全 文 ：叶秀仙，黄敏玲，樊荣辉，等．蝴蝶兰离体保存及其遗传稳定性研究 ［Ｊ］．福建农业学报，２０１４，２９ （１０）：９７６－９８１．
ＹＥ　Ｘ－Ｘ，ＨＵＡＮＧ　Ｍ－Ｌ，ＦＡＮ　Ｒ－Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ　ａｍａｂｉｌｉｓ ［Ｊ］．Ｆｕｊｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１４，２９ （１０）：９７６－９８１．
蝴蝶兰离体保存及其遗传稳定性研究
叶秀仙１，２，３，黄敏玲１，２，３＊，樊荣辉１，２，３，吴建设１，２，３，钟淮钦１，２，３
（１．福建省农业科学院作物研究所，福建　福州　３５００１３；２．福建省农业科学院花卉研究中心，
福建　福州　３５００１３；３．福建省特色花卉工程技术研究中心，福建　福州　３５００１３）
收稿日期：２０１４－０８－０４初稿；２０１４－０９－１５修改稿
作者简介：叶秀仙 （１９７７－），女，副研究员，主要从事花卉组织培养技术研究 （Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｘｘ７８６１＠１６３．ｃｏｍ）
＊通讯作者：黄敏玲 （１９６０－），女，研究员，主要从事花卉品种选育与生物技术研究 （Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｍｌ６１８＠１６３．ｃｏｍ）
基金项目：福建省科技计划重大专项 （２０１０ＮＺ０００３）；福建省财政专项－福建省农业科学院科技创新团队建设基金ＣＸＴＤ－２－１３１７）
摘　要：采用缓慢生长保存法对蝴蝶兰试管苗进行离体保存，并对保存材料再生后代的遗传稳定性进行研究。
结果表明：在培养温度 （２４±３）℃，光照强度前３个月２　０００～２　５００ｌｘ和３个月后５００～１　０００ｌｘ，光照时间１２
ｈ·ｄ－１的培养条件下，蝴蝶兰试管苗在添加蔗糖１０ｇ·Ｌ－１的 Ｈｙｐｏｎｅｘ　Ｎｏ．１　３．０ｇ·Ｌ－１＋ＡＣ　０．５ｇ·Ｌ－１培养
基上保存１８个月，存活率达９６．３％；在添加甘露醇１５ｇ·Ｌ－１或多效唑 （ＰＰ３３３）６．０ｍｇ·Ｌ－１的 Ｈｙｐｏｎｅｘ　Ｎｏ．１
３．０ｇ·Ｌ－１＋ ＡＣ　０．５ｇ·Ｌ－１＋ 蔗糖２０ｇ·Ｌ－１培养基上保存１８个月，存活率达８０．０％以上，且保持较高的增
殖速率，增殖系数４．１；上述３种方法保存后的试管苗均能正常恢复生长，其植株与对照在形态性状方面无明显
区别，ＲＡＰＤ分子标记也显示与对照无差异带出现，遗传性状稳定。
关键词：蝴蝶兰；缓慢生长法；离体保存；遗传稳定性
中图分类号：Ｓ　６８２．３１ 文献标识码：Ａ
Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ　ａｍａｂｉｌｉｓ
ＹＥ　Ｘｉｕ－ｘｉａｎ１，２，３，ＨＵＡＮＧ　Ｍｉｎ－ｌｉｎｇ１，２，３＊，ＦＡＮ　Ｒｏｎｇ－ｈｕｉ　１，２，３，ＷＵ　Ｊｉａｎ－ｓｈｅ　１，２，３，ＺＨＯＮＧ　Ｈｕａｉ－ｑｉｎ　１，２，３
（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｊｉａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ　３５００１３，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｆｌｏｗｅｒｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｆｕｊｉａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ　３５００１３，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｆｕｊｉａｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　Ｆｌｏｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ　３５００１３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ　ａｍａｂｉｌｉｓ　ｓｈｏｏｔｓ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ，ａｔ（２４±３）℃ ｗｉｔｈ　ａ　１２ｈｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ　ｏｆ　２　０００－２　５００
ｌｘ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｎｉｔｉａｌ　３ ｍｏｎｔｈｓ　ｆｏｌｏｗｅｄ　ｂｙ　５００－１　０００ｌｘ　ｆｏｒ　ａｎｏｔｈｅｒ　３ ｍｏｎｔｈｓ，９６．３％ ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｈｏｏｔｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ
ｓａｔｉｓｆａｃｔｏｒｉｌｙ　ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｆｏｒ　１８ｍｏｎｔｈｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｈｙｐｏｎｅｘ　Ｎｏ．１　３．０ｇ·Ｌ－１＋ＡＣ　０．５
ｇ·Ｌ－１　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ｗｉｔｈ　１０ｇ·Ｌ－１　ｓｕｃｒｏｓｅ．Ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ，Ｈｙｐｏｎｅｘ　Ｎｏ．１　３．０ｇ·Ｌ－１＋ＡＣ　０．５ｇ·Ｌ－１＋
ｓｕｃｒｏｓｅ　２０ｇ·Ｌ－１　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ｗｉｔｈ　１５ｇ·Ｌ－１　ｍａｎｎｉｔｏｌ　ｏｒ　６．０ｍｇ　Ｌ－１　ＰＰ３３３，ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ，ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｗａｓ
８０．０％ｆｏｒ　１８ ｍｏｎｔｈｓ，ｂｕｔ　ａ　ｈｉｇｈ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　４．１ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ，ａｌ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ
ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｗｉｔｈ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｈｅ　ＲＡＰＤ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｌｓｏ
ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ　ｎｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｂａｎｄｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｐ．ａｍａｂｉｌｉｓ　ｔｏｗａｒｄ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ　ａｍａｂｉｌｉｓ；ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ；ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ；ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ
　　蝴蝶兰Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ　ａｍａｂｉｌｉｓ为兰科蝴蝶兰属
热带气生兰，花色艳丽、花姿优雅、花序排列整
齐，花期长达３～５个月，具有很高的观赏价值，
为热带兰中的珍品，有 “兰中皇后”的美誉［１－３］。
近年来，随着蝴蝶兰产业的不断壮大发展，在其组
培快繁、组培褐变机理、栽培及采后生理、基因工
程等方面均有较深入的研究［４－８］。蝴蝶兰品种资源
的收集、保存与创新利用依然是促进其产业发展的
驱动力，其种质资源是品种改良、创新的基础。目
前，蝴蝶兰种质资源保护途径同其他兰花资源一
样，主要是采用田间种植保存和组织培养保存，但
蝴蝶兰活体保存需要现代设施设备条件，成本较
福建农业学报２９（１０）：９７６～９８１，２０１４
Ｆｕｊｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
文章编号：１００８－０３８４ （２０１４）１０－９７６－０６
高，而组织培养保存需对种质材料进行频繁继代，
工作量大，成本也高且可能会发生变异等问题。因
此，研究探索一套符合蝴蝶兰特点的种质资源保存
方法十分必要。
随着植物组织培养技术的全面展开，以之为基
础的缓慢生长离体保存技术发展较快［９－１０］，目前
已成功地应用于多种植物的种质资源离体保存，如
文心兰、铁皮石斛、多花脆兰、百合、香石竹及菊
花［１１－２１］等花卉种质资源离体保存，但在蝴蝶兰种
质离体保存中应用仅见李军［２２］等有简单的报道。
本研究在已建立蝴蝶兰离体培养技术体系的基础
上，系统研究了培养基中添加不同浓度蔗糖、甘露
醇及多效唑 （ＰＰ３３３）对蝴蝶兰试管苗离体保存的
影响，并进一步对保存材料再生后代进行遗传稳定
性评价，以期为蝴蝶兰种质资源中长期保存提供理
论依据和技术参考。
１　材料与方法
１．１　 材料
蝴蝶兰 ‘阳光地带’Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ　ａｍａｂｉｌｉｓ
‘Ｓｕｎｓｈｉｎｅ　Ｓｔｒｉｐ’品种，从台湾引进，以花梗为外
植体，选择丛生芽诱导途径，建立无菌系。以无菌
系的单芽 （株高１．５～２．０ｃｍ，带２片叶）作为离
体保存试验材料。试验在福建省特色花卉工程技术
研究中心花卉育种实验室进行。
１．２　方法
１．２．１　离体保存　以 Ｈｙｐｏｎｅｘ　Ｎｏ．１３．０ｇ·Ｌ－１
＋ＡＣ　０．５ｇ·Ｌ－１为基本培养基，探索蔗糖浓度１０
～１００ｇ·Ｌ－１对试管苗保存的影响，以蔗糖浓度
２０ｇ·Ｌ－１ （适宜于蝴蝶兰正常生长培养基中的蔗
糖含量）为对照 （ＣＫ）；以 ＨｙｐｏｎｅｘＮｏ．１３．０
ｇ·Ｌ－１ ＋蔗糖２０ｇ·Ｌ－１＋ＡＣ　０．５ｇ·Ｌ－１为基本
培养基，探索甘露醇浓度１０～５０ｇ·Ｌ－１、ＰＰ３３３浓
度０．５～６．０ｍｇ·Ｌ－１对试管苗保存的影响，分别
以不添加甘露醇、多效唑 （ＰＰ３３３）为对照 （ＣＫ）；
ｐＨ均为５．８。每处理接种１２～１５瓶，每瓶３～４
株，瓶口用保鲜膜封口。每３个月调查１次存活率
（存活率为存活株数与接种株数的比值×１００％），
不更换培养基连续保存１８个月。以上试剂均为国
药集团化学试剂有限公司生产的分析纯试剂。
培养条件：培养温度 （２４±３）℃，光照强度前
３个月２　０００～２　５００ｌｘ和３个月后５００～１　０００ｌｘ，
光照时间１２ｈ·ｄ－１。
１．２．２　保存材料的恢复培养　对保存１８个月存活
的试管苗进行恢复增殖培养 （Ｈｙｐｏｎｅｘ　Ｎｏ．１３．０
ｇ·Ｌ－１＋肌醇０．１ｇ·Ｌ－１＋６－ＢＡ　３．０ｍｇ·Ｌ－１＋
Ａｄ　３．０ｍｇ·Ｌ－１＋ ＮＡＡ　０．２ｍｇ·Ｌ－１＋ 蔗糖２０
ｇ·Ｌ－１），调查其恢复生长情况；对保存后恢复生
长的增殖苗与正常生长的试管苗 （对照）进行生根
培养 （１／２ＭＳ ＋ ＩＢＡ　０．５ ｍｇ·Ｌ－１ ＋ＡＣ　０．５
ｇ·Ｌ－１＋蔗糖２０ｇ·Ｌ－１）。
培养条件为培养温度 （２４±３）℃、光照强度
２　０００～２　５００ｌｘ、光照时间１２ｈ·ｄ－１。试管苗正
常移栽，观察其叶形、叶色等性状。
１．２．３　再生植株遗传稳定性检测　随机选取３种
方法保存后的再生后代植株，每种２０株，ＣＴＡＢ
法分别提取植株叶片ＤＮＡ［２３］。将同种方法保存的
２０株叶片ＤＮＡ等量混合，以种质资源圃活体保存
的母本植株为对照，应用２００个 ＲＡＰＤ随机引物
（Ｓ１－Ｓ２００）进行检测。采用２５．０μＬ　ＰＣＲ 反应体
系，包括１０ ×Ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ、２．５ｍｍｏｌ· Ｌ
－１
ｄＮＴＰ　２μＬ、５ Ｕ·μＬ
－１　Ｔａｑ 酶 ０．３μＬ、１０
μｍｏｌ·Ｌ
－１　ＲＡＰＤ随机扩增引物１．０μＬ、ｄｄＨ２Ｏ
１８．２μＬ、模板 ＤＮＡ　１．０μＬ。扩增反应程序为
９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性１ｍｉｎ；３７℃复性１
ｍｉｎ；７２℃延伸１．５ｍｉｎ，４０个循环，７２℃延伸７
ｍｉｎ，最后４℃保存。电泳结束后在凝胶成像系统
分析仪中观察并拍照，比较保存后再生植株与对照
植株的条带差异。
１．２．４　数据统计　采用ＤＰＳ软件进行分析。
２　结果与分析
２．１　蔗糖对蝴蝶兰试管苗保存的影响
表１结果表明，随着保存时间的持续，存活率
随蔗糖浓度的增加而降低；培养基中添加低浓度蔗
糖１０ｇ·Ｌ－１，在缓慢生长保存１８个月后仍保持
较高的存活率，达９６．３％，显著高于其他处理，
比ＣＫ６８．８％，提高了２７．５％，而高浓度蔗糖６０～
１００ｇ·Ｌ－１，存活率低于ＣＫ，尤其１００ｇ·Ｌ－１蔗
糖处理组存活率极低，接近全部死亡。说明降低培
养基中的蔗糖浓度具有减缓蝴蝶兰试管苗生长，延
长保存时间的作用，而高浓度蔗糖增加了培养基的
渗透压，使植株吸收水分和养分严重受阻，导致黄
叶死亡。可见，培养基中添加低浓度蔗糖 １０
ｇ·Ｌ－１较适宜蝴蝶兰试管苗的保存。
２．２　甘露醇对蝴蝶兰试管苗保存的影响
甘露醇能够提高培养基渗透压，从而抑制试管
苗的生长。蝴蝶兰试管苗在添加不同浓度甘露醇的
培养基上，随着保存时间的延长，添加一定浓度的
甘露醇对其保存有利，能有效提高其存活率 （表
７７９第１０期 叶秀仙等：蝴蝶兰离体保存及其遗传稳定性研究
２）。在同一保存时间，当甘露醇浓度超过 １５
ｇ·Ｌ－１时，随甘露醇浓度的增加，存活率下降。
保存１８个月时，各处理存活率差异显著，甘露醇
浓度１５ｇ·Ｌ－１、２０ｇ·Ｌ－１时存活率最高，达
８７．５％，比ＣＫ提高了１８．７％，添加３０ｇ·Ｌ－１、
４０ｇ·Ｌ－１高浓度甘露醇的处理，存活率比ＣＫ低，
仅为５９．４％～６５．６％，表现出明显的抑制效应。
因此，适宜蝴蝶兰试管苗保存的甘露醇适宜浓度为
１５ｇ·Ｌ－１。
表１　不同浓度蔗糖对蝴蝶兰试管苗存活率的影响
Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓｕｃｒｏｓｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｏｆ　Ｐ．ａｍａｂｉｌｉｓ　ｓｈｏｏｔｓ
蔗糖／
（ｇ·Ｌ－１）
存活率／％
３个月 ６个月 ９个月 １２个月 １５个月 １８个月
２０（ＣＫ） １００．０ａ １００．０ａ ９３．３ｂ ８０．０ｃ ７５．０ｃ ６８．８ｃ
１０　 １００．０ａ １００．０ａ １００．０ａ １００．０ａ ９６．３ａ ９６．３ａ
４０　 １００．０ａ １００．０ａ ９２．０ｃ ８４．４ｂ ７７．８ｂ ７０．４ｂ
６０　 １００．０ａ ９３．３ｂ ８６．７ｄ ８０．９ｃ ７４．１ｄ ６６．７ｄ
８０　 １００．０ａ ７３．３ｃ ６２．２ｅ ５５．６ｄ ５４．５ｅ ４２．４ｅ
１００　 ９２．９ｂ ６６．７ｄ ４０．０ｆ １３．３ｅ ８．９ｆ ６．７ｆ
注：ＬＳＤ测验，同列不同字母表示Ｐ＜０．０５显著性差异。表２～４同。
表２　不同浓度甘露醇对蝴蝶兰试管苗存活的影响
Ｔａｂｌｅ　２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｍａｎｎｉｔｏｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｏｆ　Ｐ．ａｍａｂｉｌｉｓ　ｓｈｏｏｔｓ
甘露醇／
（ｇ·Ｌ－１）
存活率／％
３个月 ６个月 ９个月 １２个月 １５个月 １８个月
０（ＣＫ） １００．０ａ １００．０ａ ９３．３ｃ ８０．０ｄ ７５．０ｄ ６８．８ｄ
１０　 １００．０ａ １００．０ａ ９５．６ｂ ９１．１ｂ ８４．４ｃ ７８．１ｃ
１５　 １００．０ａ １００．０ａ １００．０ａ １００．０ａ ９３．８ａ ８７．５ａ
２０　 １００．０ａ １００．０ａ １００．０ａ １００．０ａ ９０．６ｂ ８７．５ａ
３０　 １００．０ａ ９６．７ｂ ８９．５ｄ ８３．３ｃ ８４．４ｃ ８１．３ｂ
４０　 １００．０ａ ９６．７ｂ ７７．１ｅ ７２．９ｅ ６８．８ｅ ６５．６ｅ
５０　 ９７．２ｂ ９４．４ｃ ７５．０ｆ ６８．８ｆ ６５．６ｆ ５９．４ｆ
２．３　多效唑 （ＰＰ３３３）对蝴蝶兰试管苗保存的影响
培养基中添加ＰＰ３３３保存蝴蝶兰试管苗，保存
１８个月，各处理存活率差异显著，以培养基中添
加ＰＰ３３３６．０ ｍｇ·Ｌ－１的 处理，存活率最高，达
８０．０％，比ＣＫ提高了１１．２％（表３）；随着保存时间
的延续，添加一定浓度的ＰＰ３３３可提高试管苗存活
率，当ＰＰ３３３浓度８．０ｍｇ·Ｌ－１时，存活率反而低于
ＣＫ，这可能是高浓度ＰＰ３３３产生了毒害作用。
表３　不同浓度ＰＰ３３３对蝴蝶兰试管苗存活率的影响
Ｔａｂｌｅ　３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＰＰ３３３ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｏｆ　Ｐ．ａｍａｂｉｌｉｓ　ｐｌａｎｔｓ
ＰＰ３３３／
（ｍｇ·Ｌ－１）
存活率／％
３个月 ６个月 ９个月 １２个月 １５个月 １８个月
０　 １００．０ａ １００．０ａ ９３．３ｂ ８０．０ｄｅ　 ７５．０ｅ ６８．８ｄ
０．５　 １００．０ａ １００．０ａ ８９．６ｄ ８５．４ｃ ８０．０ｄ ７２．５ｃ
１．０　 １００．０ａ １００．０ａ ９１．７ｃ ８７．５ｃ ８３．３ｃ ７５．０ｂ
２．０　 １００．０ａ １００．０ａ ９３．８ｂ ８７．５ｃ ８５．０ｂ ７５．５ｂ
４．０　 １００．０ａ １００．０ａ ９５．８ａ ９１．７ｂ ８７．５ａ ７９．１ａ
６．０　 １００．０ａ ９８．１ｂ ９５．８ａ ９３．８ａ ８７．５ａ ８０．０ａ
８．０　 １００．０ａ ９５．８ｃ ９１．７ｃ ８３．３ｄ ７２．９ｆ ５８．３ｅ
８７９ 福建农业学报 第２９卷
２．４　保存后的试管苗恢复培养
对以上３种方法保存１８个月的蝴蝶兰试管苗
恢复培养情况进行比较 （表４），在保存期间，试
管苗增殖系数大小依次为甘露醇１５ｇ·Ｌ－１、ＰＰ３３３
６．０ｍｇ·Ｌ－１、蔗糖１０ｇ·Ｌ－１ （图１－Ｂ～Ｄ），培
养基中添加甘露醇１５ｇ·Ｌ－１，保持较高的增殖速
率，增殖系数高达４．１；恢复培养时，３种方法保
存后存活的试管苗均能恢复生长，且生长势强 （图
１－Ｅ）。恢复生长苗进行生根培养，试管苗基部均能
正常发根，根粗壮 （图１－Ｆ）。
表４　不同缓慢生长法保存１８个月的蝴蝶兰试管苗恢复生
长情况
Ｔａｂｌｅ　４　Ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　Ｐ．ａｍａｂｉｌｉｓ　ｓｈｏｏｔｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏｉｎ　１８　ｍｏｎｔｈｓ
ｂｙ　ｍｅａｎｓ　ｏｆ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ
添加物 增殖系数
恢复生长率
／％
蔗糖１０ｇ·Ｌ－１　 １．４ｃ １００．０ａ
甘露醇１５ｇ·Ｌ－１　 ４．１ａ １００．０ａ
ＰＰ３３３６．０ｍｇ·Ｌ－１　 １．８ｂ １００．０ａ
图１　蝴蝶兰试管苗离体保存与恢复生长情况
Ｆｉｇ．１　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐ．ａｍａｂｉｌｉｓ　ｓｈｏｏｔｓ
注：Ａ为保存前的蝴蝶兰试管苗；Ｂ－Ｄ依次为对照与添加蔗糖１０ｇ·Ｌ－１、甘露醇１５ｇ·Ｌ－１、ＰＰ３３３　６．０ｍｇ·Ｌ－１的条件
下保存１８个月后的蝴蝶兰试管苗 （左为对照，右为处理组）；Ｅ为保存后恢复生长的蝴蝶兰试管苗；Ｆ为恢复生长的蝴蝶兰
试管苗生根。
２．５　再生植株遗传稳定性检测
２．５．１　再生植株苗期形态学观察　对保存材料的
再生后代植株与正常生长的试管苗进行生根培养，
当根长２～３ｃｍ，根数２～３条时进行炼苗移栽。
１２个月后，观察结果表明二者在叶形、叶色、叶
长及叶宽等形态学方面均无明显差异 （图２）。
２．５．２　ＲＡＰＤ分子标记检测　应用２００个ＲＡＰＤ
随机引物对保存１８个月材料再生后代进行遗传稳
定性检测。图３为ＲＡＰＤ随机引物Ｓ４８和Ｓ７２扩
增图谱。结果表明，保存材料再生后代的 ＲＡＰＤ
扩增图谱与对照相比没有特异性条带产生，说明保
存材料稳定，没有发生遗传性变异。
图２　蝴蝶兰试管苗移栽１２个月生长情况
Ｆｉｇ．２　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｐ．ａｍａｂｉｌｉｓ　ｓｈｏｏｔｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏｉｎ　１２　ｍｏｎｔｈｓ
注：Ａ为对照植株移栽１２个月生长表现；Ｂ保存后再生植株和
对照植株移栽１２个月生长表现。
９７９第１０期 叶秀仙等：蝴蝶兰离体保存及其遗传稳定性研究
图３　蝴蝶兰试管苗遗传稳定性ＲＡＰＤ检测
Ｆｉｇ．３　ＲＡＰＤ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｐ．ａｍａｂｉｌｉｓ
注：Ｍ为ＤＬ　２０００ｍａｒｋｅｒ；Ａ为引物Ｓ４８；Ｂ为引物Ｓ７２；１为
对照植株；２、３、４依次为培养基中添加蔗糖１０ｇ·Ｌ－１、甘露
醇１５ｇ·Ｌ－１、ＰＰ３３３６．０ｍｇ·Ｌ－１保存后的再生植株。
３　讨论与结论
缓慢生长法保存是近年来新发展且较为有效的
种质保存方法，其最大优点是使保存材料维持不断
生长。影响其保存效果的因素很多，但主要是培养
基组分和培养条件。
在离体种质保存中，蔗糖具有双重作用，不仅
为试管苗的生长发育提供主要碳源，而且作为一种
高渗化合物，起到调节培养基渗透势的作用。本试
验中，蝴蝶兰试管苗在添加１０ｇ·Ｌ－１蔗糖的培养
基中保存效果最好，说明降低培养基中的蔗糖浓度
具有减缓蝴蝶兰试管苗生长，延长保存时间的作
用，这与铁皮石斛［１３］、菊花［２１］等研究结果一致。
而添加高浓度蔗糖 （６０～１００ｇ·Ｌ－１），蔗糖表现
出明显的由作为碳源向渗透物质的过渡，由于培养
基渗透压的提高，使植株吸收养分和水分严重受
阻，导致黄叶枯死严重，说明培养基中添加高浓度
蔗糖对蝴蝶兰试管苗保存不利，这与 “西伯利亚”
百合［１６］的研究结果不一致，其高浓度 （５０～９０
ｇ·Ｌ－１）利于保存。甘露醇作为一种渗透性物质，
对试管苗的保存效果及适宜浓度，依植物种类而
异。本试验中，培养基中添加１５ｇ·Ｌ－１甘露醇对
蝴蝶兰试管苗保存效果较好，且维持较高的增殖速
率，增 殖 系 数 ４．１。甘 露 醇 对 “蜜 糖”文 心
兰［１０－１１］ “神马”菊花［２０］、 “黄秀芳”菊花［２１］、淡
黄花百合［１７］等花卉种质离体保存具有效果，而在
“西伯利亚”百合［１６］试管苗离体保存中没有起到明
显的限制生长作用，这可能是不同植物对抵抗渗透
胁迫的能力差异所致。ＰＰ３３３是一种生长延缓剂，
延缓细胞的分裂和生长，对植物的营养生长也有较
强抑制作用。本试验结果表明，在培养基中添加
６．０ｍｇ·Ｌ－１　ＰＰ３３３对蝴蝶兰试管苗保存具有效果，
而浓度过高则容易产生毒害作用，存活率反而降
低。这与ＰＰ３３３对草莓［２４］、甘薯［２５］和葡萄［２６］的保
存效果一致。
种质资源离体保存的目的在于最大限度地保持
其遗传稳定性，保存方法适用与否，关键取决于能
否保持原种质的种性。本研究在特定的培养条件
下，通过改变培养基组分，建立了缓慢生长法保存
蝴蝶兰种质的离体保存技术，并从形态学和分子水
平上综合检测了保存材料再生后代的遗传稳定性，
表明其试管苗在缓慢生长保存过程中未发生遗传变
异，这与多数研究结果一致［２０－２１，２７］，表明该保存
方法可适用于蝴蝶兰种质资源的离体保存，这对蝴
蝶兰品种保存、开发利用具有现实意义，对其他兰
花品种保存研究也有参考价值。
缓慢生长法保存除利用调节蔗糖浓度与添加甘
露醇、ＰＰ３３３等措施外，还可以与低温、降低光照
强度等处理结合，因此，可通过采取综合措施进一
步开展蝴蝶兰缓慢生长离体保存研究，以期为进一
步延长保存期限，提高保存质量提供理论依据。此
外，对保存材料再生后代遗传稳定性的进一步评价
还有待于后期田间形态学跟踪观察以及应用其他多
种检测方法对其遗传稳定性进行鉴定。
参考文献：
［１］刘荣维，梅庆超．丛生芽—蝴蝶兰无性快速繁殖的新途径 ［Ｊ］．
热带作物学报，１９９３，１４ （２）：１０５－１０７．
［２］马子俊．蝴蝶兰工厂化生产技术研究 ［Ｊ］．浙江林学院学报，
１９９８，１５ （２）：１９２－１９６．
［３］秦贺兰，孙红梅．蝴蝶兰研究进展 ［Ｊ］．河南职业技术师范学
院学报，２００２，（２）：３１－３５．
［４］赵九洲，陈杰敏．基质与氮磷钾比例对蝴蝶兰生长的影响 ［Ｊ］．
园艺学报，２０００，２７ （５）：３８３－３８４．
［５］王玲．蝴蝶兰胚珠发育基因的表达及序列分析 ［Ｊ］．植物学报，
１９９９，４１ （２）：２７６－２７９．
［６］谢永样，许聪耀，黄鹏林．应用基因枪法于蝴蝶兰基因转殖之
研究 ［Ｊ］．中国园艺，１９９５，４１ （３）：１７４－１８５．
［７］许华欣，黄鹏林．蝴蝶兰苯基苯乙烯酮合成酶ｃＤＮＡ之选殖及
分析 ［Ｊ］．中国园艺，１９９９，４５ （１）：９－３５．
［８］印芳，葛 红，彭克勤，等．蝴蝶兰组培褐变与酚酸类物质及相
关酶活 性 的 关 系 ［Ｊ］．中 国 农 业 科 学，２００８，４１ （７）：
２１９７－２２０３．
［９］王海平，李锡香，沈镝，等．离体保存技术在无性繁殖蔬菜种
质资源保存中的应用 ［Ｊ］．植物遗传资源学报，２０１０，１１ （１）：
５２－５６．
［１０］ＭＡＬＡＵＲＩＥ　Ｂ，ＭＡＲＩＥ　Ｆ　Ｔ，ＢＥＲＴＨ　ＡＵＤ　Ｊ，ｅｔ　ａ．ｌ
Ｍｅｄｉｕｍ－ｔｅｒｍ　ａｎｄ　ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓａｆｅ
ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ｙａｍ （Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ　ｓｐｐ．）ｇｅｒｍｐｌａｓｍ
［Ｊ］．Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｊ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ，１９９８，１ （３）：１－１５．
０８９ 福建农业学报 第２９卷
［１１］叶秀仙，黄敏玲，吴建设，等．甘露醇和生长抑制剂对文心
兰离体保存的影响 ［Ｊ］．福建农业学报，２０１１， （１）：
１４０－１４５．
［１２］叶秀仙，黄敏玲，钟淮钦，等．文心兰离体再生体系建立及试
管苗种质保存研究 ［Ｃ］／／中国观赏园艺研究进展，北京：
中国林业出版社，２００９：９３－１９７．
［１３］史永忠，潘瑞炽，王小青，等．铁皮石斛种质资源的低温离体
培养 ［Ｊ］．应用与环境学报，２０００，（４）：３２６－３３０．
［１４］罗远华，许奕，陈彩丽，等．多花脆兰非共生萌发和离体保存
的初步研究 ［Ｊ］．福建农业科技，２００８，（５）：７５－７６．
［１５］辛淑英，谢欣．甘露醇浓度对百合种质离体保存的影响 ［Ｊ］．
作物品种资源，１９９５，（３）：５０－５２．
［１６］陈辉，陈晓玲，陈龙清，等．百合种质资源限制生长保存研究
［Ｊ］．园艺学报，２００６，（４）：７８９－７９３．
［１７］李黛，曾艳玲，魏福伦．淡黄花百合的离体保存 ［Ｊ］．贵阳学
院学报，２００６，（３）：４５－４７．
［１８］张晓宁，陈晓玲，卢新雄，等．香石竹种质离体保存研究进展
［Ｊ］．植物遗传资源学报，２０１２，１３ （２）：２８８－２９２，２９８．
［１９］ＤＥＲＥＵＤＤＲＥ　Ｊ，ＴＡＮＮＯＵＲＹ　Ｍ．Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｏｆ　ｃａｒｎａｔｉｏｎ （Ｄｉａｎｔｈｕｓ　ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ　Ｌ．）［Ｊ］．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ａｇｒ　Ｆｏｒ，Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　Ｉ，
１９９５，３２：４５９－４７５．
［２０］王艳芳，房伟民，陈发棣，等．‘神马’菊花的离体保存及遗
传稳定性 ［Ｊ］．西北植物学报，２００，７ （７）：１３４１－１３４８．
［２１］陈青瑛，兰贺胜，陈景耀．菊花种质离体保存研究 ［Ｊ］．西南
农业大学学报，１９９８，（１２）：６３８－７６３９．
［２２］李军，许大熊，张秀珊，等．蝴蝶兰种质资源保存技术研究初
探 ［Ｊ］．广东农业科学，２０１０，（７）：６９－７２．
［２３］肖军，杨立国，杨涛，等．两种提取菊花总ＤＮＡ的方法比较
［Ｊ］．辽宁农业科学，２００５，（１）：４０－４１．
［２４］赵密珍，刁曼妮，钱亚明，等．多效唑对草莓种质离体保存的
影响 ［Ｊ］．植物遗传资源学报，２００３，４ （３）：２４２－２４４．
［２５］张希太．应用多效唑常温保存甘薯试管种质的研究 ［Ｊ］．中国
生态农业学报，２００３，１１ （１）：４１－４３．
［２６］朱金英，高凤菊，戴忠民，等．多效唑对葡萄组培幼苗生长发
育的影响 ［Ｊ］．中国果树，２００２，（６）：２５－２６．
［２７］艾鹏飞，罗正荣．柿和君迁子试管苗缓慢生长法保存及其遗
传稳定性研究 ［Ｊ］．园艺学报，２００４，（４）：４４１－４４６．
（责任编辑：柯文辉）
１８９第１０期 叶秀仙等：蝴蝶兰离体保存及其遗传稳定性研究