全 文 ：滇桂艾纳香水溶性多糖 BRP-B的分离纯化及止血活性
廖敏富a 林翠梧a* 黄 丽a 许子竞a 覃飒飒a 李爱媛b
(a广西大学化学化工学院 南宁 530004;b广西中医学院 南宁)
摘 要 用蒸馏水溶解滇桂艾纳香浸膏，从中提取多糖，通过膜分离、三氯乙酸法脱蛋白、二乙氨基乙基
(DEAE)纤维素脱色、SephadexG10、SephadexG50 凝胶柱色谱纯化，获得滇桂艾纳香水溶性多糖(BRP-B)。由
凝胶渗透色谱(HPGPC)确定 BRP-B 为相对分子质量分布均一的多糖，其数均分子量和质均分子量分别为
2654 和 2716 Da。以血浆复钙时间(PRT)为指标，研究 BRP-B 的凝血活性，结果显示 BRP-B 质量浓度为
6. 25 × 10 －2 g /L时，凝血时间为 248. 52 s，凝血时间抑制率达 22. 42%。小白鼠离体子宫实验结果显示，BRP-B
质量浓度为 1. 67 × 10 －2、1. 97 × 10 －2及 2. 85 × 10 －2 g /L时能明显增加子宫平滑肌的收缩频率。
关键词 滇桂艾纳香，多糖，分离，纯化，止血活性
中图分类号:O629． 1 文献标识码:A 文章编号:1000-0518(2011)01-0083-05
DOI:10． 3724 /SP． J． 1095． 2011． 00124
2010-03-03 收稿，2010-04-21 修回
国家自然科学基金(20662001，20962002)资助项目，2007 年国家大学生创新实验项目(071059314)
通讯联系人:林翠梧，教授;Tel:0771-3275878;E-mail:lincuiwu@ 163． com;研究方向:中草药化学成分和天然产物的研究与开发
滇桂艾纳香为菊科艾纳香属植物(Blumea riparia(BI．)DC．) ，具有养肝活血、收敛止血、活血不伤
血、止血不留瘀等功效，可用于各种出血症;民间常以水煎汤剂服用，用于治疗妇女功能性子宫出血、产
后出血等症有独特的疗效［1］。国内对该植物化学成分及药学的初步研究发现该植物含有原儿茶酸、绿
原酸、豆甾醇、β-谷甾醇、槲皮素［2 － 3］、咖啡酸、小麦黄素、芹菜素、木犀草素等成分［4］。但有关滇桂艾纳
香具体化学成分尤其是多糖的止血作用药理活性研究报道尚未见。考虑到民间常服用的滇桂艾纳香水
煎汤剂其有效成分均是水溶性的，又鉴于小分子量的多糖具有表观黏度低、水溶性好、生物活性多样、易
于透过机体组织屏障直达细胞内部发挥药效及利于结构与功能机制的研究等特点［5 － 7］，本文报道了滇
桂艾纳香中相对分子质量在 103 ～ 104范围内的水溶性多糖成分的分离、纯化、鉴定及其止血活性的初步
研究。
1 实验部分
1． 1 试剂和仪器
滇桂艾纳香水提浓缩浸膏(广西桂西制药厂) ;冷冻血浆，由南宁市中心血站提供健康人血浆，
－ 25 ℃保存;云南白药、缩宫素、乐氏液及小白鼠离体子宫标本等由广西中医学院提供;二乙氨基乙基
(DEAE)纤维素(上海试剂二厂) ，SephadexG10、SephadexG50 凝胶柱(法玛西亚公司) ，透析袋(上海绿
鸟科技公司) ，pH = 7. 1 的 PBS 缓冲液(NaCl:0. 13 mmol /L，KCl:2. 7 mmol /L，Na2HPO4:12 mmol /L，
KH2PO4:1. 5 mmol /L，棕色瓶保存) ;其它试剂均为国产分析纯。多功能陶瓷膜(合肥世杰膜工程有限责
任公司) ，多功能有机膜(合肥世杰膜工程有限责任公司)。GPC仪检测器为 Agilent 1100 型示差折光检
测器，色谱柱为 TSK GEL G3000SW TOSOH 串联 TSK GEL G4000PW TOSOH，预柱:TSK GEL SW
TOSOH AAS;Easy pure LF超纯水仪，BL-420生物信息处理系统，HW-400S型张力传感器。
1． 2 滇桂艾纳香水溶性多糖(BRP-B)的分离纯化
参照文献［8］方法，将 5 kg滇桂艾纳香水提浓缩浸膏，加 15 倍量的蒸馏水溶解过滤，将滤液依次过
截留相对分子质量为 105的陶瓷膜和截留相对分子质量分别为 104和 103的有机复合膜进行初步分离，
第 28 卷 第 1 期 应 用 化 学 Vol． 28 Iss． 1
2011 年 1 月 CHINESE JOURNAL OF APPLIED CHEMISTRY Jan． 2011
将相对分子质量在 103 ～ 104的分离液减压浓缩至 500 mL。在冰浴冷却下，用质量分数为 5%的三氯乙
酸沉淀蛋白质，静置过夜后离心除沉淀。将清液浓缩至 200 mL，再用透析袋(截留分子量为 103 Da)流
水透析 48 h，蒸馏水透析 24 h。将透析袋内溶液减压浓缩后，上 DEAE纤维素柱脱色。收集含糖溶液，浓
缩冷冻干燥得滇桂艾纳香水溶性粗多糖。将粗多糖用水溶解，以超纯水为洗脱液，上 SephadexG10、
SephadexG-50 凝胶柱反复分离纯化，苯酚-硫酸法显色和紫外光谱检测，用自动部分接收器定量接收洗
脱液，合并单峰部分溶液，减压浓缩后冷冻干燥，得 BRP-B产物。
1． 3 BRP-B的光谱鉴别
参照文献［9］方法，将分离出的 BRP-B 多糖配成质量浓度为 2. 0 × 10 －4 g /mL 的水溶液，测定波长
200 ～ 600 nm范围内的紫外可见吸收光谱。用 KBr压片法纯化测定干燥 BRP-B在 4000 ～ 400 cm －1区间
的红外吸收谱，分别确定蛋白质杂质。
1． 4 BRP-B多糖平均分子量测定
参照文献［10］方法，将分离纯化的 BRP-B 配制成浓度为 2 g /L 的水溶液，过滤后进样 20 μL，上
HPGPC柱，柱温 23 ℃，用流速 1. 0 mL /min超纯水洗脱，进行 HPGPC分析，由标准校正曲线计算多糖的
平均相对分子质量。
1． 5 分离多糖 BRP-B对小鼠离体子宫收缩作用的影响
参照文献［11］方法，体重约 25 g的雌性小白鼠随机分为 11 组，每组 6 只，设 9 个不同浓度的 BRP-
B 试剂组、1 个空白对照组及 1 个 0. 01 U /mL的缩宫素阳性对照组。实验前 2 d，按 0. 1 mg /kg体重给小
鼠腹腔注射己烯雌酚，促使其进入动情期。脱颈椎处死后剖腹，取出子宫，置盛有乐氏液的培养皿内，剪
除附在子宫上的结缔组织和脂肪组织。将子宫二角相连处剪开，取一角，剪取一半约 2 cm，一端用标本
钩固定在(37 ± 0. 5)℃恒温水浴槽底部，另一端用线结扎与张力传感器相连。以每秒 1 ～ 2 个气泡通入
空气，待子宫稳定并描记正常收缩曲线后，进行离体子宫实验，观察并描记对子宫收缩频率影响的量效
关系。平行实验 6 次，结果以均值 ±标准差(x ± S)表示。
1． 6 多糖 BRP-B的血浆复钙实验
参照文献［12］方法，取内径为 10 mm试管，分别依次加入 0. 1 mL血浆、0. 1 mL不同浓度的多糖溶
液、0. 1 mL氯化钙溶液，混匀，立即计时。37 ℃保温 40 s后，取出试管缓慢倾斜，观察溶液流动情况，如
停止流动立即记时。平行实验 6 次，结果以均值 ±标准差(x ± S)表示。建立药物浓度与血浆复钙时间
(PRT)的药效关系。空白对照组为 PBS缓冲液;阳性对照组为云南白药(0. 05 g /L)。
2 结果与讨论
2． 1 滇桂艾纳香水溶性多糖的光谱鉴别
图 1 BRP-B的葡聚糖凝胶 G50 柱洗脱曲线(483 nm)
Fig． 1 Elution curve of BRP-B on Sepadex G-50(483 nm)
图 2 多糖 BRP-B经脱蛋白后的紫外图谱
Fig． 2 UV spectrum of BRP-B after eliminating protein
提取的粗多糖经膜分离、脱蛋白、脱色、柱色谱分离纯化及冷冻干燥后得到白色絮状滇桂艾纳香多
48 应 用 化 学 第 28 卷
糖 BRP-B固体。对其柱层析洗脱流分用苯酚-硫酸法显色，测定 483 nm 处的吸光度，绘制洗脱曲线如
图 1所示，为单一对称峰，表明所得 BRP-B 为单纯多糖组分。因分离纯化的 BRP-B 紫外可见吸收光谱
(图 2)无 280 nm处蛋白质的特征吸收，亦无 600 nm 处有色物质的特征吸收，可确定多糖基本不含多
肽、蛋白质和色素等杂质。
纯化干燥后 BRP-B的红外谱中，出现 3360 cm －1处—OH的伸缩振动强吸收峰，2889 ～ 2940 cm －1处
C─H键伸缩振动吸收峰，1400 ～ 1200 cm －1处 C─H键的变角振动吸收峰，1639 cm －1处羰基 C O的伸
缩振动吸收，1031 cm －1处 C—O 键的变角振动吸收峰，933 cm －1处呋喃糖环对称伸缩振动吸收峰，
874 cm －1处呋喃糖分子中次甲基 CH2—的横向振动吸收峰，824 cm
－1处呋喃糖分子中 C—H 键的变角
图 3 BRP-B的高效凝胶渗透色谱(HPGPC)图
Fig． 3 HPGPC of BRP-B
振动吸收峰［10］。据此可判断获得产物是糖类化合
物，且为呋喃多糖。
2． 2 BRP-B的分子量及其分布
图 3 为 BRP-B的 HPGPC 谱图。图中单一对称
峰表明，滇桂艾纳香水溶性多糖 BRP-B 是分子量均
一的多糖，其数均分子量和质均分子量分别为 2654
和 2716。
2． 3 分离多糖 BRP-B对小鼠离体子宫收缩的影响
在 BL-420 型生物机能实验系统上，以子宫收缩
的频率为评价指标，观察不同剂量的 BRP-B 糖溶液
对小白鼠子宫平滑肌收缩频率的影响，结果列于
表 1。表 1 数据表明，在 BRP-B 浓度为 1. 67 ×
10 －2 ～ 2. 85 × 10 －2 g /L 范围内时，能明显提高小白
鼠离体子宫的收缩频率。
表 1 BRP-B对子宫收缩频率的影响(x ± S，n =6)
Table 1 The influence on frequencies of uterine contraction by BRP-B(x ± S，n =6)
Groups ρ(BRP-B)/(g·L －1) Frequency /(times·min －1) Groups ρ(BRP-B)/(g·L －1) Frequency /(times·min －1)
1 0． 35 × 10 －2 2． 08 ± 0． 51 7 2． 56 × 10 －2 3． 60 ± 2． 41
2 0． 69 × 10 －2 2． 33 ± 1． 40 8 2． 85 × 10 －2 3． 78 ± 1． 86*
3 1． 03 × 10 －2 1． 55 ± 0． 52 9 3． 13 × 10 －2 2． 85 ± 2． 03
4 1． 35 × 10 －2 2． 71 ± 1． 27 Blank 0 1． 18 ± 1． 19
5 1． 67 × 10 －2 3． 58 ± 1． 83* Oxytocin 0． 01 U /mL 4． 52 ± 1． 96＊＊
6 1． 97 × 10 －2 3． 79 ± 2． 36*
Remark:compare with blank group，* P ＜ 0． 05;＊＊P ＜ 0． 01．
2． 4 多糖 BRP-B的血浆复钙作用
多糖 BRP-B有效浓度在 1. 56 × 10 －2 ～ 1. 25 × 10 －1 g /L范围对血浆的凝集作用数据见表 2。当其浓
度为 6. 25 × 10 －2 g /L时，促凝作用最强，其凝血时间(PRT)缩短率与阳性对照的缩短率相近。
表 2 多糖 BRP-B对 PRT的影响(时间:x ± S，n =6)
Table 2 The influence on plasma recalcification time(PRT)of BRP-B(x ± S，n =6)
Groups ρ(BRP-B)/(g·L －1) PRT of Blank /s PRT of Drug /s Shortening rate /%
1 1． 00 562． 02 ± 59． 03 580． 32 ± 65． 13 － 3． 26
2 0． 50 562． 02 ± 59． 03 544． 14 ± 62． 69 3． 17
3 0． 25 314． 34 ± 31． 38 276． 66 ± 29． 48 11． 99
4 1． 25 × 10 －1 314． 34 ± 31． 38 259． 38 ± 20． 90 17． 48＊＊
5 6． 25 × 10 －2 320． 34 ± 31． 97 248． 52 ± 19． 65 22． 42＊＊＊
6 3． 13 × 10 －2 320． 34 ± 31． 97 258． 30 ± 21． 37 19． 37＊＊
58第 1 期 廖敏富等:滇桂艾纳香水溶性多糖 BRP-B的分离纯化及止血活性
续表 2
Groups ρ(BRP-B)/(g·L －1) PRT of Blank /s PRT of Drug /s Shortening rate /%
7 1． 56 × 10 －2 405． 36 ± 32． 35 345． 48 ± 25． 23 14． 76＊＊
8 7． 81 × 10 －3 405． 36 ± 32． 35 355． 38 ± 26． 76 12． 33
9 3． 91 × 10 －3 443． 82 ± 31． 27 391． 80 ± 26． 33 11． 72
Yunnan Baiyao 0． 05 355． 37 ± 41． 15 269． 02 ± 35． 27 24． 30＊＊
＊＊P ＜ 0． 01;＊＊＊P ＜ 0． 001．
3 结 论
桂西特产草药滇桂艾纳水浸膏的提取多糖 BRP-B 的血浆复钙和离体小鼠子宫收缩实验分别显示
促凝血和促子宫收缩作用。提示 BRP-B 一方面可直接或间接地促使子宫平滑肌细胞钙离子的浓度增
加，激发子宫平滑肌的运动性能力而使收缩频率增大，从而促使血管闭合而止血［13］;另一方面，很可能
对凝血酶具有活化作用，通过增加凝血酶的活性，激活血小板，促进血栓形成，实现止血作用［14］。
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Isolation，Purification and Hemostatic Activity of
Water-soluble Polysaccharide in Blumea Riparia(BI．)DC．
LIAO Minfua，LIN Cuiwua* ，HUANG Lia，XU Zijinga，QIN Sasaa，LI Aiyuanb
(aSchool of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University，Nanning 530004;
bGuangXi Traditional Chinese Medical University，Nanning)
Abstract Water-soluble polysaccharide B(BRP-B)in Blumea riparia(BI．)DC． was extracted and purified
by using membrane separation，discoloration on diethylaminoethyl(DEAE)-cellulose，and sephadex column
chromatography of G10 and G50． Results from high-performance gel permeation chromatography(HPGPC)
showed that the obtained BRP-B has a narrow-distributed molecular mass，with the number average molecular
mass and mass average molecular mass as 2654 and 2716，respectively． The drug activity test based on plasma
recalcification as the index showed that BRP-B with the optimal concentration of 6. 25 × 10 －2 g /L had the
strongest procoagulant activity，the coagulation time was 248. 52 s，and the inhibition rate of coagulation time
was 22. 42% ． In particularly，BRP-B with concentration of 1. 67 × 10 －2，1. 97 × 10 －2 and 2. 85 × 10 －2 g /L
could significantly enhance the frequency of uterus muscle．
Keywords Blumea riparia(BI．)DC．，polysaccharide，separation，purification，hemostatic activity
78第 1 期 廖敏富等:滇桂艾纳香水溶性多糖 BRP-B的分离纯化及止血活性