全 文 ：江苏农业学报(Jiangsu J． of Agr． Sci．) ，2012，28(6) :1386 ～ 1391
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崔莉莉，钟小仙，沈益新，等． 秋水仙碱诱导的苏丹草与拟高粱杂交种新材料倍性鉴定［J］．江苏农业学报，2012，28(6):1386-1391．
秋水仙碱诱导的苏丹草与拟高粱杂交种新材料倍性鉴定
崔莉莉1，2， 钟小仙2， 沈益新1， 吴娟子2， 刘智微2
(1．南京农业大学动物科技学院草业科学系，江苏 南京 210095;2．江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京 210014)
收稿日期:2012-06-19
基金项目:江苏省科技支撑计划项目(BE2010308)
作者简介:崔莉莉(1987-) ，女，山东潍坊人，硕士研究生，研究方向为
牧草育种。(E-mail)sdaucll@ 163． com
通讯作者:钟小仙，(E-mail)zhpansy@ yahoo． com． cn
摘要: 以苏丹草 2098 与拟高粱杂交种 F1(对照)及秋水仙碱处理的苏丹草与拟高粱杂交种胚性愈伤组织获
得的再生植株 SS2010-1 为材料，通过苗期植株形态学特征观察，结合根尖细胞染色体计数和流式细胞仪对再生植
株 SS2010-1 进行倍性鉴定，并对其叶片表皮气孔器特性进行分析。结果显示:与对照相比，SS2010-1 株高和叶长分
别增加 63. 55%和 56. 12%(P ＜ 0. 05) ，叶片宽度增加 6. 76%(P ＞ 0. 05) ;SS2010-1 细胞核 DNA含量是对照的 2 倍，
另外，根尖细胞染色体数目为 2n = 40，为对照染色体数目(2n = 20)的 2 倍，表明秋水仙素诱导获得的再生植株
SS2010-1 为加倍的四倍体新材料。与对照相比，SS2010-1 叶片上表皮 1 mm2 气孔器数目减少 64. 39%(P ＜ 0. 05) ，
气孔器长度和宽度分别增加 29. 33%和 15. 99%(P ＜ 0. 05) ，保卫细胞宽度增加 18. 66%(P ＜ 0. 05) ;叶片下表皮气
孔器密度减少 39. 09%(P ＜ 0. 05) ，气孔器长度和宽度分别增加 23. 24%和 26. 19%(P ＜ 0. 05) ，保卫细胞宽度增加
3. 74%(P ＞ 0. 05)。
关键词: 苏丹草;四倍体;染色体;流式细胞术;气孔器特性
中图分类号: S567． 21 + 9 文献标识码: A 文章编号: 1000-4440(2012)06-1386-06
Ploidy identification of hybrid of Sorghum sudanense (Piper)Stapf． ×
S． propinquum(Kunth)Hitchc．
CUI Li-li1，2， ZHONG Xiao-xian2， SHEN Yi-xin1， WU Juan-zi2， LIU Zhi-wei2
(1． Department of Grass Science，College of Animal Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China;2． Institute of Live-
stock，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China)
Abstract: Interspecific hybrid(CK)of Sorghum sudanense(Piper)Stapf． × Sorghum propinquum(Kunth)Hitchc．
and SS2010-1 regenerated from F1 embryonic callus treated by colchicine were used as experimental materials． Ploidy deter-
mination of SS2010-1 was conducted by seedling morphological characteristics analysis，chromosome number counting，and
flow cytometry analysis，and the leaf stomatal apparatus characteristics of the materials were studied． Compared to those of
CK，the plant height and leaf length of SS2010-1 were increased by 63． 55% (P ＜ 0. 05)and 56． 12%(P ＜ 0. 05) ，respec-
tively，and the leaf width of SS2010-1 was 6． 76% wider (P ＞ 0. 05)． The nuclear DNA contents in SS2010-1 were twice
as much as that of CK，and the chromosome number of SS2010-1(2n = 40)was two times as much as that of CK (2n =
20)． The results above indicated that the new material SS2010-1 was a tetraploidy． Compared to those of CK，the stomatal
apparatus density in upper epidermis of SS2010-1 was decreased by 64． 39% (P ＜ 0. 05) ，the stomatal apparatus length
and width were increased by 29． 33% (P ＜ 0. 05)and 15． 99% (P ＜ 0. 05) ，respectively，and the guard cell width was
increased by 18． 66% (P ＜ 0. 05)． The stomatal apparatus density in lower epidermis of SS2010-1 was decreased by 39．
09% (P ＜ 0. 05) ，the stomatal apparatus length and width were increased by 23． 24% (P ＜ 0. 05)and 26． 19% (P ＜
0. 05) ，respectively， and the guard cell width was
increased by 3. 74%(P ＞ 0. 05)．
Key words: Sorghum sudanense(Piper)Stapf．;
tetraploidy;chromosome;flow cytometry;stomatal appa-
ratus characteristic
6831
苏丹草［Sorghum sudanense(Piper)Stapf．］为
禾本科(Poaceae)高粱属(Sorghum)一年生牧草，
具有产草量高、耐贫瘠、抗干旱、耐刈割、再生性能
强等特点，在世界各地均有栽培，是中国南方最主
要的暖季型禾本科牧草［1-2］。近年来，随着矿物能
源的紧缺和全球气候变暖，禾草类植物作为生物
质能源植物的利用正逐渐受到重视。已有研究结
果表明，苏丹草是一种优良的能源禾草，其单位质
量的沼气产量高于玉米［3-4］，在欧洲，1 hm2 苏丹草
可发酵产生2 130 ～ 6 060 m2 的甲烷［5］;但苏丹草
在生长期常遇高温高湿天气，叶斑病发生严重，明
显影响草产量和质量［6］。拟高粱(Sorghum propin-
quum(Kunth)Hitchc．)为高粱属多年生牧草，对叶
斑病抗性强［7］，通过花期调节，可与苏丹草杂交获
得抗病性强、综合农艺性状优良的远缘杂交种
F1
［8-9］。江苏省农业科学院畜牧研究所近年来对
苏丹草与拟高粱远缘杂交高世代品系的研究结果
表明，自 F2代开始抗病性分离，种子颜色、千粒
重、成熟期和株高等性状亦分离严重。用秋水仙
素处理胚性愈伤组织、诱导 F1代染色体加倍，是加
速杂交种后代快速稳定、固定杂种优势的有效途
径［10］。近年来远缘杂交与异源多倍化相结合的技
术不仅在理论上日趋完善，而且在水稻和小麦等
农作物育种上得到了广泛的应用［11］。蔡得田
等［12］指出利用远缘杂交和多倍体双重优势进行超
级稻育种将会带来新的绿色革命。颜辉煌等［13］获
得的栽培稻-紧穗野生稻双二倍体自交后代植株形
态相似，生长基本一致，消除了性状分离的现象。
国内外有关苏丹草的育种研究主要集中在属内种
间的远缘杂交上，以苏丹草与栽培高粱、甜高粱杂
交研究最多，尚未见诱导苏丹草与拟高粱杂交种
异源多倍体及其特性分析的报道［14-16］。
多倍体育种中根尖染色体计数是最常用的倍性
鉴定方法，但此方法对操作技术要求极高，不适用于
大量材料的快速鉴定，只能对有限的少数细胞进行
观察分析，在鉴定嵌合体上有一定的局限性，对于染
色体条数较多、染色体较小的物种在计数时也容易
产生误差［17-18］。而近几十年流式细胞术逐渐开始
应用到植物倍性鉴定上，其测量速度快，可信度高，
不受取材限制，对比 G1 期峰值的荧光道数便可知
染色体是否加倍，还可灵敏地检测出嵌合体并计算
不同倍性细胞所占比例［19-20］。
本试验以苏丹草 2098 与拟高粱远缘杂交种 F1
为对照，秋水仙素处理苏丹草与拟高粱杂交种 F1胚
性愈伤组织获得的再生植株 SS2010-1 为材料，通过
苗期植株形态学特征观察，结合流式细胞术和根尖
染色体计数对再生植株进行倍性鉴定，并对其叶片
表皮气孔器特性进行分析，试图明确苏丹草与拟高
粱杂交种新材料 SS2010-1 的倍性及其表皮气孔器
的特异性，为苏丹草倍性育种早期辅助选择和新品
种选育提供依据。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
本试验所用材料均由江苏省农业科学院畜牧
研究所提供。苏丹草与拟高粱杂交种(对照) :苏
丹草 2098(母本)与拟高粱(父本)杂交产生的二
倍体 F1代;新材料 SS2010-1:以苏丹草与拟高粱杂
交种幼穗离体培养获得的胚性愈伤为外植体，继
代培养时经 2 500 mg /L秋水仙碱处理 3 d 获得的
再生植株。试验在江苏省农业科学院畜牧研究所
温室中进行。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 苗期植株形态学特征观察 2011 年 10 月
25 日将供试材料的茎秆扦插于温室的花盆(口径
34. 0 cm，高 24. 5 cm)中，统一水肥管理。分别选取
2 种材料生长正常的植株各 12 株，于同年 12 月 23
日测量株高、主茎倒数第 3 张完全展开叶的长度和
宽度。
1． 2． 2 根尖细胞染色体观察 2 种供试材料各
12 株，于 2011 年 12 月 25 日放入 1 /2 Hoagland 营
养液中培养，生新根后进行根尖细胞染色体计数，
每株材料至少取 4 个根尖。根尖细胞染色体的制
片方法参照李懋学等［21］所述去壁火焰低渗干燥
法，并根据试验材料特点稍作改良，具体步骤如
下:选取长度为0． 5 ～ 2. 5 cm 的根，并切下约 0. 5
cm的根尖，放入1∶ 1(体积比)的 0. 20%秋水仙碱
和 8-羟基喹啉混合液中预处理2． 0 ～ 2. 5 h，然后在
0. 075 mol /L KCl溶液中处理 20 min，再用卡诺氏
固定液(乙醇∶ 冰醋酸 = 3∶ 1)4 ℃固定 24 h，用
蒸馏水漂洗 2 ～ 3 次后放入 1 mol /L HCl 中 60 ℃
解离3 ～ 5 min，蒸馏水清洗 2 ～ 3 次，用 2. 00%纤
维素酶 35 ℃酶解 45 ～ 60 min，蒸馏水清洗 2 ～ 3
次后再在蒸馏水中浸泡 10 min，最后用卡诺氏固
7831崔莉莉等:秋水仙碱诱导的苏丹草与拟高粱杂交种新材料倍性鉴定
定液固定 10 min，卡宝品红染液染色 1 h，压片法
制片镜检。
1． 2． 3 流式细胞仪检测 2 种供试材料各 12 株，
于 2012 年 1 月 5 日每株分别称取幼嫩叶片约 100
mg制备各株的细胞核悬液。制备方法参照 Jaroslav
等［22］的方法，用 Otto提取液分 2 步制取:第 1 步，将
幼嫩叶片放入加有 1. 5 ml OttoⅠ提取液［0. 100
mol /L柠檬酸，0. 50% (体积比)Tween 20，用 0. 22
μm的滤器过滤后 4 ℃保存］的塑料培养皿(培养皿
置于冰袋上)中，用锋利的双面剃须刀片快速切碎，
将混合液吸打2 ～ 3 次后，经 400 目尼龙网过滤，滤
液收集至 1. 5 ml离心管中，4 ℃、5 000 r /min 离心 3
min。弃上清液，加入 200 μl 新鲜 OttoⅠ提取液，轻
轻振荡使细胞重新悬浮。第 2 步，吸取 200 μl 细胞
悬浮液，加入到 1. 0 ml OttoⅡ缓冲液(0. 400 mol /L
Na2HPO4·12H2O，用 0. 22 μm 的滤器过滤后室温
保存)中，混匀，再加入 67 μl Rnase(Sigma-Aldrich
Company，USA)和 67 μl DNA 荧光染料碘化丙锭
(PI， propidium iodide; Sigma-Aldrich company，
USA) ，最后将细胞核悬液转入标准上样管中，上机
测定。
采用美国 BD公司(Becton dickinson and compa-
ny，Franklin Lakes，NJ USA)的 FACSCalibur流式细
胞仪进行倍性测定，使用随机软件 Cellquest Pro 获
取数据，每个样品测定20 000个细胞(颗粒) ，采用
FlowJo 7． 5 软件做细胞周期分析。
1． 2． 4 叶片表皮气孔器特征观察 2 种供试材料
各 12 株，在 2012 年 2 月 4 日分别取每株的主茎第
一片完全展开叶中间部位长 1 cm、宽为叶片自然宽
度的部分各一片。去掉叶缘，FAA 固定液(福尔马
林∶ 冰醋酸∶ 70%酒精 = 1∶ 1∶ 18)固定，抽气后
采用离析法［23］处理，浸泡在体积比为1∶ 1 的 30%
过氧化氢-醋酸混合液中，60 ℃水浴 24 h，待叶肉组
织和表皮细胞分离后，取出材料，放入装有适量蒸馏
水的培养皿中，用镊子撕取表皮，1% 番红染色 1
min，制成临时装片，在 OLYMPUS CX31 光学显微镜
下观察和拍照。
在 10 倍的物镜下，每种供试材料选择 60 个清
晰视野拍照，计数气孔器数目，测量视野中表皮面
积，计算气孔器密度。在 40 倍物镜下，每种供试
材料选取 60 个清晰视野，测量气孔器长度和宽度
及保卫细胞宽度。由于测量时气孔均是关闭状
态，故气孔器长度是指气孔关闭状态下保卫细胞
的长度，气孔器宽度是气孔关闭状态下垂直于保
卫细胞的最宽值［24］，保卫细胞宽度是气孔关闭状
态下两保卫细胞中部的宽度值。采用形态学(荧
光)图像分析系统 1． 0 软件(JD801，江苏捷达软件
工程有限公司，南京)测量气孔器长和宽及表皮面
积，并用 SPSS16． 0 软件进行方差分析。
2 结 果
2． 1 再生植株 SS2010-1 苗期形态学特征分析
与对照苗期植株相比，秋水仙碱处理获得的再
生植株 SS2010-1 的苗期株高增加了 63. 55%(P ＜
0. 05) ，叶片长度增加了 56. 42%(P ＜ 0. 05) ，叶片宽
度未增加(P ＞ 0. 05) (表 1)。
表 1 苏丹草与拟高粱杂交种秋水仙碱处理新材料 SS2010-1 的苗期
形态学特征
Table 1 Seedling morphological characteristics of hybrid of Sor-
ghum sudanense(Piper)Stapf． × S． propinquum(Kunth)
Hitchc． treated with colchincine
供试材料
株高
(cm)
叶长
(cm)
叶宽
(cm)
苏丹草与拟高粱杂交种
F1 代(对照)
43． 43b 32． 38b 1． 48a
苏丹草与拟高粱杂交种
新材料 SS2010-1
71． 03a 50． 65a 1． 58a
同列数据后不同小写字母表示差异达 0． 05 显著水平。
2． 2 再生植株 SS2010-1 倍性鉴定
根尖细胞染色体计数结果显示，苏丹草与拟高
粱远缘杂交种 F1代(对照)植株根尖细胞染色体数
为 2n = 20，秋水仙素诱导的苏丹草与拟高粱杂交种
再生植株 SS2010-1 的根尖染色体数为 2n = 40(图
1)。以二倍体苏丹草与拟高粱杂交种 F1代植株为
对照，调整仪器阈值使对照有丝分裂间期的 G1 期
峰值所在的荧光道数为 200 道左右(图 2) ，检测对
照和 SS2010-1 植株细胞核的相对 DNA 含量。结果
(图 2)显示，对照植株的 G1 期峰值位于 200 道附
近，G2 期峰值位于 400 道附近;SS2010-1 植株的 G1
期峰值位于 400 道附近，G2 期峰值位于 800 道附
近，由此可见，SS2010-1 细胞核 DNA 含量是对照的
2 倍。以上结果均表明秋水仙碱诱导的苏丹草与拟
高粱杂交种再生植株 SS2010-1 为染色体加倍的四
倍体新材料。
8831 江 苏 农 业 学 报 2012 年 第 28 卷 第 6 期
A:苏丹草与拟高粱杂交种 F1 代(对照) ;B:秋水仙碱诱导的苏丹草与拟高粱杂交种新材料 SS2010-1。
图 1 秋水仙碱诱导的苏丹草与拟高粱杂交种新材料 SS2010-1 根尖染色体数目
Fig． 1 Chromosome numbers of root tips in the hybrid of Sorghum sudanense(Piper)Stapf． × S． propinquum(Kunth)Hitchc． treated with
colchicine
A:苏丹草与拟高粱杂交种 F1 代(对照) ;B:秋水仙碱诱导的苏丹草与拟高粱杂交种新材料 SS2010-1。
图 2 苏丹草与拟高粱杂交种新材料 SS2010-1 和对照叶片相对 DNA含量分布曲线图
Fig． 2 Relative DNA content of new material SS2010-1 regenerated from the hybrid of Sorghum sudanense(Piper)Stapf． × S． propinquum
(Kunth)Hitchc．
2． 3 再生植株 SS2010-1 叶片表皮气孔器特征分析
秋水仙碱诱导的苏丹草与拟高粱杂交种新材料
SS2010-1 与苏丹草与拟高粱杂交种 F1 代(对照)叶
片上、下表皮均有气孔器分布，气孔器的组成相同，
均由哑铃形保卫细胞和它们之间的孔口以及圆顶形
副卫细胞组成;上表皮气孔器长度、宽度和密度及保
卫细胞宽度均小于下表皮(图 3)。与对照相比，
SS2010-1 气孔器形态发生了明显变异，气孔器长度
和宽度显著增加，而 1 mm2 气孔器数量显著减少，
上表皮保卫细胞宽度显著增加，下表皮保卫细胞宽
度略微增宽。SS2010-1 上表皮气孔器长度和宽度
比对照分别增加 29. 33% (P ＜ 0. 05)和 15. 99%
(P ＜ 0. 05) ，下表皮气孔器长度和宽度比对照分别
增加 23. 24% (P ＜ 0. 05)和 26. 19% (P ＜ 0. 05) ;
SS2010-1 上表皮保卫细胞宽度比对照增加 18. 66%
(P ＜ 0. 05) ，下表皮保卫细胞宽度比对照增加
3. 74%(P ＞ 0. 05) ;SS2010-1 上表皮和下表皮 1
mm2 气孔器数量比对照分别减少 64. 39% (P ＜
0. 05)和 39. 09%(P ＜ 0. 05) (表 2)。
3 讨 论
多倍体的染色体加倍导致基因剂量增加，细胞
变大从而使植株表型呈现巨大化特点。本研究结果
显示，秋水仙素处理苏丹草与拟高粱杂交种 F1代愈
伤组织获得的再生植株 SS2010-1 与 F1代(对照)相
比在苗期表现出巨大化的特点，新材料的株高、叶长
和叶宽均比对照增加，经过进一步鉴定为苏丹草与
拟高粱远缘杂交种四倍体新材料，表明秋水仙碱诱
导的苏丹草与拟高粱杂交种 F1代愈伤组织获得的
再生植株 SS2010-1 的形态特征在苗期受到基因剂
量效应影响显著。但多倍体变异分子机制十分复
杂，异源多倍体中不仅基因剂量加倍，还存在不同基
9831崔莉莉等:秋水仙碱诱导的苏丹草与拟高粱杂交种新材料倍性鉴定
因组间的相互作用、DNA甲基化、甲基化不足、转座
子激活等表观遗传学变化，且植物基因表达有一定
的时空特异性［25］。
A、C:苏丹草与拟高粱杂交种 F1 代(对照)叶片上、下表皮;B、D:秋水仙碱诱导的苏丹草与拟高粱杂交种新材料 SS2010-1 叶片上、下表皮;
单箭头:气孔器。
图 3 秋水仙碱诱导的苏丹草与拟高粱杂交种新材料 SS2010-1 的叶片表皮气孔器特征
Fig． 3 The leaf stomatal morphological characteristics of SS2010-1
表 2 秋水仙碱诱导的苏丹草与拟高粱杂交种新材料 SS2010-1 叶片表皮气孔器特征
Table 2 Comparison of leaf stomatal morphological characteristics of SS2010-1
供试材料
气孔器长度
(μm)
上表皮 下表皮
气孔器宽度
(μm)
上表皮 下表皮
保卫细胞
宽度(μm)
上表皮 下表皮
1 mm2 气孔器数量
(个)
上表皮 下表皮
苏丹草与拟高粱杂交种
F1 代(对照)
23． 11b 28． 36b 15． 38b 16． 19b 5． 09b 5． 87a 126． 57b 161． 46a
秋水仙碱诱导的苏丹草与拟高粱
杂交种新材料 SS2010-1
29． 89a 34． 95a 17． 84a 20． 43a 6． 04a 6． 09a 45． 07a 98． 34b
同列数据后不同小写字母表示差异达 0． 05 显著水平。
成熟叶片的气孔具有形态稳定性和遗传稳定
性，其大小和密度在许多种植物中都作为倍性鉴定
的依据。Hodgson等提出在被子植物相当大范围的
分类单元里气孔的大小与基因组大小呈正相关关
系［26］。Beaulieu等指出基因组大小的改变会引起
气孔大小和密度的改变［27］。本试验结果也验证了
这一点:与对照相比四倍体新材料 SS2010-1 气孔器
长度和宽度及保卫细胞宽度均增加，1 mm2 气孔器
数量显著减少，可见 1 mm2 叶片气孔器数量跟苏丹
草与拟高粱杂交种倍性呈负相关，叶片气孔器大小、
保卫细胞宽度跟苏丹草与拟高粱杂交种倍性呈正相
关，这与 Campos 等［28］在六倍体与三倍体狼尾草的
气孔器大小和密度的对比中得到的结果一致，Xu
等［29］也在二倍体和四倍体灯芯草气孔器参数的比
较中发现了同样的规律。可见在苏丹草与拟高粱杂
交种多倍体鉴定中，气孔器特性可以作为多倍体早
期筛选的可靠指标之一。
气孔是植物体与外界环境交换(主要是二氧化
碳和水分)的重要通道，与植物的光合能力、水分利
用以及抗逆性密切相关。气孔密度与气孔器大小变
化对植物生理过程必定产生重要影响，但具体趋势
各个学者的研究结果不一:魏爱丽等［30］指出具有较
0931 江 苏 农 业 学 报 2012 年 第 28 卷 第 6 期
低气孔频度的八倍体小偃麦的水分利用效率高于普
通小麦，而 Hetherington 等［31］指出小气孔往往对周
围环境的水分胁迫有着更快的响应，同时高气孔密
度又能增加二氧化碳吸收而增加光合作用，反之植
物体的生理过程则可能会在水分胁迫与高温度的环
境条件下受到限制。秋水仙碱诱导的苏丹草与拟高
粱杂交种四倍体新材料 SS2010-1 1 mm2 气孔器数
量和气孔器大小的变化对其生理过程有何种影响，
还需进一步深入研究。
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( 责任编辑:袁 伟)
1931崔莉莉等:秋水仙碱诱导的苏丹草与拟高粱杂交种新材料倍性鉴定