全 文 ：Science and Technology of Food Industry 工 艺 技 术
2013年第18期
响应面分析法优化蓝靛果花色苷纯化
工艺研究
刘敬华1，王振宇1，2，*，邓心蕊3
（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040；
2.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨 150090；
3.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040）
摘 要：利用响应面法对蓝靛果花色苷的纯化工艺进行优化。在单因素实验基础上，选取上样浓度、径长比、洗脱流速
为自变量，以花色苷的纯度为响应值，利用Box-Benhnken中心组合设计原理和响应面分析法，研究各自变量及其交互
作用对纯度的影响，获得的最佳工艺条件为：上样浓度2.5mg/mL、径长比1∶25、洗脱剂浓度为70%的乙醇、洗脱流速
3mL/min，获得的花色苷的纯度为19.54%。
关键词：蓝靛果，花色苷，X-5，纯化，纯度，响应面
Optimization of purification technique of anthocyanin from
Lonicera Edulis via response surface methodology（RSM）
LIU Jing-hua1，WANG Zhen-yu1，2，*，DENG Xin-rui3
（1.School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；
2.School of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China；
3.School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）
Abstract：Response surface methodology（RSM） was used to optimize purification of anthocyanin from Lonicera
edulis . Based on single factor tests ， three purification parameters including sample concentration ， ratio of
diameter to length，elution flow rate were optimized through Box-Benhnken central combination design and
RSM for achieving maximum the purification of anthocyanin. The interaction of the respective variables and their
influence on the purification were studied to obtain the optimum purification conditions of anthocyanin were as
follows：the sample concentration 2.5mg/mL，diameter to length ratio 1∶25，eluent concentration 70% ethanol，
elution velocity 3mL/min. Under such conditions，the purity of anthocyanins was up to 19.54%.
Key words：Lonicera edulis；anthocyanin；X-5；purification；purity；response surface methodology（RSM）
中图分类号：TS255.1 文献标识码：B 文 章 编 号：1002-0306（2013）18-0280-04
收稿日期：2013－02－19 * 通讯联系人
作者简介：刘敬华（1987-），女，硕士研究生，研究方向：功能性食品。
基金项目：哈尔滨市科技攻关计划项目（2011HG6AN107）。
蓝靛果（Lonicera edulis）又名黑瞎子果、山茄子
果等，是一种药食同源的新兴野生浆果。蓝靛果营养
价值丰富，其中Vp、Vpp比一般果蔬含量高数百倍，
VC含量比苹果多数十倍，深受国内外市场的欢迎，具
有“第三代水果”之称[1]。蓝靛果花色苷作为一种天然
无毒的食用色素被广泛应用于食品工业，研究表明，
它还具有抗病毒、抗氧化、抗癌、保护视力等[2-5]作用。
虽然对蓝靛果花色苷纯化的研究很多，但由于其纯
化过程复杂且较难控制，因此这些研究多停留在单
因素阶段，而对其纯化工艺采用进一步的响应面分
析法的研究较少。
响应面分析法[6-8]（response surface methodology，
RSM）是一种结合实际研究应用数学建模优化反应
条件和加工工艺参数的有效方法，具有实验周期短，
获得的回归方程精度高，能研究几种因素间交互作
用等优点，被广泛应用于多学科多领域。本实验拟在
单因素实验的基础上，利用响应面分析法对蓝靛果
花色苷纯化工艺条件进行优化。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
蓝靛果 采摘于大兴安岭；无水乙醇、乙酸钠、
乙酸、氯化钾、盐酸 均为分析纯；大孔树脂（AB-8，
X-5，D101，NKA-9，NKA） 均购自南开大学树脂厂。
HANGPING FA2004型电子分析天平 上海良平
仪器仪表有限公司；RE-52A型旋转蒸发器、PB-10型精
密pH计 上海亚荣生化仪器厂；TDL-5-W型离心机
上海科兴仪器公司；722S型可见分光光度计 上海
精密科学仪器有限公司；层析柱（规格Ф20×600mm）。
1.2 实验方法
1.2.1 花色苷含量的测定（pH示差法） 将样品稀释
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Vol . 34 , No . 18 , 2013
至一定浓度，取稀释后样品1mL，加入pH为1.0、4.5的
缓冲溶液9mL，缓冲液的配制方法参照文献[9]，室温
下，以蒸馏水为空白，于510nm下和700nm波长下测
定其吸光度，计算其浓度。
稀释后样品的吸光度ΔA计算式为：
ΔA=（A510－A700）pH1.0－（A510－A700）pH4.5
花色苷浓度计算式为：
C=（ΔA×Mw×DF）/（ε×L）
式中，C-花色苷含量，mg/mL；ΔA-吸光度；Mw-
矢车菊3-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2；DF-样品
总的稀释倍数；ε-矢车菊3-葡萄糖苷的摩尔消光系
数，26900mol-1；L-比色皿光程（一般为1cm）。
花色苷纯度的计算公式为：
纯度（%）=[（C×V）/m]×100
式中，C-花色苷的含量，mg/mL；V-花色苷的体
积，mL；m-花色苷干物质的质量，mg。
花色苷回收率的计算公式为
回收率（%）=[（C1V1）/（C0V0）]×100
式中，C0—上样液浓度，mg/mL；V0—上样液体
积，mL；C1—收集液浓度，mg/mL；V1—收集液体积，
mL。
1.2.2 蓝靛果花色苷纯化工艺流程 树脂的处理→装
柱→上样→静置吸附2h→水洗→乙醇洗脱液洗脱→洗脱液旋
转蒸发浓缩→40℃烘干→测量其纯度。
树脂的处理参照文献[10]中的方法进行，湿法装
柱，将水面调至略高于树脂面，将自制蓝靛果提取液
作为上样液，用注射器吸取并沿层析柱壁缓慢注射
入层析柱中进行上样，速度以不破坏树脂柱面为宜，
上样完毕，静置2h，使花色苷被树脂充分吸附，用蒸
馏水进行水洗至流出液澄清为止，目的是将杂质及
未吸附上的花色苷冲洗去除，将蒸馏水面放至与树
脂柱面相平，加入2BV乙醇洗脱液洗脱，收集洗脱
液，在40℃下置于平皿中烘干，用钥匙刮下一部分，
用万分之一天平取12~15mg左右测量纯度，为了更好
地溶解先加入少量乙醇，然后用蒸馏水定容至50mL
进行测定。
1.2.3 树脂的筛选 将处理好的五种大孔树脂
AB-8、X-5、D101、NKA-9、NKA分别装入层析柱中，
径长比1 ∶20，上样浓度为1.42mg/mL，上样体积为
10mL，用2BV的60%乙醇洗脱液进行洗脱，洗脱流速
为1mL/min，收集洗脱液比较其纯度和回收率，筛选
出最佳树脂。
1.2.4 单因素实验
1.2.4.1 上样液浓度对纯度的影响 通过上述实验，
用X-5树脂进一步进行上样浓度的筛选，将花色苷粗
提液浓缩至一定浓度，然后将其稀释为0.5、1.0、1.5、
2.0、2.5、3.0、3.5mg/mL分别上柱，径长比1∶20，上样体
积为10mL，用2BV的60%乙醇进行洗脱，洗脱流速为
1mL/min，收集洗脱液比较其纯度，筛选出最佳上样
浓度。
1.2.4.2 径长比对纯度的影响 将X-5树脂按径长
比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30装入各层析柱中，
将花色苷粗提液浓度调节至2.5mg/mL进行上样，上
样体积为10mL，用2BV的60%乙醇进行洗脱，洗脱流
速为1mL/min，收集洗脱液比较其纯度，筛选出最佳
径长比。
1.2.4.3 洗脱液乙醇浓度对纯度的影响 将X-5树
脂按径长比1∶25装入层析柱中，上样浓度为2.5mg/mL，
上样体积为10mL，用2BV的乙醇进行洗脱，洗脱流速
为1mL/min，调节乙醇浓度为别为10%、20%、30%、
40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，收集洗脱液
比较其纯度，筛选出最佳乙醇浓度。
1.2.4.4 洗脱流速对纯度的影响 将X-5树脂按径
长比1∶25装入层析柱中，调节上样浓度为2.5mg/mL，
上样体积为10mL，洗脱流速分别1、2、3、4mL/min，用
2BV的70%乙醇进行洗脱，比较其纯度，筛选出最佳
洗脱流速。
1.2.5 响应面实验设计 利用Minitab 16软件根据
Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，综合单因
素影响实验结果，选择影响较大的三个因素上样浓
度、径长比、洗脱流速进行三因素三水平的响应面分
析。实验设计中的水平及编码见表1。
2 结果与分析
2.1 最佳树脂的筛选
由图1可知，纯度方面，X-5、D101的纯度相当，
AB-8略小，NKA-9略高，而NKA最小；回收率方面，
X-5、D101较高，分别为71.03%和68.26%，AB-8次
之，而NKA-9、NKA的回收率较低。这与树脂的极性
有关，X-5、D101、AB-8为非极性或弱极性树脂，吸附
率及解析率较高，NKA-9和NKA为强极性树脂，吸附
率高，解析率低。综合考虑，选择X-5为纯化蓝靛果
花色苷的最佳树脂，这和文献[10]的研究结果是一
致的。
2.2 单因素实验
2.2.1 上样液浓度对纯度的影响 由图2可知，随着
因素
编码水平
-1 0 1
A 上样浓度（mg/mL） 2.0 2.5 3.0
B 径长比 1∶20 1∶25 1∶30
C 洗脱流速（mL/min） 2 3 4
表1 响应面实验因素水平编码表
Table 1 Factors and levels of response surface experiment
80
70
60
50
40
30
20
10
0
X-5 D101 AB-8 NKA-9 NKA
纯
度
（
%）
回
收
率
（
%）
纯度
回收率
图1 不同树脂的纯度及回收率的比较
Fig.1 Comparison of purity and recovery rate for different resin
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实验号 A B C 纯度（%）
1 -1 -1 0 16.36
2 1 -1 0 16.87
3 -1 1 0 16.40
4 1 1 0 17.57
5 -1 0 -1 16.66
6 1 0 -1 18.12
7 -1 0 1 14.13
8 1 0 1 17.07
9 0 -1 -1 18.03
10 0 1 -1 15.97
11 0 -1 1 15.18
12 0 1 1 16.75
13 0 0 0 19.29
14 0 0 0 19.63
15 0 0 0 19.34
表2 Box-Benhnken实验设计及结果
Table 2 Results of response surface experiments
图4 不同浓度的乙醇对花色苷的纯度的影响
Fig.4 Effect of different concentrations of ethanol on the purity
of anthocyanin
20
18
16
14
12
10
乙醇浓度（%）
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
花
色
苷
纯
度
（
%）
图5 不同的洗脱流速对花色苷纯度的影响
Fig.5 Effect of different elution velocity on the purity
of anthocyanin
18
17
16
15
14
洗脱流速（mL/min）
0 1 2 3 4 5
花
色
苷
纯
度
（
%）
上样浓度的增加，洗脱液中花色苷的纯度逐渐增加，
当上样浓度为2.5mg/mL时，洗脱液中花色苷的纯度
达到最大，当上样浓度继续增加，花色苷的纯度反而
下降，当上样浓度较小时，洗脱时残留于树脂中的花
色苷较多，因此洗脱下来的花色苷纯度不高，然而树
脂的吸附能力有限，如果上样浓度过大，未吸附上的
花色苷就会越多，花色苷的纯度同样会不高。
2.2.2 径长比对纯度的影响 由图3可以看出，花色
苷的纯度随着径长比的增加，纯度逐渐增加，当径长
比达到1∶25时，花色苷的纯度达到最大，径长比继续
增加，花色苷纯度开始有所下降，这是因为径长比较
小时，不能充分对花色苷进行吸附，导致水洗时花色
苷被大量冲洗下来，因此纯度降低，当径长比较大
时，花色苷不能被完全洗脱下来，部分残留于树脂
中，纯度同样会下降。
2.2.3 洗脱液乙醇浓度对纯度的影响 由图4可知，
随着乙醇浓度的增加，花色苷的纯度逐渐增加，当乙
醇浓度达到70%时，花色苷的纯度达到最大，当乙醇
浓度继续增加，花色苷的纯度开始下降，这是因为花
色苷是部分水溶性部分醇溶性的，当乙醇与水的比
例不同时，溶于其中的花色苷的量不同，且易溶于醇
的部分所占比例较大，因此最适的洗脱剂的浓度偏
向于乙醇比例较大的70%。
2.2.4 洗脱流速对纯度的影响 由图5可知，洗脱液
中花色的纯度随洗脱流速增加呈现先增后减的趋
势，当流速为3mL/min时，花色苷的纯度达到最大，这
可能是因为流速过慢时，解析下来的花色苷部分被
树脂吸附，导致其纯度不高，但流速过快以后使部
分花色苷从树脂上来不及解析下来，因此纯度同样
不高。
2.3 响应面的实验设计及结果
Box-Benhnken实验设计及结果见表2，由表3可知，
层析柱的径长比对纯度影响不显著，上样浓度、洗脱
图2 不同上样液浓度对花色苷的纯度的影响
Fig.2 Effect of different sample concentration on purity
of anthocyanin
19
18
17
16
15
14
花色苷浓度（mg/mL）
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
花
色
苷
纯
度
（
%）
图3 不同径长比对花色苷纯度的影响
Fig.3 Effect of different diameter ratio on the purity
of anthocyanin
20
18
16
14
12
径长比
1∶10 1∶15 1∶20 1∶25 1∶30
花
色
苷
纯
度
（
%）
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图6 径长比与洗脱流速对花色苷纯度影响的响应面图
Fig.6 Response surface of diameter ratio and flow rates of
eluent on the anthocyanin purity
19.5
纯
度
（
%）
径长比
洗脱流速
1
18.0
16.5
15.0
0
-1
-1
0
1
流速对纯度的影响结果显著；上样浓度、径长比、洗
脱流速三者的二次项对纯度的影响结果极显著；上
样浓度与径长比、洗脱流速之间交互作用不显著，径
长比与流速之间交互作用显著，由此可见，各具体实
验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。
各因素的F值可以反映各因素的影响程度，F值
越大，表明对实验指标的影响越大。由表3可得出各
因素对花色苷纯度的影响的大小顺序为：上样浓度＞
洗脱流速＞径长比。
模型的失拟值为0.068，不显著，方程的相关系数
R2为95.62%，调整后为87.74%，证明模型与实际的拟
合性较好，利用软件进行非线性回归的二次多项式
的拟合，得到预测模型如下：
Y=19.42+0.76A+0.03125B-0.70625C-1.30375A2-
1.31625B2-1.62125C2+0.165AB+0.37AC+0.9075BC
由回归方程，得出拟合的径长比与洗脱流速对
花色苷纯度影响的响应面图见图6。
由图6可知，根据回归方程，所拟合的响应曲面
的形状，抛物面开口向下，说明所拟合的回归模型有
极大值点。由回归方程解得中心点的最佳解为：纯度
19.40%，上样浓度2.63mg/mL，径长比为1∶24.8，洗脱
流速为2.8mL/min，为了方便，在进行验证性实验时
我们将这一条件修正为上样浓度为2.5mg/mL时，径
长比为1∶25时，洗脱流速为3mL/min时，三次重复实
验实际验证得花色苷的平均纯度为19.54%，与模型
预测值相差0.14%，模型与实际拟合较好，能够很好
地预测实际的花色苷纯度。
3 结论
AB-8、X-5、D101、NKA-9、NKA五种树脂从纯度
及回收率两方面考虑，可知非极性的大孔树脂X-5对
花色苷的纯化效果较好，通过单因素实验设计，以及
在此基础上对上样浓度、径长比、洗脱流速进行了三
因素三水平响应面法实验，建立了响应值与各因素
之间的数学模型，依此模型可以预测理论提取率。根
据此二次回归模型，确定纯化蓝靛果花色苷的最优
工艺参数为：上样浓度为2.5mg/mL时，径长比为1∶25
时，洗脱剂乙醇的浓度为70%时，洗脱流速为3mL/min
时。按此工艺条件实际获得的花色苷纯度可达19.54%，
与模型预测值相差0.14%，模型与与实际拟合较好，
能够很好地预测实际的花色苷纯度。
参考文献
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项目 自由度 平方和 均方 F值 p值 显著性
回归 9 32.0157 3.55730 12.13 0.007 *
线性 3 8.6189 2.87298 9.80 0.016 *
A 1 4.6208 4.62080 15.76 0.011 *
B 1 0.0078 0.00781 0.03 0.877
C 1 3.9903 3.99031 13.61 0.014 *
平方 3 19.4461 6.48202 22.10 0.003 **
A2 1 4.4676 6.27605 21.40 0.006 **
B2 1 5.2734 6.39698 21.81 0.005 **
C2 1 9.7051 9.70505 33.09 0.002 **
交互作用 3 3.9507 1.31691 4.49 0.070
AB 1 0.1089 0.10890 0.37 0.569
AC 1 0.5476 0.54760 1.87 0.230
BC 1 3.2942 3.29422 11.23 0.020 *
残差误差 5 1.4663 0.29326
失拟 3 1.3989 0.46631 13.84 0.068
纯误差 2 0.0674 0.03370
合计 14 33.4820
R2=95.62% R2adj=87.74%
注：**，表示极显著（p<0.01）；*，表示显著（0.01
Table 3 Analysis results of regression and variance
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