全 文 ： 2011 年第 69 卷 化 学 学 报 Vol. 69, 2011
第 9 期, 1101～1106 ACTA CHIMICA SINICA No. 9, 1101～1106

* E-mail: lincuiwu@126.com; Tel.: 0771-3275878
Received August 20, 2010; revised October 21, 2010; accepted December 13, 2010.
国家自然科学基金(Nos. 20662001, 20962002)资助项目.
·研究论文·
滇桂艾纳香多糖 BRP 的结构解析
许子竞 林翠梧*
(广西大学化学化工学院 南宁 530004)
摘要 以滇桂艾纳香为原料, 经热水抽提、Sevag 法除蛋白、醇沉、DEAE-纤维素柱层析、Sephadex G-200、Sepharose
6 F.F.凝胶色谱纯化得到纯品 BRP; 经 HPGPC 检测分析表明, BRP 为均一多糖, 分子量为 3.3×104 Da; 用 UV、IR、
HPLC、HPGPC、GC-MS、甲基化、NMR (1H NMR、13C NMR、HMQC、HMBC)等方法对 BRP 结构进行表征, 结果
表明, BRP 仅由呋喃果糖残基组成, 以→2)Fruf (1→ (或→1)Fruf (→2)方式链接, 推导其结构式为: β-D-Fruf-{2[→1)-
β-D-Fruf(2→]n-1}-β-D-Fruf .
关键词 滇桂艾纳香多糖; 纯化; 核磁共振; 甲基化; 结构表征
Structure Identification of Polysaccharide BRP from Blumea Riparia
Xu, Zijing Lin, Cuiwu*
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004)
Abstract A polysaccharide (BRP) was obtained from Blumea riparia, by hot water extraction, deproteination
using Sevag method, precipitation with ethanol, and fractionation through DEAE-cellulose column, Sephadex
G-200 and Sepharose 6 F.F. Gel filtration chromatography. Based on UV and IR spectrum, HPLC, HPGPC
and GC-MS chromatography, NMR (1H NMR, 13C NMR, HMQC, HMBC) technology and methylation reac-
tion, the structure of BRP was identified. The results showed that BRP was hightly purified with average mo-
lecular weight of 3.3×104 Da determinted by HPGPC. And it was composed of Fru by HPLC analysis. The
backbone of BRP had a consisting of 1,2-linked β-D-fructofuranosyl residues. Finally, the structure of BRP
was fixed on as: β-D-Fruf-(2[→1)-β-D-Fruf(2→]n-1)-β-D-Fruf.
Keywords polysaccharide (BRP); isolation; NMR; methylation; structure characterization
多糖作为构成生命活动的基本物质之一, 在抗肿
瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老等方面发挥着其特
殊的生物活性作用. 近年来, 功能性多糖的研究已成为
一个世界性的热点, 其中多糖的结构是重要基础. 多糖
具有复杂的结构, 许多不同的单糖残基、不同的连接位
置和不同类型的糖苷键, 形成具有不同的构象、不同的
相对分子质量, 以及链内和链间氢键的二级结构. 滇桂
艾纳香(Blumea ripari DC)为菊科艾纳香属植物, 作为广
西民间中草药, 在治疗妇女功能性子宫出血、产后出血、
不育不孕症等方面有着悠久的用药历史, 尤其水溶性提
取物具有显著的止血活性功效[1～3], 而目前有关滇桂艾
纳香水溶性多糖研究的报道, 除了有本课题组关于提取
工艺研究报道外[4], 未见其它相关报道. 因此, 对纯化
的滇桂艾纳香多糖(Blumea riparia polysaccharide, BRP)
了解和阐明其结构, 对于滇桂艾纳香的药理研究, 很有
指导意义.
1 试剂、仪器和材料
1.1 材料
滇桂艾纳香枝叶(广西桂西制药厂提供).

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1.2 仪器
台式大容量离心机 TDL-5C(上海安亭科学仪器厂);
冷冻干燥机 FD-1A-50 (北京博医康实验仪器有限公司);
电脑全自动部份收集器 DBS-160(上海青浦泸西仪器
厂); 电子天平 AL204 (梅特勒-托利多仪器有限公司);
紫外-可见分光光度计 SP-756P (龙尼科(上海)仪器有限
公司); Agilent 1100 高效液相色谱仪(美国 Agilent 公司);
Waters515 型凝胶色谱仪(美国 Waters 公司); 红外光谱
仪 Nexus670FT-IR (美国 Nicolet 公司); 核磁共振仪
Bruker-AVANCE 600( 美 国 Bruker 公 司 ); Agilent
6890/5975 气质联用仪(美国 Agilent 公司).
1.3 试剂
苯酚、浓硫酸、正丁醇、氯仿、无水乙醇、95%乙
醇、醋酸酐、氯化钠等均为分析纯.
标准半乳糖醛酸、鼠李糖、果糖、甘露糖、半乳糖、
蔗糖 、乳糖(E.Merck 公司); 肌醇(上海唐捷生物科技发
展公司产品).
透析袋(截留分子量: 14 kDa)(上海华美生物工程公
司 ); DEAE-纤维素 (上海化学试剂一厂 ); Sephadex
G-200, Sepharose 6 Fast Flow(Pharmacia 公司).
2 实验方法
2.1 滇桂艾纳香多糖的提取与分离纯化
取粉碎的滇桂艾纳香 5.0 kg, 加 10 倍体积的水, 于
80 ℃提取 3 次, 每次 2 h; 合并提取液、浓缩、离心, 上
清液再减压浓缩至原体积的 1/7, 加 95%的乙醇进行沉
淀, 静置过夜后离心, 将沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、
乙醚洗涤, 冷冻干燥, 用水复溶, 采用 Sevag 法脱蛋
白[5], 重复 10 次, 直至液面交界处无胶状物, 除去残有
机溶剂, 透析, 冷冻干燥后得淡黄色粗多糖 57.1 g.
将粗多糖溶于水, 过 DEAE-纤维素柱层析[6], 依次
用水、0.15、0.3、0.5 mol/L NaCl 溶液洗脱, 分部收集, 苯
酚-硫酸法检测, 绘制洗脱曲线, 合并洗脱高峰部分, 减
压浓缩、透析, 冷冻干燥, 得各部分滇桂艾纳香多糖. 将
0.15 mol/L NaCl 洗脱部分适量溶于水, 于室温进行
Sephadex G-200 凝胶柱层析, 去离子水洗脱, 跟踪检测,
绘制洗脱曲线, 合并高峰部分, 浓缩、透析、冷冻干燥;
再将干燥物过琼脂糖凝胶 Sepharose 6 F.F., 去离子水洗
脱, 苯酚-硫酸法和 HPGPC 同时跟踪检测, 合并单一高
峰部分, 减压浓缩、透析、高速离心、冷冻干燥, 得白
色滇桂艾纳香多糖纯品(BRP)0.611 g.
2.2 BRP 纯度和分子量测定
取 1 mg BRP溶于 1 mL超纯水中, 采用高效凝胶渗
透色谱法(HPGPC)分析.
Waters515 型高效液相色谱仪: 色谱柱, TSK-Gel
G4000SWXL (7.8×300 mm)凝胶柱; 检测器, Waters
2410 示差折光检测器; 流动相, 超纯水, 洗脱流速 0.6
mL/min; 柱温与示差检测器温度, 35 , ℃ 进样量 20 μL.
根据 HPGPC 的洗脱峰型确定纯度, 由标准多糖的
分子量对数与保留时间制得标准曲线, 由标准曲线及
GPC 软件计算样品分子量[7].
2.3 BRP 单糖组成分析[8]
称取5 mg样品, 加入2 mol/L的三氟乙酸4 mL, 100
℃下密封水解 8 h, 减压浓缩, 加甲醇, 除尽三氟乙酸后
干燥, 加入适量蒸馏水溶解, 供 HPLC 检测分析, 同时
用标准单糖及其混合物作参照.
HPLC 检测条件: ZORBAX 糖分析色谱柱(4.6×
250 mm), 示差折光检测器(RID); 柱温: 35 ; ℃ 检测池
温度: 35 ; ℃ 流动相: V(乙腈)∶V(水)＝80∶20.
2.4 BRP 的红外光谱分析
取干燥后的 BRP 1 mg 与 300 mg 干燥的 KBr 混匀,
研磨, 压片, 于红外光谱仪 4000～400 cm－1中红外区扫
描, 测定透光率曲线[9].
2.5 BRP 的甲基化分析[10]
取 10 mg, 经 P2O5充分干燥的 BRP 置于 25 mL 反
应瓶中, 按文献[10]方法操作, 甲基化产物进行甲酸解
聚, 用 TFA 完全酸水解, NaBH4 还原, 乙酰化后进行
GC-MS 分析.
分析条件: OV 1701 毛细管柱(φ 0.25 mm×30 m,
膜厚 0.25 mm), 程序升温: 从 150 ℃柱温开始, 保温 2
min, 以 3 /min℃ 的速度上升至 250 , ℃ 停留 10 min; 载
气 He, 离子源: EI 源, 70 eV, 进口温度 250 , ℃ 离子源
温度 200 , ℃ 检测电压 350 V.
3 结果与讨论
3.1 粗多糖紫外扫描分析
粗多糖脱蛋白前后其水溶液在紫外可见光 190～
400 nm 范围内扫描显示, 经脱蛋白后, 在 260 nm (核酸
的特征吸收峰)和 280 nm 处(蛋白的特征吸收峰)吸收峰
不明显, 说明 BRP 中几乎不含有蛋白质和核酸(如图 1).
3.2 BRP 的纯度及分子量检测
BRP 的 HPGPC 检测表明(图 2), 色谱峰型单一, 均
匀对称, 其保留时间为 34.87 min, 其重均相对分子质量
(Mw) 为3.3×104, 多分散系数Mw/Mn＝1.023, 确认BRP
为均一多糖.

No. 9 许子竞等：滇桂艾纳香多糖 BRP 的结构解析 1103


图 1 BRP 除蛋白质前(a)﹑后(b)的紫外可见光谱
Figure 1 The spectrum of not removed protein (a) and removed
protein (b)

图 2 BRP 的 HPGPC 谱图
Figure 2 HPGPC of BRP
3.3 BRP 的 HPLC 分析
BRP 的 HPLC 检测图谱显示为一个单峰(如图 3b),
保留时间为 6.901 min, 归一法面积 98.91%, 与混合标
准单糖及单糖谱图对照确认, BRP 水解产物为果糖.

图 3 混合标准单糖 HPLC 图谱(a)和 BRP 水解物的 HPLC 图
谱(b)
Figure 3 HPLC of mixed standard monosaccharides (a) and
hydrolysate of BRP (b)
1: galacturonic acid; 2: rhamnose; 3: fructose; 4: mannose; 5: galactose; 6:
sucrose; 7: lactose
3.4 BRP 的红外光谱分析
从 BRP 的红外光谱图(图 4)中可以看出, 3424.25
cm－1 处的强吸收峰是糖分子中 O—H 键的伸缩振动吸
收, 2925.87 cm－1 处的峰是 C—H 键的伸缩振动吸

图 4 BRP 的红外光谱
Figure 4 IR spectrum of BRP

1104 化 学 学 报 Vol. 69, 2011

收, 1615.113 cm－1处的峰是糖结合水的吸收峰, 1417.12
cm－1的峰是糖分子中 C—H 键的变角振动吸收, 1033.85
cm－1处的峰是 C—O 键的变角振动吸收; 另外, 在 1730
cm－1 附近无糖醛酸对应的吸收峰, 表明该糖不含有糖
醛酸, 在 845 和 890 cm－1 无吸收峰, 说明多糖分子中无
吡喃糖苷[11].
3.5 BRP 甲基化分析
从甲基化产品红外检测图(如图 5)可以看出, 甲基化
5次, 一次比一次反应完全, 3424.25 cm－1处的OH强吸收
峰逐渐减弱至完全消失, 2925.87 和 2855.42 cm－1处 CH3
吸收峰在逐渐增强至很强, 表明 BRP 甲基化程度完全.

图 5 BRP 5 次甲基化的红外光谱图
Figure 5 IR spectrum of BRP via five methylation
BRP 甲基化产品经酸水解、还原、乙酰化后转变为
部分甲基化的糖醇乙酸酯, 经 GC/MS 分析[12], 如表 1～
2 所示.
表 1 甲基化产品 GC/MS 碎片和丰度
Table 1 GC/MS fragmentations of the derivatives produced by
reductive-cleavage and acetylationa
Methylated derivatives produced
MS data of main fragments, m/z
(%)
1-O-acetyl-2,5-Anhydro-
3,4,6-tri-O-methyl-D-mannitol
41 (27), 43 (93), 45 (46), 53 (13),
55 (15), 59 (14), 69 (17), 71 (77),
75 (16), 83 (31), 85 (34), 87 (21),
99 (17), 101 (79), 111 (100), 114
(29), 115 (57), 117 (19), 125 (51),
126 (49), 143 (81), 156 (9), 157
(13), 171 (6), 188 (7), 249 (21)
1-O-acetyl-2,5-Anhydro-
3,4,6-tri-O-methyl-D-
glucitol
41 (37), 43 (100), 45 (59), 55
(17), 59 (14), 69 (25), 71 (69), 75
(15), 83 (21), 85 (32), 87 (39), 99
(18), 101 (95), 111 (64), 114 (41),
115 (29), 117 (25),125 (41),126
(46), 143 (17), 157 (5), 188 (9),
249 (5)
a The mass number is given firstly,followed by the relative abundance in pa-
rentheses.
表 2 BRP 残基甲基化比率和链接方式
Table 2 Molar ratio and linkage type of methylated monosac-
charides residue of BRP
Methylated sugar Molar ratio Linkage type
1-O-Acetyl-2,5-anhydro-3,4,6-tri-
O-methyl-D-mannitol
1 →2)Fruf(1→
1-O-Acetyl-2,5-anhydro-3,4,6-tri-
O-methyl-D-glucitol
1 →2)Fruf(1→

从表1～2可以看出, 单糖残基上没有侧链, 残基间
以 C1, C2 位相链接, 单糖残基(→2)D-Fruf (1→)甲基化
产物水解后再乙酰化, 质谱裂解生成两种产物[13], 即
1-O-acetyl-2,5-anhydro-3,4,6-tri-O-methyl-D-mannitol 和
1-O-acetyl-2,5-anhydro-3,4,6-tri-O-methyl-D-glucitol. 由
于两个末端残基→2)D-Fruf 和 D-Fruf (1→在整个 BRP
分子链中所占比例非常少(约几千分之一), 所以在质谱
中未能找到, 故其残基摩尔分数比可忽略不计.
3.6 BRP 的 1D, 2D NMR 分析
在 1H NMR 谱图中看出(如图 6), 化学位移大于 δ
4.20 无质子信号, 说明该单糖残基无异头质子, 是果糖
残基 1H NMR谱的特征谱图, 这与BRP是由单一果糖组
成相吻合.
从BRP的 13C NMR谱图(图 7)可见, 组成糖基C1～
C6 的共振信号集中在 δ 60～104 范围内, 在低碳异头区
域出现 2 个吸收峰(δ 103.755, 103.168), 说明其中存在 2
种不同的连接方式. δ 103.755, 103.168 为 β-D-Fruf 的异
头碳信号[14]; 在非异头碳 δ 60～82 区域内, 结合 BRP
的 HMQC(图 8)和 HMBC 的图谱(图 9)分析, δ 81.153 为
β-D-Fruf C5 吸收峰信号; δ 77.487, 76.910 为不同 β-D-
Fruf 残基环上 C3 的吸收峰信号, δ 74.416 为 β-D-Fruf
环上 C4 吸收峰信号, δ 62.249, 61.960 和 60.914, 60.632
分别为不同β-D-Fruf 残基上C6和C1的吸收峰信号, 各
碳信号归属如表 3.
表 3 BRP 的单糖残基 C 化学位移归属
Table 3 Chemical shift assignments for the 13C NMR spectrum
of BRP
残基 C1 C2 C3 C4 C5 C6
→2)Fruf
(1→
60.914a
60.632a
103.755a
103.168a
77.486a
76.910a
74.416 81.153
62.249a
61.960a
a Unresolved from other signals.
HMBC 谱图表明, β-D-Fruf 残基-C2 吸收峰信号还
和另一 β-D-Fruf 残基 -C1(H11,H12)上两质子相关 (δC
103.755 与 δH 3.837, δC 103.168 与 δH 3.723 相关), 可推
断 β-D-Fruf 残基之间的连接方式是 β-D-Fruf-C2-O-C1-
(H11,H12)-β-D-Fruf, 同时甲基化分析也表明残基链接方
式为→2)Fruf(1→, 且无侧链链接.

No. 9 许子竞等：滇桂艾纳香多糖 BRP 的结构解析 1105


图 6 BRP 的 1H NMR 谱
Figure 6 1H NMR Spectrum of BRP

图 7 BRP 的 13C NMR 谱
Figure 7 13C NMR spectrum of BRP

图 8 BRP 的 HMQC 谱图中(F 为果糖缩写, H11表示 H1 上 1
号质子, H12类推)
Figure 8 HMQC spectrum of BRP (Fructose abbreviation F,
H11 substitute for No. 1 proton of H1, H12 by analogy)
综合 HMBC 谱和甲基化分析表明, 多糖 BRP 是由
重复的 β-D-Fruf 残基单元组成, 其残基的链接方式为
→2)Fruf (1→(或→1)Fruf (→2), 导出其化学结构式为:
β-D-Fruf-{2[→1)-β-D-Fruf(2→]n-1}-β-D-Fruf .
通过查阅Scifinder证实, BRP是一个新的多糖结构.

图 9 多糖 BRP 的 HMBC 图谱 (Fn 表示第 n 个残基, Fn-1 类
推)
Figure 9 HMBC spectrum of BRP (n-β-D-Fructose residue
abbreviation Fn, and Fn-1 by analogy)
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