全 文 ：离体保存对野生毛葡萄试管苗生长
及叶片抗氧化酶活性的影响
潘学军 1，2，李 霞 1，2，张文娥 2
（1贵州省果树工程技术研究中心·2贵州大学农学院，贵阳 550025）
摘 要: 【目的】为阐明缓慢生长法离体保存野生毛葡萄试管苗的机制，【方法】以野生毛葡萄‘花溪-9’为试材，利用
缓慢生长法成功离体保存了供试材料试管苗， 并从叶片解剖结构和生理生化变化 2 个方面阐述了毛葡萄试管苗离
体保存存活率与叶片结构和抗氧化酶活性间的关系。 【结果】温度、光照和烯效唑（S3307）对野生毛葡萄离体保存效
果均有影响，其影响顺序为 S3307>温度>光照，且 3 因素两两之间互作效应明显。 野生毛葡萄在低温（10±2）℃、光照
10 μmol·m-2·s-1（12 h·d-1）和添加 0.1 mg·L-1 S3307的 1/2MS+0.05 mg·L-1 IBA+0.1 mg·L-1 IAA+ 3%蔗糖+0.5%琼脂粉的
培养基上保存效果良好，存活率可达 86.33%。 离体保存存活率较高的试管苗叶绿素含量和膜质过氧化产物 MDA 含
量较低，保护酶（SOD、CAT、POD）活性强，渗透调节物质可溶性蛋白含量高，叶肉细胞的紧密度提高，单位面积内细
胞数量增多。 【结论】适宜的离体保存方法增加了毛葡萄叶肉细胞的紧密度，提高了试管苗的抗氧化能力，这可能是
缓慢生长法离体保存成功的重要机制之一。
关键词: 毛葡萄； 缓慢生长法； 生理响应； 结构变化； 种质保存
中图分类号：S663．1 文献标志码：A 文章编号：1009－9980(2013)04－0615－06
Effect of conservation in vitro on the growth and leaf antioxidant enzyme
activities of Vitis heyneana
PAN Xue-jun1，2， LI Xia1，2， ZHANG Wen-e2
（1Guizhou Engineering Research Center for Fruit Crops， 2Agriculture College of Guizhou University， Guiyang，Guizhou 550025 China)
Abstract: 【Objective】In order to clarify the mechanism of in vitro conservation for Vitis heyneana by
slowing growth， 【Method】the Vitis heyneana ‘Huaxi-9’ conserved successfully by slowing growth was as
material to explore the relations between conservation viability and leaf anatomical structure and antioxi-
dant enzymes. 【Result】 Temperature， light and uniconazole（S3307）all affected in vitro conservation， the
effect of S3307 was the greatest， followed by temperature， and that of light was the smallest. There were
significant interaction effect between every two variables. 86.33% of in vitro shoots conserved on 1/2MS
supplemented with 0.05 mg·L-1 IBA， 0.1 mg·L-1 IAA， 3% sucrose and 0.5% agar， added with 0.1 mg·L-1
S3307 for 10 months at (10±1) ℃ and 10 μmol·m-2·s-1 (12 h photoperiod) maintained viability. Lower
chlorophyll and MDA content and higher protective enzyme (SOD， CAT and POD) activity and soluble
protein content were observed on the explant leaves which has high conservation viability. Compared to
control， the optimum conservation condition increased cell density and cell number of leaf tissue. 【Con-
clusion】Increases of cell density and antioxidant activity under appropriate conservation conditions may be
the most important mechanism for success of Vitis heyneana conservation in vitro by slowing growth.
Key words: Vitis heyneana Roem. & Schult； Slow growth； Physiological response； Structure change；
Germplasm conservation
种质资源是物种进化、 遗传学研究及育种工作 的物质基础， 随着人类生产实践活动的不断深入和
收稿日期： 2013－01－16 接受日期: 2013－04－18
基金项目： 贵州省优秀青年科技人才培养对象专项资金(黔科合人字[2009]02 号)
作者简介： 潘学军，男，教授，博士，硕士生导师，主要从事果树种质资源与生物技术育种。 Tel: 0851-3853009，E-mail: pxjun2050@aliyun.
com
果 树 学 报 2013，30（4）: 615～620
Journal of Fruit Science
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2013.04.025
果 树 学 报 30 卷
表 1 S3307浓度及培养的光温条件
Table 1 S3307 concentration and culture conditions of light
intensity and temperature
处理
Treatment
光照强度
Light intensity/(μmol·m-2·s-1）
S3307
/(mg·L-1)
温度
Temperature/℃
T0
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
40
10
10
10
20
20
20
30
30
30
0.0
0.1
1.0
2.0
0.1
1.0
2.0
0.1
1.0
2.0
25
10
25
25
25
25
10
25
10
25
气候的异常变化，大量资源遭到了破坏，甚至灭绝，
种质资源保护已成为一项世界性课题[1-5]。 田间种植
保存费用高，且仍面临着资源损失的危险；种子库保
存则对有性繁殖困难的果树资源无能为力[5]。自离体
保存策略 [6-7]提出以来，该项技术受到了果树科学工
作者的高度重视， 已成功应用到多种果树种质资源
的保存中[8-12]。目前关于果树种质资源离体保存研究
主要集中在保存方法的探索、 改良及遗传稳定性检
测方面[12-18]，较少见到离体保存过程中保存材料的生
理机制变化方面的研究， 而探讨离体保存材料的生
理变化机制与离体保存条件的关系， 可深入了解离
体保存的机制，有针对性地调整保存条件，增强方法
探索中的针对性。 本文以中国野生毛葡萄优株 ‘花
溪-9’为试材，研究了不同离体保存条件下‘花溪-
9’保存 10个月后的相关形态和生理指标变化，并探
讨了离体保存存活率和各项指标间的关系， 以期探
讨野生毛葡萄离体保存过程中生理响应机制， 为野
生毛葡萄离体保存提供科学的方法； 并为探讨果树
资源离体保存机制提供依据。
1 材料和方法
1.1 材料
以野生毛葡萄（Vitis heyneana Roem. & Schult ）
优株‘花溪-9’离体快速繁殖的组培苗为试材。 试验
于 2009—2010 年在贵州省果树工程技术研究中心
进行。
1.2 试验设计与离体保存保存方法
以 1/2MS（大量元素减半）+0.05 mg·L-1 IBA+0.1
mg·L-1 IAA+3%蔗糖+0.5%琼脂粉为基本培养基，生
长抑制条件烯效唑（S3307）浓度及光温条件设计如表
1所示。 取高约 1 cm 的健壮一致的‘花溪-9’带顶芽
的茎段， 接种到添加不同浓度 S3307的 50 mL 培养基
上离体保存， 容器为型号 100 mL的玻璃三角瓶，封
口膜上透气膜面积 113.10 mm2， 每个处理设 3 次重
复，每重复 6 瓶，每瓶接种 3 个茎段，按照试验设计
条件进行培养，每天光照 12 h。对照（T0）的光照强度
为 40 μmol·m-2·s-1， 培养温度 25 ℃，2 个月继代 1
次。
1.3 离体保存植株的生长及生理指标测定
离体培养 10 个月后，观察记录叶片颜色、根系
粗壮度及长势情况；统计植株存活率、植株节数、叶
片数； 用游标卡尺和叶面积测定仪分别测定植株高
度和叶面积。 叶绿素含量采用 Arnon [19]的方法（提取
液为体积比 1∶1的丙酮、乙醇混合液）测定。取不同处
理保存的植株幼嫩叶片 0.2 g， 加 3 mL 50 mmol·L-1
的磷酸缓冲液 （pH 7.8， 含 1 mmol·L-1 EDTA，2%
PVP） 冰浴研磨至匀浆，12 000 r·min-1，4 ℃离心 20
min，上清液用于超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢
酶（CAT）、过氧化物酶活性（POD）和丙二醛（MDA）
含量测定。 SOD活性测定采用 NBT（氮蓝四唑）光还
原法，POD 采用愈创木酚法，CAT 采用紫外吸收法，
MDA含量采用硫代巴比妥酸法。酶活性和丙二醛含
量测定均参照高俊凤[20]的方法。以 T0的试管苗为对
照。
1.4 叶片解剖结构观察
选取保存效果最好的叶片进行解剖结构观察，
以 T0 为对照。 剪取叶柄上方 1 cm 处长约 5 mm 叶
片小块，立即放入 FAA 溶液中固定；采用常规制片
法制片，在 Olympus 光学显微镜下观察，并用 Motic
Image Advances3.2 软件采集图片并测量单位面积栅
栏组织和海绵组织细胞个数。 30次重复。
1.5 数据统计与分析
采用 SAS 分析软件进行多因素方差分析和相
关性分析。
2 结果与分析
2.1 离体保存对毛葡萄存活率及植株生长状况的
影响
离体保存效果的好坏取决于离体保存时间的长
短和保存存活率的高低。离体保存条件下，植株存活
率高，生长相对缓慢，保存时间较长，则适合该物种
离体保存。由表 2可见，与对照相比，离体保存 10个
月后，毛葡萄的存活率不同程度的下降，但不同方法
间差异很大， 其存活率高低顺序为 T1>T4>T2>T6>
T7>T8>T5>T3>T9。 结合植株生长情况来看 （图版-
T0~T9），在 T1 保存条件下，保存存活率最高，且植
株生长相对缓慢，保存效果最优；其次是 T2、T4 和
616
4 期 潘学军等: 离体保存对野生毛葡萄试管苗生长及叶片抗氧化酶活性的影响
图 2 离体保存对试管苗 MDA 含量的影响
Fig. 2 Effect of conservation in vitro on leaf
MDA content of tube seedling
表 2 离体保存对试管苗存活率及生长的影响
Table 2 Effect of conservation in vitro on survival rate and growth of tube seedling
处理
Treatments
植株存活率
Survival rate/%
株高
Plant height/cm
节数
Node number
叶片数
Leaf number
叶面积
Leaf area/mm2
叶色
Leaf color
长势
Growth vigor
根系
Root
T0
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
100.00 a
86.33 b
75.78 c
62.67 g
84.44 b
67.78 f
74.44 cd
72.22 de
69.44 ef
49.44 h
9.86
5.47
7.43
5.70
7.40
6.43
4.40
7.67
4.63
6.47
9.46
5.78
8.80
7.17
9.17
7.60
5.17
8.27
5.27
8.55
15.22
6.33
10.33
14.33
10.67
11.33
5.67
10.33
6.67
6.67
600.33
450.67
374.67
278.67
560.67
351.67
284.67
574.67
337.33
292.67
绿色 Green
浅绿 Light green
绿色 Green
深绿 Deep green
绿色 Green
深绿 Deep green
浅绿 Green
绿色 Green
浅绿 Light green
深绿 Deep green
强 Vigor
较弱 Weak
强 Vigor
强 Vigor
强 Vigor
强 Vigor
较弱 Weak
强 Vigor
较弱 Weak
强 Vigor
健壮 Robust
较弱 Weak
较弱 Weak
健壮 Robust
较弱 Weak
健壮 Robust
较弱 Weak
健壮 Robust
较弱 Weak
健壮 Robust
注:小写字母表示 5%水平显著。 下同。
Note: The small letter represents significant differences at 5% level. The same below.














        
叶
绿
素
含
量
Ch
lc
on
te
nt
/(m
g·
kg
-1
)
保存方法 Conservation method
T7，但 3 者的长势略强；尽管 T8 的存活率略低，但
在此条件下，毛葡萄生长较为缓慢，也可用于毛葡萄
的离体保存。 多因素分析表明，光照、温度及生长抑
制剂 S3307对野生毛葡萄存活率和生长势均有显著
的影响，且不同的因素间互作效应显著；3 个影响因
素中 S3307的影响最为明显，其次是温度，光照的影
响相对较小（结果未列出）。
2.2 毛葡萄离体保存对生理特性的影响
2.2.1 离体保存条件下毛葡萄叶绿素含量变化 在
光合作用过程中， 叶绿素主要起能量接受和转换作
用，其含量的变化预示着叶片捕获、转化光能的能力
发生了改变，最终导致光合代谢变化。 与对照相比，
离体保存降低了毛葡萄叶绿素含量（图 1），其中 T1
保存条件下，叶绿素含量最低，降低幅度最大；其次
是 T4 和 T7， 叶绿素含量也较低。 结合表 2 可以看
出，存活率较高的保存方法，其叶绿素含量降低幅度
较大。由此可见，叶绿素含量的大幅下降可导致毛葡
萄光合作用降低，代谢减慢，从而达到了离体保存的
目的。
2.2.2 离体保存条件下毛葡萄叶片丙二醛含量变化
由图 2 可见，不同的离体保存条件下毛葡萄叶片
内 MDA含量差异很大。与对照相比，T1、T2、T8保存
条件下，叶片 MDA 含量有所降低，而其他 6 个保存
条件下叶片内 MDA 含量不同程度的上升，其中 T3、
T9 条件下， 叶片 MDA 含量升高幅度最大。 尽管
MDA 含量高低与离体保存存活率并非一一对等关
系，但是，存活率较高的保存方法 ，如 T1，其叶片
MDA含量较低；保存效果较差的方法，叶片 MDA 含
量也较高，如 T3、T9。
2.2.3 离体保存条件下毛葡萄叶片保护酶活性变化
由图 3 可知，与对照相比，离体保存既可提高野
生毛葡萄叶片内 SOD 活性， 也可降低其活性。 T1、
T4、T7 和 T8 处理提高了 SOD 活性， 而 T2、T3、T5、
T6 、T9 处理下 SOD 活性降低。 与 SOD 活性变化规
律不同， 除 T1 保存条件下，CAT 活性略有升高外，
其他 8 种离体保存方法均不同程度的降低了 CAT
活性（图 4）。 POD 活性的变化规律则基本与 SOD 相
同（图 5），T1、T4、T7 和 T8 处理下，POD 活性高于对
照， 而 T2、T3、T5、T6 、T9 处理降低了 POD 活性；其
活性高低顺序为 T1>T7>T4>T8>T2>T5>T6>T3>T9。
2.2.4 离体保存条件下毛葡萄叶片可溶性蛋白含量
图 1 离体保存对试管苗叶绿素含量的影响
Fig. 1 Effect of conservation in vitro on leaf
Chl. content of tube seedling









        
M
DA
含
量
M
DA
co
nt
en
t/(
nm
ol·
g-
1 )
保存方法 Conservation method
617
果 树 学 报 30 卷
表 4 存活率与生理指标间的相关系数
Table 4 Correlation coefficient between stress concentration and photosynthesis characters
Chl. SOD CAT POD MDA Pr.
SOD
CAT
POD
MDA
Pr.
存活率 Survival rate
-0.650*
-0.190
-0.581
-0.005
-0.651*
-0.184
0.430
0.968**
-0.469
0.982**
0.700*
0.524
-0.069
0.481
0.663*
-0.477
0.983**
0.752*
-0.468
-0.476 0.692*
注: * 表示 5%水平显著，** 表示 1%水平显著。
Note: The**and* represent significant differences at 1% and 5% level，respectively.
表 3 离体保存对叶片厚度及细胞数目的影响
Table 3 Effect of conservation in vitro on leaf thickness and cell number
处理
Treatments
叶片厚度
Leaf thickness
/μm
栅栏组织厚度
Stockade tissue thickness
/μm
海绵组织厚度
Sponge tissue thickness
/μm
栅栏细胞数目
Stockade cell number
/100 μm2
海绵细胞数目
Sponge cell number
/100 μm2
T1
T0
127.50 a
116.25 b
42.92 a
41.25 b
61.25 a
57.29 b
19.33 a
16.92 b
48.75 a
43.39 b
图 4 离体保存对试管苗 CAT 活性的影响
Fig. 4 Effect of conservation in vitro on leaf
CAT activity of tube seedling
图 5 离体保存对试管苗 POD 活性的影响
Fig. 5 Effect of conservation in vitro on leaf POD activity of
tube seedling
图 6 离体保存对试管苗蛋白质含量的影响
Fig. 6 Effect of conservation in vitro on leaf protein
content of tube seedling












        
SO
D
活
性
SO
D
ac
tiv
ity
/(U
·
g-
1 ·
m
in
-1
)
保存方法 Conservation method






















        
CA
T
活
性
CA
T
ac
tiv
ity
/(U
·
g-
1 ·
m
in
-1
)
保存方法 Conservation method













        
PO
D
活
性
PO
D
ac
tiv
ity
/(U
·
g-
1 ·
m
in
-1
)
保存方法 Conservation method















       可
溶
性
蛋
白
质
含
量
So
lu
bl
e
pr
ot
ei
n
co
nt
en
t/(
μg
·
g-
1 )
保存方法 Conservation method
变化 可溶性蛋白作为重要的渗透调节物质， 在植
物衰老生理和抗性生理中起着重要作用。 离体保存
方法可改变毛葡萄叶片可溶性蛋白含量 （图 6），与
对照相比，T1、T4、T7 和 T8 处理提高了毛葡萄叶片
可溶性蛋白质含量， 而 T2、T3、T5、T6 、T9 则降低了
毛葡萄叶片可溶性蛋白质含量。
2.3 离体保存对毛葡萄叶片解剖结构的影响
以 T0 试管苗为对照，选离体保存存活率最高，
生长势相对缓慢的 T1 保存条件下的试管苗叶片进
行了解剖结构观察。 与对照相比，离体保存下叶肉
细胞（栅栏组织和海绵组织）更加紧密（图版-T0-
A，T1-A），单位面积内细胞数量增多（表 3）；方差
分析表明，叶片厚度、栅栏组织厚度和海绵组织厚
度均明显高于对照，单位面积内叶肉细胞也明显多
于对照。
2.4 离体保存存活率与生理指标间的相关性分析
由表 4可见， 离体保存存活率与叶绿素含量和
MDA 含量呈负相关关系， 但均未达到显著性水平，
图 3 离体保存对试管苗 SOD 活性的影响
Fig. 3 Effect of conservation in vitro on leaf
SOD activity of tube seedling
618
4 期 潘学军等: 离体保存对野生毛葡萄试管苗生长及叶片抗氧化酶活性的影响
说明叶绿素、MDA 含量较低的情况下， 存活率有升
高的趋势，但二者间相关性不强。存活率与叶片内保
护性酶（SOD、POD、CAT）活性和可溶性蛋白质含量
均呈显著正相关关系，说明叶片内保护酶活性越强，
可溶性蛋白含量越高， 存活率越高。 而 SOD、POD、
CAT 活性和可溶性蛋白含量两两之间均表现极显
著正相关关系，叶绿素含量与 SOD 活性和可溶性蛋
白含量显著负相关，表明离体保存条件下，毛葡萄叶
片 SOD、POD、CAT活性和可溶性蛋白含量 4者之间
高度正向协同变化。而绿叶素含量与 SOD活性和可
溶性蛋白含量则高度负协同变化。
3 讨 论
缓慢生长保存是一种中期保存方法， 影响保存
效果的因素很多，但主要是培养条件（光照和温度）
和培养基组分[21-24]。 本研究发现，在低温（10±2）℃和
光照 10 μmol·m-2·s-1（12 h·d-1）条件下，毛葡萄带顶
芽的茎段接种到添加 0.1 mg·L-1 S3307 的 1/2MS+0.05
mg·L-1 IBA+0.1 mg·L-1 IAA+ 3%蔗糖+0.5%琼脂粉的
培养基上不需继代保存 10 个月 ， 存活率可达
86.33%。 多因素分析表明光照、温度及生长抑制剂
S3307 对野生毛葡萄存活率和生长势均有显著的影
响，这与前人的研究结果相一致[12，14-15，17]。不同的因素
间互作效应显著，3 个影响因素中 S3307 的效果最为
明显，其次是温度，光照的影响相对较小。
离体保存过程中，低浓度（0.1 mg·L-1）植物生长
延缓剂（烯效唑）可有效减缓毛葡萄试管苗生长，利
于离体保存，而高浓度烯效唑（1.0~2.0 mg·L-1）对毛
葡萄试管苗生长存在毒害作用，不利于离体保存，这
与李朝周等 [14]对葡萄栽培品种的保存浓度有所差
异； 低温条件下叶绿素和蛋白质合成代谢过程中部
分酶活性受到一定程度的抑制， 叶绿素和蛋白质合
成速率降低， 导致叶绿素含量的降低和生长速率的
减缓；组培条件下，试管苗生长主要依靠异养条件，
但自养能力同样存在， 光照条件的减弱进一步抑制
了试管苗的光合作用， 从而进一步延缓了试管苗的
生长，延长保存时间[17]，因此低温和弱光也是毛葡萄
试管苗离体保存的可行途径。
对于果树种质资源离体保存研究多集中在保存
方法的优化和遗传稳定性检测上 [11-12，18]，果树种质保
存过程中生理代谢及细胞组织结构变化方面的研究
相对较少， 也未见离体保存影响因素与生理指标的
关系研究。本试验发现，与对照相比，离体保存 10个
月后的野生毛葡萄生理状态发生了改变， 存活率较
高的配方（如 T1）下的试管苗叶绿素含量和膜质过
氧化产物 MDA 含量较低，保护酶（SOD、CAT、POD）
活性强，渗透调节物质可溶性蛋白含量高；反之，存
活率较低的离体保存条件下（如 T9）的试管苗叶绿
素含量和 MDA 含量较高，保护酶活性弱，渗透调节
物质可溶性蛋白含量低。
离体保存存活率与叶绿素含量、MDA 含量呈负
相关关系，但相关系数未达显著水平，而与保护酶活
性和可溶性蛋白含量呈显著正相关关系。 说明离体
保存条件下，叶片生理状态影响离体保存效果，离体
保存过程中，叶绿素含量的适度降低，可减弱光合代
谢，利于离体保存；而保护酶活性和可溶性蛋白含量
的升高，可有效抑制活性氧产生，使膜质过氧化产物
MDA 维持在较低的水平，从而提高了离体保存存活
率。 这与膜质过氧化水平低和保护酶活性高有利于
种子保存的结论相一致[25-26]。本研究还发现离体保存
条件下，试管苗叶肉细胞的紧密度发生了改变，单位
面积内细胞数量增多， 由此推断这种细胞结构上的
变化可提高试管苗的抗逆性，利于离体保存。
本研究中仅研究了野生毛葡萄‘花溪-9’离体保
存下的组织结构及生理响应， 不同基因型果树离体
保存条件差异很大， 离体保存条件下其他果树的生
理和形态响应机制需进一步探讨。
4 结 论
野生毛葡萄在低温（10±2）℃、光照 10μmol·m-2·s-1
（12 h·d-1） 和添加 0.1 mg·L-1 S3307 的 1/2MS+0.05
mg·L-1 IBA+0.1 mg·L-1 IAA+3%蔗糖+0.5%琼脂粉的
培养基上保存效果好，存活率可达 86.33%。 适宜的
离体保存方法增加了野生毛葡萄叶肉细胞的紧密
度，提高了试管苗的抗氧化能力，这可能是缓慢生长
法离体保存成功的重要机制之一。 （本文图版见封
底）
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果 树 学 报 30 卷620