ⅴ　176+cha9
以单独培养的双亲原生质体及混合双亲原生质体作为
对照 , 用 P5 培养基 25℃下暗培养。培养再生的愈伤组织长
至1.5 ～ 2.0 mm 大小时 , 分别挑出转至增殖培养基上增殖 ,
增殖 1～ 2个月后 , 转至分化培养基上[9] ,诱导植株再生。
1.3　再生愈伤组织 、克隆的鉴定
1.3.1　同工酶分析:取再生愈伤组织及亲本 ,加入 2 倍体积
的1mol L Tris·HCl(pH 8.3)充分研磨 , 4℃沉降 2 h , 12 000
r min离心 10 min ,取上清 , 用聚丙烯酰胺凝胶电泳作过氧化
物同工酶分析 , 电泳及染色方法同文献 [ 10] (胡能书等
1985)。
1.3.2　染色体分析:挑取生长旺盛的亲本及再生愈伤组织
进行低温预处理 ,用压片法制片[ 4] 。
1.3.3　RAPD分析:CTAB法提取再生愈伤组织及亲本的基
因组总 DNA[11 , 12] 。选用 8 个随机 RAPD 引物 OPA-01 , OPA-
17 , OPA-19 , OPF-05 , OPF-12 , OPH-04 , OPH-20 和 OPG-19
(Operon 10-mer primer , Operon Technology , USA)。PCR扩增反
应条件参考夏光敏等的报道[ 4] 。 扩增产物用 TAE 缓冲的
1.5%琼脂糖凝胶电泳 ,溴化乙锭染色 ,凝胶成像仪照相。
表 1　所用 SSR引物的序列
Table 1　The sequence of the SSR primers
Locus Location(gene) Repeat Primer sequence(5′-3′)
WCt6 Intergenic region (C)10 TCACAGGCTGCAAAATTCAG
(trnC-rpoB) GGATAATAATGCTGTCGGACC
WCt7 coding region (A)12 ATCGTTCCCCACAAGACAAG
(ropC2) AGGGTTAAATGTTAAATGGGGG
WCt9 Intergenic region (T)12 CGCAGCCTATATAGGTGAATCC
(atpI-atpH) TTGCAACCAAGCAGATTATCC
WCt11 Intron (A)14 TTTTATCTAGGCGGAAGAGTCC
(atpF) TCATTTGGCTCTCACGCTC
WCt13 Intergenic region (A)15 TGAAAATCTCGTGTCACCA
(trnF-ndhJ) TGTATCACAATCCATCTCGAGG
WCt20 Coding region (T)10 TTCCATTGGGTAGGGCTTC
(infA) GTAATCGCCCCCGCCTATAGT
WCt23 Intergenic region (T)10 TCCAGAAAGAAAAACCGGG
(rpl14-rpl16) TAGCTGCCAGTAAAAATGCC
1.3.4　SSR分析:CTAB 法提取再生愈伤组织及亲本的基因
组总 DNA , 小麦叶绿体特异的 SSR引物(表 1)及 PCR扩增和
电泳条件参考文献[ 13] (Ishii et al , 2001), 电泳完毕后 , 凝胶
置于1L脱色液(10%冰醋酸)中摇床振荡脱色 40 min;水洗 3
次 ,时间分别是 5 min、5 min 、10 min;摇床振荡银染 30 min ,
(银染液:1g AgNO3+1.5 mL甲醛+1L水);水洗 5 min;置于
预冷的显影液(30g NaCO3+1.5 mL 37%甲醛和 200μL 10 mg mL
Na2S2O3+1L H2O)中振荡显影至条带清晰;1L固定 停显液
(10%冰醋酸)中摇床振荡停显 3 ～ 5 min;水洗 2 次 , 每次
2 min;室温干燥 ,观察 , 拍照[ 14] 。
2　结果
2.1　融合产物的培养与植株再生
融合产物在培养 7～ 8 d 时发生第一次分裂 , 约 40 d 后
形成小愈伤组织。其中组合Ⅰ 再生 16 个克隆 , 再生克隆长
至 2～ 3 cm 时转至含 1mg L 2 , 4-D的MB 培养基上增殖 ,继代
1～ 2次后转至分化培养基上分化。其中 5 个克隆再生出绿
色植株 ,再生频率为 32%。这些克隆扩繁迅速 , 植株形态偏
向小麦(图 1)。
组合Ⅱ在培养约 60 d后再生了 3 个克隆 ,再生愈伤组织
转到增殖培养基上继代几次后 , 褐化现象严重 ,生长缓慢 ,不
能分化成植株。在培养 3 个月后由于褐化严重而死亡。组
合Ⅲ和Ⅳ在分裂 1 次后停止生长 ,不能再生愈伤组织。组合
Ⅴ的细胞有一定程度的增殖 , 只形成部分的小细胞团 , 未能
形成愈伤组织。
作为对照培养的济南 177 悬浮系 cha9 的原生质体在分
裂几次后停止生长 , 未得到再生的愈伤组织;济南 177 胚性
愈伤组织 176来源的原生质体没有观察到分裂。新麦草悬
浮系来源的原生质体在本实验条件下不分裂。 亲本原生质
体混合培养后 5～ 6 d 观察到有分裂 ,形成较多的细胞团 , 但
均未形成愈伤组织。
2.2　融合再生愈伤组织杂种性质的鉴定
2.2.1　同工酶分析:组合Ⅰ 再生克隆的过氧化物同工酶分
析发现 , 16 个再生克隆中都含有小麦特征谱带及新麦草的
1～ 2条特征谱带。其中 3、5、7 号克隆中还出现了新带(图
2)。表明所获得的再生克隆均为体细胞杂种。
图 1　6号克隆的杂种植株
Fig.1　Hybrid plant from No.6 hybrid clone
图 2　过氧化物酶分析结果
Fig.2　Peoxidase analysis of the parental and regenerated clones
※:characteri stic bands of wheat;>:characteristic bands of P.juncea;
:new bands;176 , cha9(lane 2 , 3):two lines of wheat Jinan 177;pj
(lanel):P.juncea
2.2.2　染色体分析结果:在对照亲本中 , 两种类型的小麦
(2n=42)愈伤组织由于继代时间不同 , 染色体数目有很大的
6114 期 李翠玲等:混合小麦亲本与新麦草不对称体细胞杂交体系的建立
差异。176 的染色体数目是 32 ～ 38 条 , cha9 的染色体数目约
为24～ 28条。新麦草(2n=14)的愈伤组织经过 7 年的继代
和筛选 ,其染色体数目也发生了一定程度上的变异 , 多为 11
～ 14 条(图 3A-C)。杂种克隆中 , 染色体的数目多分布于 35
～ 55 之间(表 2)。有分化能力的杂种克隆的染色体数目大
多数在 40～ 50之间 ,平均染色体数目为 46 条(表 2)。 在所
有再生克隆中都观察到有少量染色体断片的存在(图 3D～
F)。
表 2　部分再生克隆的染色体分析
Table 2　The chromosome numbers of some regenerated clones
Chromosome number Clone 3 Clone 6 Clone 9 Clone12
<35 Number 13 6 4 1
Ratio % 14.4 7 4 3
35-45 Number 53 28 39 18
Ratio % 59 33 39 60
45-55 Number 18 44 49 9
Ratio % 20 52 49 30
>55 Number 6 7 8 2
Ratio % 6.6 8 8 7
Total number analysed 90 85 100 30
2.2.3　RAPD分析:选用 8 对 RAPD引物对 16 个克隆的再
生愈伤组织及亲本总基因组 DNA 进行 PCR扩增。所有克隆
都具有双亲特征带 ,但是带型普遍偏向小麦。部分克隆出现
新带(图 4)。同一小麦济南 177 来源的愈伤组织 176和悬浮
系 cha9 , 由于不同的组织培养变异 ,在部分引物的扩增带型
有差异。在OPH4 的扩增产物中 , 杂种克隆 2 、3、4、5、7、10、
11 、12 分别具有 176和 cha9 的特征带 ,从分子水平上证明了
两种类型的小麦细胞都参与了融合过程(图 4)。
2.2.5　SSR分析:在选用的 7 对引物中 , 亲本之间的扩增谱
带有差异的是Wct6、Wct7 、Wct9、Wct11、Wct20 、Wct23 六对引
物。而在这六对引物中 ,所有再生克隆的扩增带型都与小麦
的带型完全相同 ,没有新麦草的特征带。引物Wct13在亲本
和所有再生克隆中的扩增带型相同 , 没有多态性。Wct6 的
扩增结果如图 5所示。
图 3　再生克隆及亲本染色体分析
Fig.3　Chromosomes of the parental and regenerated clones
←:chromosome fragments;A:callus chromosomes of wheat(176)2n=34;
B:chromosome numbers of wheat suspension(cha9), 2n=27;C:chromo-
somes of P.juncea ,2n=14;D:chromosomes of clone No.6, 2n=48;E:
chromosomes of clone No.9 ,2n=50;F:chromosomes of clone No.12 , 2n
=46
图 4　RAPD引物 OPF12(A)和 OPH4(B)的扩增结果
Fig.4　RAPD analysis of regenerated clones and the parents
Cha9 ,176:the two lines of wheat Jinan177;pj:P.juncea;2, 3 , 4 , 5 , 7 ,
10 , 11 , 12:number of the regenerated clones:M:λDNA Hind Ⅲ+EcoR
Ⅰmolecular marker.A:electrophoresis pattern of RAPD with primer OPF_
12;B:elect rophoresis pattern of RAPD with primer OPH_4;→:character-
isti c bands of wheat:<:characteristic bands of P.juncea; :new bands
图 5　SSR引物 Wct6的扩增结果
Fig.5　SSR analysis result of regenerated clones and the
parents with primer WCt6(Cha9 , 176):the two lines of wheat
3　讨论
由于受基因型及胚性细胞系不能长期保持等因素的限
制 ,小麦的体细胞杂交体系难以建立。在早期的实验中 , 我
们利用小麦济南 177 的胚性悬浮系与新麦草愈伤组织为材
料分离原生质体并进行与本实验相似的紫外融合 , 曾获得杂
种植株[ 7] 。但此悬浮细胞系的胚性未能长期保持。利用新
建立的胚性愈伤组织作材料虽有再生能力 , 其原生质体不能
分裂。而建立新的胚性悬浮系周期长 , 难度大 , 建成后又会
很快丧失胚性。为此 ,建立新的小麦融合体系已成为小麦体
细胞杂交技术的关键问题。
小麦济南 177 经过长期的继代培养 , 形成了两种细胞
系:分化能力高的胚性愈伤组织 176和快速分裂的悬浮细胞
系 cha9。由于体细胞无性系变异 ,它们的染色体都有不同程
度的削减 ,其中 Cha9 的染色体数目仅为 24 ～ 28 (Fig.2b),
176的染色体数目只有 32 ～ 38(Fig.2a)条。可能其中一些
控制再生和分化的染色体或者基因组发生了变异 , 所以单独
用 176或者 Cha9 与新麦草进行融合 , 都只有一定程度的细
胞增殖 ,不能获得再生愈伤组织及植株。本试验将这两种细
612 生　　物　　工　　程　　学　　报 20卷
胞系混合后作为受体 ,与 UV 处理的新麦草融合获得了绿色
再生植株。这可能是由于 cha9 的快速分裂能力与 176 的再
生能力相互补偿后 ,所得到的融合产物才可能具有持续分裂
和再生的能力。所以 cha9 和 176 的遗传物质对于小麦与新
麦草融合后 ,愈伤组织及植株的再生是必要的[ 14] 。在小麦
与簇毛麦的体细胞杂交中 ,我们首次试验了此融合体系 , 但
当时认为其中的一个细胞系 cha9 起到看护作用[ 15] 。本实验
的 RAPD分析发现 , 所选用的 8对引物对 176 和 cha9的扩增
谱带之间都有差异 ,表明组织培养过程造成了两类型培养细
胞基因组的差异。从图 4 中 OPH4 引物的扩增结果可以看
出 ,所分析的再生克隆中分别含有 176、 cha9 、新麦草的特征
带 ,表明在这些克隆中 , 三种细胞系都参与了融合过程 , 杂种
克隆再生是三个细胞系基因组互补的结果。小麦的愈伤组
织诱导和原生质体培养是高度基因型依赖的 ,所以这种互补
细胞系的发现 ,对小麦体细胞杂交新体系的建立具有重要的
意义。除了杂种植株因基因组互补而再生以外 , 在本实验
中 ,所有组合Ⅰ 的再生克隆经检测全部为杂种 ,因此 , 在此融
合体系中 ,体细胞杂种存在着优势生长现象[ 16] , 这对于杂种
愈伤组织的形成和筛选也是十分有利的。
对杂种克隆及双亲的染色体分析表明 , 其染色体数目并
不是简单的亲本之和(67 ～ 80)。大多数细胞的染色体在 36
～ 55这个范围内 , 其中染色体数目在 42 ～ 50 条左右的杂种
克隆易于再生植株(表 2 、3)。这表明在融合后 , 细胞内的染
色体发生了一定程度上的削减 , 从而使细胞内的遗传物质达
到相对平衡的状态。部分杂种克隆具有与再生克隆相似的
染色体数目(表 3), 却未能再生植株。这可能与杂种中的三
亲基因组未能互补有关。在许多杂种细胞中发现有染色体
断片的存在。断片形成的原因及染色体削减的机制还有待
于进一步的研究。
表 3　部分再生克隆的细胞学 、同工酶 、RAPD及分化能力的分析
Table 3　Cytology , isozyme and RAPD and differentiation of some regenerated clones
No.of cell clone Chromosome counting(average)
SCF(small chromosome
fragment)
Peroxidase i sozyme
patternA
RAPD pattern
Differentiation
capacity
3 44.62 1～ 3 P PN -
6 46.67 1～ 2 PN P plant
9 46.66 1～ 3 PN P plant
12 46.1 1～ 2 P PN -
A:P , containing partial specific bands of both parents;N , containing new band(s).-:no differentiation
　　UV 照射原生质体能引起染色体的广泛变异 , 尤其是断
裂频率增加和染色体数目削减 , 有剂量效应[ 18] 。 Forsberg
(1998)用 UV 照射拟南芥后 , 与油菜进行体细胞杂交 , 发现
UV照射能够引起染色体片段化 ,并发现有剂量效应[17] 。在
小麦与簇毛麦 、小麦与燕麦的 UV 融合中 , UV 射线对体细胞
杂种染色体削减及片段化也存在剂量效应[19 , 20] 。表明 UV的
利用对供体染色体削减及转移部分供体遗传物质到受体 、获
得高度不对称的杂种是可行的。王槐等研究了紫外线对小
麦原生质体分裂及染色体变异的影响 ,发现 UV 对原生质体
的分裂及进一步生长有抑制作用 , 并且剂量过高有致死作
用。随着 UV辐射剂量的增加 , 获得的再生克隆的数量减少 ,
而再生克隆的分化能力也相应下降。在小麦与谷子 , 小麦与
獐毛的远缘体细胞杂交组合中也发现有类似现象[ 21 ,22] 。在
本试验中 , UV照射 1min的组合Ⅰ中 , 获得了 16 个杂种克隆 ,
但在UV照射 2min 的组合Ⅱ中只获得了 3 个克隆 , 而且由于
褐化严重 ,在继代几次后死亡。这可能是由于高剂量的 UV
照射在直接引起供体染色体削减和断裂的同时 , 也间接导致
受体染色体的伤害 ,从而使再生克隆致死。因此 , 在 UV诱导
的不对称体细胞杂交中 , 适宜的剂量是获得成功的关键
因素。
体细胞杂种中叶绿体基因易发生不等分离(偏向一方亲
本)或者重组。 Buiteveld et al(1998)报道在 Allium anpelopra-
sum + Allim cepa 的体细胞杂种中 , 受供体核 DNA 的含量与
胞质基因的不均等分离有关[23] 。从SSR分析结果来看 ,我们
所获得的小麦与新麦草的属间体细胞杂种中 ,所有克隆的叶
绿体都完全偏向小麦(Fig.5)。这可能与所有杂种克隆均含
有较多的小麦核及胞质基因组有关。我们在小麦与其它异
属禾草的体细胞杂种中发现有少数位点存在双亲叶绿体
DNA的整合及重排[ 15 , 24] 。与本实验得到的结果不完全一致。
由于所检测的叶绿体基因组位点较少 , 因此对杂种叶绿体基
因组的组成规律有待进一步的研究。
REFERENCES(参考文献)
[ 1 ] 　Li F(李锋).Asymmetric somatic hybridizat ion and crop breeding.
Journal of Huizhou University (Nat.Sci.)(惠州大学学报), 1999 ,
19(4):47-50
[ 2 ] 　Binsfeld PC , Schnabl H.Molecular and cytogenetic constitution of
plants obtained via two different somatic hybridization methods.Plant
Cell Reports , 2002 , 21:58-62
[ 3 ] 　SunZX(孙震晓), Xia GM(夏光敏), ChenHM(陈惠民).Tissue
culture and chromosome analysis of Psathyrostachys juncea(Fisch.)
nevski.Chinese Bulletin of Botany(植物学通报), 1995, 12(4):
53-54
[ 4 ] 　Wang Z , Lehmann D , Bell J et al.Development of an efficient plant
regeneration system for Russian wildrye (Psathyrostachys juncea).
Plant Cell Reports , 2002 , 20:797-801
[ 5 ] 　Wei JZ , Zhu FS , Wang R R-C et al.Cytological andmolecular anal-
ysis of genetic variation in Psathyrostachys juncea.Acta Agronomica
Sinica , 1997 , 23(1):7-19
[ 6 ] 　Chen Q , Zhou RH , Li LH et al.First intergenetic hybrid between
Triticum asetivum and Psathyrostachys juncea.Chinese Science Bulle-
tin , 1988 , 33:2071-2074
[ 7 ] 　Xia GM(夏光敏), Wang H (王槐), Chen HM(陈惠民).Plant
6134 期 李翠玲等:混合小麦亲本与新麦草不对称体细胞杂交体系的建立
regeneration from intergeneric asymmetric hybridization between wheat
(Triticum aestivum L.)and Russian wildrye(Psathyrostachys juncea
(Fisch.)nevski)andwheat grass(Agropyron elongatum (host)Ne-
vishi).Chinese Science Bulletin(科学通报), 1996, 41(16):1382
-1386
[ 8 ] 　Li ZY , Xia GM , Chen HM.Somatic embryogenesis and plant regen-
eration f rom protoplast isolated f rom embryogenic cell suspension of
wheat(Triticum aestivum L.).Plant Cell and Tissue Organ Culture ,
1992 , 98:79-85
[ 9 ] 　Xia GM , Chen HM.Plant regeneration f rom intergeneric somatic hy-
bridization between Triticum aestivum L.and Leymus chinensis
(trin.)Tzvel.Plant Science , 1996 , 120:197-203
[ 10] 　Hu NS (胡能书), Wan GX (万国贤).Application of Isozyme
Technique.Changsha:HunanSciences andTechnology Press , 1985,
pp.96-104(in Chinese)
[ 11] 　Xia GM(夏光敏), Li ZY(李忠宜), Zhou AF(周爱芬)et al.
RAPD method for the identification of intergeneric asymmetric somatic
hybrid plants of wheat.Acta Biologiae Experimentalis Sinica(实验生
物学报), 1999 , 32(3):265-271
[ 12] 　Doyle JJ , Doyle JI.Isolation of plant DNA from fresh ti ssue.Focus ,
1990 , 12:13-15
[ 13] 　Ishii T , Mori N , Ogihara Y.Evaluation of allelic diversity at chloro-
plast microsatellite loci among common wheat and its ancestral spe-
cies.Theor Appl Genet , 2001 , 103:896-904
[ 14] 　Xu CH , Xia GM , Zhi DY et al.Integration of maize nuclear andmi-
tochondrial DNA into the wheat genome through somatic hybridiza-
tion.Plant Science , 2003 , 165:1001-1008
[ 15] 　Zhou AF , Xia GM , ChenXL et al.Production of somatic hybrid pla-
nts between two types of wheat protoplasts and the protoplasts of
Haynaldia villosa.Acta Botanica Sinica , 2002 , 44:1004-1008
[ 16] 　Zhou AF(周爱芬), Xia GM(夏光敏), Chen HM(陈惠民).Plant
regeneration from asymmetric somatic hybidization between common
wheat and Haynaldia villosa.Science in China (series C)(中国科
学), 1996 , 26(1):31-37
[ 17] 　Forsberg J , Dixelius C , Lagercrantz U et al.UV dose-dependent
DNA elimination in asymmetric somatic hybrids between Brassica na-
pus and Arabidopsis thaliana.Plant Science , 1998 , 131:65-76
[ 18] 　Wang H(王槐), Xia GM(夏光敏), ChenHM(陈惠民)et al.Ef-
fect of UV on the protoplast division and chromosome variation of
wheat.Acta Phytobiologica sinica(植物生物学学报), 1994 , 4
(1):69-72
[ 19] 　Xiang FN , Xia GM , Chen HM.Effect of UV dosage on somatic hy-
bridization between common wheat (Triticum aestivum) and Avena
sativa L.Plant Science , 2003, 164:697-707
[ 20] 　Zhou AF , Chen XL , Xia GM et al.Study of UV-fusion between com-
mon wheat and Haynaldia villosa.Journal of Plant Physiology and
Molecular Biology , 2002 , 28(4):305-310
[ 21] 　Yue W , Xia GM , Zhi DY et al.Transfer of salt tolerance from Ae-
leuropus littoralis sinensis to wheat(Triticum aestivum L.)via asym-
metric somatic hybridi zation.Plant Science , 2001, 161:259-263
[ 22] 　Li LL , Xia GM , Chen YL et al.Asymmetric hybridi zation between
wheat and millet.Acta Phytophysiologica Sinica , 2001 , 27(6):455
-460
[ 23] 　Buiteveld J , Kassies W , Geels R et al.Biased chloroplast and mito-
chondrial t ransmission in somatic hybrids of Allium ampeloprasum L.
and Allium cepa L.Plant Science , 1998, 131:219-228
[ 24] 　Zhou AF , Xia GM , Zhang X et al.Analysis of chromosomal and or-
ganellar DNA of somatic hybrids between Triticum aestivum and
Haynaldia vi llosa Schur.Mol Genet Gen , 2001, 265:387-393
Asymmetric Somatic Hybridization Between Mixed Wheat and Psathyrostachys juncea
LI Cui_Ling　XIA Guang_Min＊
(School of Life Sciences , Shandong University , Jinan 250100, China)
Abstract　Psathyrostachys juncea is a potential source of useful genes , such as the barley yellow dwarf virus resistance , salt
tolerance and drought tolerance , for wheat improvement.Conventional sexual hybridization between wheat and Psathyrostachys
juncea is very difficult to occur as the two are sexual incompatible.Somatic hybridization is a promising technique for creating hy-
brids across the sexual border.Here we report a fusion system for somatic hybridization of wheat using PEG method.Mixed pro-
toplasts of two wheat(Triticum aestivum L.cv.Jinan 177)culture cells(cha9 and 176)were used as the recipients to fuse with
the donors , the protoplasts of Psathyrostachys juncea (Fisch.)Nevski irradiated with ultraviolet light (UV)at an intensity of
380μW cm2 for 1 min or 2 min.Sixteen clones were generated in the combination Ⅰ , (wheat 176 +wheat cha9 + P.juncea
1 min UV treatment)and five of the hybrid clones could differentiate to green plants.All the regenerated clones were confirmed
as somatic hybrids by cytological , isozyme , chromosome and random amplified polymorphic DNA (RAPD)analysis.Chloroplast
genome of the hybrids was analyzed using 7 pairs of wheat-specific chloroplast microsatellite(SSR)primers.Three clones were
obtained from the combination Ⅱ(wheat 176 +wheat cha9 + P.juncea 2 min UV treatment), and all browned slowly and
died in 3 months.This result indicated that the mixed wheat cells was helpful to the formation and regeneration of hybrid callus
and the dosage of the UV had significant effect on the development of the fusion products.
Key words　Triticum aestivum L.,Psathyrostachys juncea(Fisch.)Nevski , asymmetric somatic hybridization , regeneration sys-
tem , RAPD
Received:12-10-2003
This work was supported by a grant from the National Natural Foundation of China(No.30370857)and the NationalHigh Technological Program “ 863” (No.
2001AA241032).
＊ Corresponding author.Tel:86-531-8364525;E-mail:Xiagm@sdu.edu.cn
614 生　　物　　工　　程　　学　　报 20卷